Ibridazione in situ a fluorescenza infrarossa fototermica ottica (OPTIR-FISH)

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo che utilizza l'ibridazione in situ a fluorescenza fototermica ottica a infrarossi (OPTIR-FISH), nota anche come FISH fototermica nel medio infrarosso (MIP-FISH), per identificare le singole cellule e comprenderne il metabolismo. Questa metodologia può essere ampiamente applicata per diverse applicazioni, tra cui la mappatura del metabolismo cellulare con la risoluzione di una singola cellula.

Abstract

Comprendere le attività metaboliche delle singole cellule all'interno di comunità complesse è fondamentale per svelare il loro ruolo nelle malattie umane. Qui, presentiamo un protocollo completo per l'identificazione cellulare simultanea e l'analisi metabolica con la piattaforma OPTIR-FISH combinando sonde FISH marcate con rRNA e substrati marcati con isotopi. L'imaging a fluorescenza fornisce l'identificazione cellulare mediante il legame specifico di sonde FISH marcate con rRNA, mentre l'imaging OPTIR fornisce attività metaboliche all'interno di singole cellule mediante spostamento verso il rosso indotto da isotopi sugli spettri OPTIR. Utilizzando batteri coltivati con ¹³C-glucosio come banco di prova, il protocollo delinea la coltura microbica con marcatura isotopica, ibridazione in situ a fluorescenza (FISH), preparazione del campione, ottimizzazione della configurazione di imaging OPTIR-FISH e acquisizione dei dati. Dimostriamo anche come eseguire l'analisi delle immagini e interpretare i dati spettrali a livello di singola cella con un'elevata produttività. La natura standardizzata e dettagliata di questo protocollo faciliterà notevolmente la sua adozione da parte di ricercatori provenienti da diversi background e discipline all'interno dell'ampia comunità di ricerca sul metabolismo a singola cellula.

Introduzione

Il metabolismo cellulare è un pilastro fondamentale della biologia cellulare, che guida molti processi che determinano la salute, la funzione e l'interazione delle cellule con l'ambiente. L'analisi del metabolismo a livello di singola cellula, in particolare all'interno degli ambienti nativi, fornisce informazioni preziose per rivelare le attività eterogenee e complesse nei sistemi biologici¹. Ciò è particolarmente cruciale nello studio dei microrganismi, poiché molti microbi mostrano requisiti di crescita unici o dipendenze ambientali che sfidano i metodi di coltivazione tradizionali². ....

Protocollo

L'uso di campioni batterici in questo studio è conforme alle linee guida dell'Institutional Review Board (IRB) della Boston University e del National Institute of Health.

NOTA: Il flusso di lavoro generale seguito in questo protocollo è riassunto nella Figura 2.

1. Coltura batterica e marcatura isotopica (Figura 2A)

NOTA: L'esempio qui fornito è per l'etichettatura di una coltura batterica pura. Se si applica questo protocollo alle comunità polimicrobiche, il me....

Discussione

Qui, abbiamo descritto un protocollo dettagliato per l'applicazione della piattaforma OPTIR-FISH per l'identificazione simultanea di specie microbiche e la quantificazione delle attività metaboliche alla risoluzione di una singola cellula. Le fasi critiche includono la coltura con marcatura di isotopi stabili per lo studio di specifiche attività metaboliche e l'ibridazione in situ a fluorescenza per l'identificazione di specie microbiche bersaglio. L'imaging a fluorescenza mul.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% Ethanol	ThermoScientific	T032021000
Calcium Fluoride	Crystran	CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)	Cambridge Isotopic Laboratories	CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E9884-100G
formamide	ThermoScientific	17899
Luria-Bertani broth	Sigma-Aldrich	L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x	SIGMA	M6030-1KG
OPTIR instrument	Photothermal Spectroscopy Corp.	mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS	ThermoScientific	J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%	ThermoScientific	A11379.18
Trypic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G