Produzione di lotti vettoriali adeno-associati ad alto rendimento utilizzando celle di sospensione HEK293

Riepilogo

Qui, viene presentato un protocollo di produzione AAV basato su celle HEK293 in sospensione, con conseguente riduzione del tempo e della manodopera necessari per la produzione di vettori utilizzando componenti disponibili per scopi di ricerca da fornitori commerciali.

Abstract

I vettori virali adeno-associati (AAV) sono uno strumento straordinario per lo studio del sistema nervoso centrale (SNC). Capsidi innovativi, come l'AAV. PHP.eB, dimostrano un'ampia trasduzione del SNC mediante iniezione endovenosa nei topi. Per ottenere una trasduzione comparabile, è necessario un titolo 100 volte superiore (almeno 1 x 10¹¹ copie del genoma/topo) rispetto all'iniezione diretta nel parenchima del SNC. Nel nostro gruppo, la produzione di AAV, tra cui AAV. PHP.eB si basa su cellule HEK293T aderenti e sul metodo della tripla trasfezione. Ottenere rese elevate di AAV con cellule aderenti comporta un processo ad alta intensità di manodopera e materiale. Questo vincolo ha portato allo sviluppo di un protocollo per la coltura cellulare in sospensione in provette coniche. Gli AAV generati nelle cellule aderenti sono stati confrontati con il metodo di produzione della sospensione. Sono state confrontate colture in sospensione utilizzando reagenti di trasfezione polietilenimmina o TransIt. I vettori AAV sono stati purificati mediante ultracentrifugazione a gradiente di iodixanolo seguita da scambio di tamponi e concentrazione utilizzando un filtro centrifugo. Con il metodo aderente, abbiamo ottenuto una media di 2,6 x 10¹² copie del genoma (GC) totali, mentre il metodo della sospensione e la polietilenimmina hanno prodotto 7,7 x 10¹² GC in totale e TransIt ha prodotto 2,4 x 10¹³ GC in totale. Non vi è alcuna differenza nell'efficienza di trasduzione in vivo tra i vettori prodotti con aderente rispetto al sistema di celle in sospensione. In sintesi, viene introdotto un protocollo di produzione AAV basato su celle HEK293 in sospensione, che consente di ridurre il tempo e la manodopera necessari per la produzione di vettori e di ottenere rendimenti da 3 a 9 volte superiori utilizzando componenti disponibili presso i fornitori commerciali per scopi di ricerca.

Introduzione

Il virus adeno-associato (AAV) è stato scoperto nel 1965 e da allora è stato utilizzato in una miriade di applicazioni¹. Gli AAV sono stati applicati nella ricerca neuroscientifica per studiare la funzione genica e neuronale, mappare i neurocircuiti o produrre modelli animali per la malattia². Tradizionalmente, questo viene fatto iniettando direttamente nel sito di interesse, poiché la maggior parte dei sierotipi naturali non attraversa la barriera emato-encefalica o ha bisogno di una dose elevata per farlo ^1,2,3.

Con la scoperta dell'AAV. PHP.B⁴ e capsidi di nuova generazione come AAV. PHP.eB⁵ e AAV. CAP-B10⁶, è possibile colpire il sistema nervoso centrale (SNC) utilizzando una semplice iniezione sistemica. La mappatura spaziale rivela le cellule bersaglio dell'AAV. PHP.eB a livello cellulare ^6,7. In combinazione con specifici promotori/potenziatori, questi capsidi offrono ampie opportunità ai neuroscienziati di studiare i geni e la funzione cerebrale mediante somministrazione non invasiva di AAV ^4,8.

Mentre per l'AAV è necessaria una dose più bassa. PHP.eB (tipicamente da 1 a 5 x 10¹¹ copie del genoma (GC)/topo) rispetto ad AAV9 (4 x 10¹² GC/topo)⁷, è ancora necessario produrre più vettori rispetto alle strategie di iniezione diretta (tipicamente 1 x 10⁹ GC/μL di iniezione). La maggior parte dei sierotipi naturali può essere prodotta utilizzando il classico sistema di coltura cellulare aderente in combinazione con la purificazione con iodixanolo 9,10,11,12. Per AAV. PHP.eB questo comporta un processo laborioso per la coltura e la trasfettazione delle cellule per ottenere vettori sufficienti per un esperimento⁸. Pertanto, è stata sviluppata la produzione di AAV in colture cellulari in sospensione in provette coniche. Le provette coniche, con una capacità fino a 300 ml, sono compatte, risparmiando spazio nell'incubatore e plastica. Le cellule in sospensione sono molto più facili da coltivare e maneggiare in grandi quantità rispetto alle cellule aderenti su piastre da 15 cm. I componenti di trasfezione del protocollo rimangono gli stessi. Pertanto, i plasmidi precedentemente utilizzati con il sistema aderente possono essere facilmente utilizzati in questo protocollo basato sulla produzione in cellule in sospensione. Il protocollo è stato trasferito con successo ad altri ricercatori in laboratorio e utilizzato con successo per vari capsidi e costrutti.

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Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Accademia Reale Olandese delle Scienze (KNAW) ed erano conformi alla legge olandese sulla sperimentazione animale con il numero di progetto AVD8010020199126. Nella Figura 1 viene fornita una panoramica schematica del protocollo completo. Dalla semina delle cellule alla purificazione dell'AAV, il protocollo richiede 6 giorni per essere completato.

1. Preparazione dei reagenti

1. Purificazione dei plasmidi
   1. Eseguire l'estrazione dei plasmidi come descritto dal produttore con alcune regolazioni per garantire la sterilità dei plasmidi.
   2. Preparare l'etanolo al 70% utilizzando acqua distillata sterile ed etanolo assoluto.
   3. Dopo la fase di centrifugazione dell'isopropanolo, essiccare i plasmidi nella cappa dell'armadio di flusso e aggiungere etanolo sterile al 70% alle provette. Dopo la precipitazione dell'etanolo, asciugare i plasmidi nella cappa dell'armadio di flusso e risospendere il plasmide in acqua distillata sterile. Fare attenzione a utilizzare provette per microcentrifuga sterilizzate.
   4. Prelevare un'aliquota per la quantificazione, l'analisi delle restrizioni e, se necessario, il sequenziamento. Si consiglia di verificare l'integrità delle ripetizioni terminali invertite (ITR) poiché le mutazioni possono avere un impatto negativo sulla resa. Regolare la concentrazione del campione a 1 μg/μL.
2. Preparazione di 10x tampone di lisi Tween
   1. Sciogliere 30,3 g di tampone Tris e 2,033 g di MgCl_{2,6H 2}O in 400 mL di acqua distillata sterile, impostare il pH a 8,0 e aumentare il volume totale a 450 mL.
   2. Mantenere Tween 20 sterile, aggiungere 50 mL di Tween 20 alla soluzione tampone nella cappa e sterilizzare con filtro utilizzando un filtro sottovuoto da 0,2 μM.
3. Diluizioni di iodixanolo
   1. La soluzione di iodixanolo viene fornita al 60% di concentrazione. Usa la soluzione di partenza per creare soluzioni al 15%, 25% e 40%.
   2. Per una soluzione al 15%, diluire 60 mL di soluzione al 60% con 48 mL di NaCl 5 M e 48 mL di PBS-MK (5x PBS con 5 mM di MgCl₂ e 12,5 mM di KCl) e aggiungere acqua distillata fino a 240 mL.
   3. Per una soluzione al 25%, diluire 67 mL di soluzione al 60% e 32 mL di PBS-MK. Aggiungere acqua distillata fino a 160 ml. Mescolare bene e aggiungere 1,6 mL di soluzione di rosso fenolo.
   4. Per una soluzione al 40%, diluire 160 mL di soluzione al 60% con 48 mL di PBS-MK e aggiungere acqua distillata fino a 240 mL. Per una soluzione al 60%, aggiungere 1 mL di rosso fenolo a 100 mL di soluzione al 60%.
4. PBS 5% soluzione di saccarosio
   1. Aggiungere 25 g di saccarosio a un flacone da 500 ml di DPBS senza calcio o magnesio. Agitare bene e filtrare con un filtro sottovuoto per bottiglie da 0,2 μM.
5. Soluzione di polietilenglicole (PEG) 8000
   1. Sciogliere 400 g di PEG 8000 e 24 g di NaCl in acqua distillata sterile e portare a un volume finale di 1000 mL. Mescolare riscaldando fino a completo scioglimento. Regolare il pH a 7,4 utilizzando la carta per pH.
   2. Filtrare con un filtro sottovuoto per bottiglie da 0,2 μM per ottenere una soluzione di PEG 8000 al 40%. Si noti che la filtrazione richiederà un po' di tempo a causa della viscosità della soluzione immagazzinata a 4 °C.

2. Coltura di cellule in sospensione HEK293

1. Utilizzare salviette imbevute di etanolo al 70% per la pulizia. Pulisci la cappa di biosicurezza, prepara e pulisci tutti i materiali necessari per la coltura delle cellule.
2. Preriscaldare 30 mL di terreno cellulare in sospensione a 37 °C in una provetta di coltura conica da 50 mL. Recupera le cellule di produzione virale dall'azoto liquido. Scongelare rapidamente le cellule in un bagno d'acqua a 37 °C. Poco prima che il flaconcino sia completamente scongelato, pulirlo con una salvietta imbevuta di etanolo al 70% e trasferire il flaconcino nella cappa di biosicurezza.
   NOTA: I dettagli delle cellule di produzione virale qui utilizzate sono forniti nella Tabella dei materiali.
3. Trasferisci rapidamente le cellule nella provetta di coltura conica da 50 mL preriscaldata. Cellule di coltura in un incubatore con agitazione a 37 °C, 80% di umidità, 8% di CO₂, 200 giri al minuto (RPM) e un diametro di agitazione di 50 mm. Cellule di passaggio, una volta che la vitalità è superiore al 90% e la densità cellulare è superiore a 1-3 x 10⁶ cellule/mL.
   NOTA: L'incubatrice utilizzata ha un diametro di scuotimento di 50 mm; Le condizioni di coltura devono essere regolate per un diverso diametro di agitazione.
4. Cellule di passaggio 3-4 giorni dopo lo scongelamento. Controllare la/e provetta/e di coltura per assicurarsi che non vi siano segni di contaminazione; Ad esempio, il fungo apparirà come un anello scolorito (nero o verde).
5. Preparare 400 μL di soluzione di tripano blu allo 0,4% per campione utilizzando uno stripette da 1 mL.
6. Recupera rapidamente le cellule in sospensione dall'incubatrice. Estrarre immediatamente 500 μL dalla provetta utilizzando una striscia da 1 mL. Pipegare delicatamente su e giù.
7. Aggiungere 100 μL di sospensione cellulare alla provetta blu di tripano preparata. Capovolgere delicatamente il tubo per mescolare; Non pipettare per mescolare, poiché ciò porterebbe alla morte cellulare. Rimettere le cellule nell'incubatrice.
8. Prelevare 50 μL di sospensione cellulare trattata con blu di tripano e applicarla sul vetrino dell'emocitometro. Contare il totale delle cellule vitali e calcolare la quantità di sospensione cellulare e di terreno necessari per il passaggio o la trasfezione il giorno successivo.
9. Caldo medio nell'incubatrice per 10-15 min. Aggiungere la sospensione cellulare al terreno riscaldato e rimettere nell'incubatrice. Per il passaggio di cellule per 3 giorni (cioè lunedì-giovedì), impostare su 0,5 x 10⁶ cellule/mL; per il passaggio delle cellule per 4 giorni (cioè giovedì-lunedì), impostare su 0,3 x 10⁶ cellule/mL.
   NOTA: Secondo il produttore, le cellule di produzione virale raddoppiano ogni 26 ore e dovrebbero essere comprese tra 3,5 x 10⁶ e 5,5 x 10⁶ prima del passaggio. Le celle possono essere conservate fino al passaggio 20.

3. Trasfezione

1. Giorno 1
   1. A 24 ore prima della trasfezione, coltivare 1 x 10⁶ cellule per mL in 300 mL di terreno.
2. Giorno 2
   1. Terreno caldo, plasmidi e reagente di trasfezione a temperatura ambiente. Per gli importi da preparare, si veda la tabella 1.
   2. Brevemente plasmidi e reagenti a vortice. Aggiungere plasmidi al mezzo preparato, vortice. Aggiungere brevemente il reagente di trasfezione e il vortice. Non agitare la miscela dopo questo passaggio. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
   3. Nel frattempo, conta le cellule preparate il giorno 1. Le cellule devono essere comprese tra 2 e 2,5 x 10⁶ cellule per mL e > vitali al 95%.
   4. Dopo l'incubazione, goccia a goccia, aggiungere la miscela di trasfezione alle cellule facendo roteare delicatamente la provetta. Incubare per 72-96 ore.

4. Raccolta delle cellule

1. Giorno 5
   1. Aggiungere 33 mL di tampone di lisi cellulare 10x (500 mM Tris pH 8, 10% Tween 20, 20 mM MgCl₂), mescolare agitando delicatamente e incubare a 37 °C per 1,5 h con agitazione.
   2. Centrifugare a 3428 x g a 4 °C per 60 min. Filtrare attraverso un filtro sottovuoto PES da 0,45 μM per chiarificare il lisato cellulare, lasciando il lisato chiarificato nel contenitore del filtro.
      NOTA: Facoltativo dopo la filtrazione: prelevare 50 μL di campione per la PCR quantitativa (Q-PCR).
   3. Aggiungere 90 mL di soluzione di PEG 8000 al 40% a 360 mL di lisato cellulare filtrato.
   4. Pulire l'ancoretta con etanolo al 70% e aggiungerla al campione. Mescolare con ghiaccio o in cella frigorifera a 300 giri/min per 1 ora. Incubare a 4 °C senza agitare per tutta la notte.
      NOTA: Sono stati testati tempi di incubazione da 1 a 72 ore. Tempi di incubazione più lunghi hanno un effetto negativo sulla precipitazione complessiva delle proteine.

5. Purificazione dello iodixanolo

1. Giorno 6
   1. Trasferire l'intero campione di volume di coltura precipitato PEG in una provetta conica grande e pulita e centrifugare a 2820 x g e 4°C per 15 minuti.
   2. Scartare il surnatante e risospendere il pellet di PEG in 15 mL di DPBS con calcio e magnesio. Il pellet è difficile da risospendere; Prenditi il tempo necessario per farlo con attenzione.
   3. Trasferire la parte risospesa in una provetta pulita da 50 ml. Il PEG rimarrà sui lati del tubo del bioreattore. Aggiungere altri 10 ml, avendo cura di raccogliere tutto il precipitato di PEG. Trasferire il tutto in un contenitore da 50 ml per un volume totale di 25-30 ml.
   4. Aggiungere 40 μL di DNaseI (10 U/μL). Porre nell'incubatrice per 1 h a 37°C.
      NOTA: Facoltativo dopo l'incubazione della DNasi: prelevare 50 μL di campione per la Q-PCR.
   5. Pulire bene le barre di agitazione utilizzate per la precipitazione del PEG con una soluzione di cloruro seguita da etanolo al 70%. Lasciare le barrette in etanolo al 70% per il prossimo esperimento.
   6. Riempire una provetta di poliallomero di 25 mm x 89 mm utilizzando una pipetta Pasteur in vetro con 15,5 mL di lisato cellulare concentrato in ciascuna provetta. Dopo aver aggiunto il lisato cellulare, sostituire la pipetta Pasteur in vetro con una nuova.
   7. Aggiungere le soluzioni di iodixanolo dal 15% al 60%: infondere delicatamente 9 mL della soluzione di iodixanolo al 15% sotto il lisato cellulare. Successivamente, aggiungere 5 mL delle soluzioni di iodixanolo al 25% e al 40% e, infine, aggiungere 5 mL della soluzione di iodixanolo al 60%.
   8. Rabboccare il tubo utilizzando una siringa con DPBS +/+ per rimuovere la maggior parte delle bolle d'aria, facendo attenzione a non disturbare gli strati di iodixanolo. Sigillare il tubo utilizzando un copritubo elettrico.
   9. Centrifugare in un rotore non oscillante per 1 ora e 10 minuti a 490.000 x g a 16 °C in un'ultracentrifuga. Rimuovere dall'ultracentrifuga, assemblare le provette in una chiusura metallica e preparare le provette di raccolta. Aprire il rotore nella cappa in caso di fuoriuscite durante la centrifuga.
   10. Preparare una provetta da 50 mL (per scartare la provetta del rotore), una provetta da 15 mL (per raccogliere il virus), una siringa da 5 mL e un ago da 30G e 19G per gradiente.
   11. Praticare un foro nella parte superiore del tubo con un ago da 30 G. Lasci l'ago in posizione. Posizionare un ago da 19G sulla siringa.
   12. Forare con cautela il tubo appena sotto l'interfaccia 40%/60%, che può essere vista dall'indicatore rosso fenolo. Assicurati che lo smusso dell'ago sia rivolto verso lo strato del 40%.
   13. Rimuovere l'ago da 30 G dalla parte superiore del tubo utilizzando la mano non dominante. Con l'ago smussato verso l'alto, estrarre lentamente il virus/iodixanolo. L'obiettivo è quello di estrarre tra i 3 mL e i 4,5 mL. Circa a metà e ben oltre lo strato al 40%/trasparente, ruotare l'ago per lo smusso rivolto verso il basso e continuare a estrarre per evitare la raccolta dallo strato proteico.
   14. Preparare la provetta da 50 mL con la mano non dominante, estrarre con cautela l'ago mentre si posiziona la provetta nella provetta da 50 mL ed eliminarla. Diluire la sospensione di AAV/iodixanolo 5 volte in DPBS riempiendo fino a 15 mL.
   15. Trasferire in una provetta filtrante centrifuga e centrifugare a 3428 x g, 4 °C per 10 min. Scartare il flusso continuo; Rimuovere delicatamente il supporto del filtro e capovolgere il contenitore inferiore in una bottiglia di scarto. Aggiungere 15 mL di PBS-5% di saccarosio per filtrare e risospendere.
   16. Centrifugare a 3428 x g a 4 °C per 20 min. Ripetere lo scambio del buffer almeno 3 volte. Conservare il virus (~150-250 μL) a 4 °C (PHP. B per un massimo di 3 mesi) o aliquota in aliquote da 50 μL e conservare a -80 °C per lungo periodo.
       NOTA: PHP. Le varianti del capside B sono sensibili al gelo/scongelamento, quindi questo dovrebbe essere evitato.
   17. Eseguire la titolazione come descritto in un protocollo precedente¹⁰.

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Risultati

La maggior parte dei laboratori accademici utilizza cellule HEK293T aderenti per la produzione di AAV ^8,9. Mentre questo funziona relativamente bene quando sono necessarie piccole quantità di AAV per l'iniezione diretta, è necessario un titolo 100 volte superiore (almeno 1 x 10¹¹ GC/topo) per ottenere una trasduzione simile con capsidi sistemici come AAV. PHP.eB.

In questo protocollo, è stata stabilita la produzione di AA...

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Discussione

La somministrazione sistemica di AAV è un potente strumento per il trasferimento genico al sistema nervoso centrale; tuttavia, la produzione di AAV è un processo costoso e laborioso. Utilizzando le cellule in sospensione, la manodopera e la plastica sono ridotte rispetto alla coltura aderente di HEK293T su piastre da 15 cm² . Inoltre, i tubi conici qui implementati sono facili da maneggiare e massimizzano l'uso dello spazio del laboratorio. Il protocollo è stato messo a punto da due ricercatori e successiva...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk	Beckman Coulter	342414
Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000,	eppendorf	5920701002
Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml	Infors HT/ TPP	587633
Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets	eppendorf	5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes	eppendorf	5948000315
Distilled Water	Gibco	15230147
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DPBS, calcium, magnesium	Gibco	14040091
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2	Fisher	FB12566504
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45	Fisher	FB12566505
Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube	Infors HT/ TPP	31362
Holder for 600 ml cell culture tube	Infors HT/ TPP	66129
Incubator Minitron 50 mm	Infors HT	500043
LV-MAX Production Medium	Gibco	A3583401
N-Tray Universal	Infors HT/ TPP	31321
OptiPrep - Iodixanol	Serumwerk bernburg	1893
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Poly-sciences	24765-100
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	72420100
Poly(ethylene glycol) 8000	Sigma-Aldrich	89510
TransIT-VirusGEN	Mirus	Mir 6706
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	5250061
TubeSpin Bioreactors-50ml	TTP	87050
TubeSpin Bioreactors-600ml	TTP	87600
Viral Production Cells	Gibco	A35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000	Cytvia	28932363