Caratterizzazione dei modulatori dei recettori attivati dalla proteasi con un saggio di mobilizzazione del calcio utilizzando un lettore di piastre

Riepilogo

È stato sviluppato un protocollo migliorato per un saggio di mobilizzazione del calcio con cellule endoteliali, utilizzato per identificare ligandi di recettori attivati dalla proteasi (PAR). Il nuovo protocollo riduce il tempo totale di analisi di 90-120 minuti e produce curve concentrazione-risposta riproducibili.

Abstract

Le variazioni della concentrazione di calcio nelle cellule vengono monitorate rapidamente e ad alto rendimento con l'uso di coloranti intracellulari, fluorescenti, leganti il calcio e strumenti di imaging in grado di misurare le emissioni fluorescenti da un massimo di 1.536 pozzetti contemporaneamente. Tuttavia, questi strumenti sono molto più costosi e possono essere difficili da mantenere rispetto ai lettori di piastre ampiamente disponibili che scansionano i pozzetti singolarmente. Di seguito viene descritto un saggio ottimizzato per l'uso con una linea cellulare endoteliale (EA.hy926) per misurare l'attivazione della segnalazione G_αq guidata dal recettore attivato dalla proteasi (PAR) e la successiva mobilizzazione del calcio utilizzando il colorante legante il calcio Fluo-4. Questo test è stato utilizzato per caratterizzare una serie di ligandi PAR, inclusi i ligandi allosterici anti-infiammatori "parmodulina" mirati a PAR1 identificati nel laboratorio di Dockendorff. Questo protocollo ovvia alla necessità di un gestore automatizzato di liquidi e consente lo screening a media produttività di ligandi PAR in piastre a 96 pozzetti e dovrebbe essere applicabile allo studio di altri recettori che avviano la mobilizzazione del calcio.

Introduzione

I recettori attivati dalla proteasi (PAR)^1,2,3 sono una sottofamiglia di recettori accoppiati a proteine G di classe A (GPCR) espressi in una varietà di tipi di cellule, tra cui piastrine e cellule endoteliali ^4,5,6,7. A differenza della maggior parte dei GPCR, i PAR hanno una modalità di attivazione intramolecolare unica. La maggior parte dei GPCR sono attivati da ligandi solubili che interagiscono con una tasca di....

Protocollo

Tutti gli scambi/aggiunte di terreni effettuati nelle fasi 1 e 2 del seguente protocollo vengono eseguiti in una cappa sterile. Salvo diversa indicazione, tutti gli articoli in plastica utilizzati nella cappa sterile devono essere acquistati sterilizzati e sigillati o sterilizzati in modo appropriato tramite autoclave.

1. Avvio della linea cellulare EA.hy926

1. Acquisisci le celle EA.hy926.
2. Conservare il flaconcino o i flaconcini di cellule in fase vapore di un serbatoio di azoto liquido.
3. Preparare il terreno completo di DMEM riscaldando prima DMEM, FBS e penna/st....

Discussione

Mentre il protocollo⁷² precedentemente riportato era generalmente affidabile e ci ha permesso di identificare una nuova parmodulina di piombo, NRD-21,62 era un protocollo più efficiente. Il test è stato ulteriormente compromesso durante la carenza di approvvigionamento causata dalla pandemia di COVID-19. L'acquisizione di punte per il manipolatore automatico di liquidi è diventata difficile e il tentativo di lavare, sterilizzare e riutil.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cells	ATCC	CRL-2922
CellStripper cell dissociation reagent	Corning	25-056-CI	Trypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol red	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	97068-091
Gelatin from porcine skin	MilliporeSigma	G2500	Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)	Corning	30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)	Corning	25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Thermo	172571000
Bovine serum albumin (BSA)	Avantor	97061-420
Calcium chloride dihydrate	Thermo	42352-0250
Dimethyl sulfoxide	Thermo	J66650-AD
Fluo-4/AM	Invitrogen	F14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)	Corning	21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrate	MilliporeSigma	M2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)	Spectrum Chemical	P1166
Probenecid	TCI America	P1975
Sodium hydroxide	VWR International	BDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)			Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plate	Corning	3603	with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mL	Avantor	89039-664
Centrifuge tube, 50 mL	Avantor	89039-656
Culture flask, T-75	Corning	353136	tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mL	Corning	RES-V-50-S
Enspire plate reader	Perkin Elmer		Discontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mL	Avantor	20170-038
Pasteur pipette, 9"	Fisher	13-678-6B	must be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap strips	Avantor	76318-802
Pipette tips, 20 µL	Biotix	63300042	sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µL	Biotix	63300044	sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µL	Biotix	63300047	sterile, filtered tips
Prism	GraphPad		volume 6 used
Serological pipette, 5 mL	Tradewinds Direct	07-5005
Serological pipette, 10 mL	Tradewinds Direct	07-5010
Serological pipette, 25 mL	Tradewinds Direct	07-5025