Valutazione della rottura della barriera emato-encefalica in un modello murino di lesione cerebrale traumatica lieve

Riepilogo

È stato sviluppato un metodo per visualizzare lo stravaso di colorante dovuto alla rottura della barriera emato-encefalica (BEE) somministrando due coloranti fluorescenti ai topi in momenti diversi. L'uso del glicerolo come crioprotettore ha facilitato l'immunoistochimica sullo stesso campione.

Abstract

I coloranti fluorescenti vengono utilizzati per determinare l'entità dello stravaso del colorante che si verifica a causa della rottura della barriera emato-encefalica (BEE). La marcatura con questi coloranti è un processo complesso influenzato da diversi fattori, come la concentrazione di coloranti nel sangue, la permeabilità dei vasi cerebrali, la durata dello stravaso del colorante e la riduzione della concentrazione di colorante nel tessuto a causa della degradazione e della diffusione. In un modello di lesione cerebrale traumatica lieve, l'esposizione alle onde d'urto indotte da esplosioni (BSW) innesca la rottura della BBB entro una finestra temporale limitata. Per determinare la sequenza precisa della degradazione della BEE, il blu di Evans e l'isotiocianato-destrano di fluoresceina sono stati iniettati per via intravascolare e intracardica nei topi in vari punti temporali rispetto all'esposizione alla BSW. È stata quindi registrata la distribuzione della fluorescenza del colorante in fette di cervello. Le differenze nella distribuzione e nell'intensità tra i due coloranti hanno rivelato la sequenza spazio-temporale della degradazione della BBB. L'immunocolorazione delle fette cerebrali ha mostrato che le risposte astrocitiche e microgliali erano correlate con i siti di degradazione della BEE. Questo protocollo ha un ampio potenziale di applicazione in studi che coinvolgono diversi modelli di degradazione della BEE.

Introduzione

La rottura e la disfunzione della barriera emato-encefalica (BEE) sono causate da infiammazione sistemica, infezioni, malattie autoimmuni, lesioni e malattie neurodegenerative¹. Nella lesione cerebrale traumatica lieve (mTBI) derivante dall'esposizione a onde d'urto indotte da blasti (BSW), è stata osservata una correlazione significativa tra l'intensità delle BSW e la quantità di perdita di colorante fluorescente dovuta alla rottura della BBB ^2,3,4. Una caratteristica notevole della degradazione della BBB nell'mTBI è che inizia immediatamente o entro poche ore dall'esposizione ai BSW ed è solitamente un processo transitorio che dura circa una settimana prima che emergano disturbi neurologici cronici ritardati 3,5,6,7. Sebbene i dettagli rimangano poco chiari, la degradazione della BBB fa parte della cascata patologica di lunga durata e può anche fungere da fattore prognostico nel mTBI⁶. Pertanto, è importante comprendere le distribuzioni spaziali e temporali della degradazione della BBB nel cervello.

I coloranti fluorescenti vengono utilizzati per determinare l'entità della degradazione della BBB ^3,8. Poiché la concentrazione ematica dei coloranti e l'entità e l'entità della degradazione della BBB cambiano nel tempo, è necessaria cautela nell'interpretazione delle immagini di stravaso del colorante. Ad esempio, l'assenza di stravaso del colorante non indica necessariamente l'assenza di degradazione della BBB. Nessuna degradazione della BBB può essere rilevata prima o dopo un aumento della concentrazione ematica del colorante. Anche se il colorante si è accumulato con successo dove si è verificata la rottura della BBB, potrebbe essere andato perso nel tempo dopo che la rottura è cessata. In generale, le sostanze idrosolubili e biologicamente inerti vengono rapidamente escrete nelle urine⁹. Pertanto, per determinare se la degradazione della BBB si verifica in un momento specifico, i risultati più affidabili si ottengono quando un colorante fluorescente viene somministrato nel flusso sanguigno per un breve periodo immediatamente prima di fissare l'animale. In questo modo deve essere utilizzato l'isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano disponibile in commercio con un peso molecolare specifico.

Il blu di Evans è un colorante azoico blu ampiamente riconosciuto con una forte affinità per l'albumina sierica. Il colorante mostra una fluorescenza rossa quando eccitato dalla luce verde nei sistemi biologici². A causa della sua natura inerte, il complesso blu-albumina del siero di Evans rimane nel sangue fino a 2 ore, rendendolo un tracciante utile a 69 kDa per marcare regioni con una BBB compromessa per almeno questa durata^10,11. Pertanto, è importante considerare le potenziali incertezze che circondano la farmacocinetica e la tossicità di Evans blue⁹. Tuttavia, uno studio recente ha dimostrato che il blu di Evans continua ad accumularsi nelle aree in cui la BBB è assente o interrotta⁷. Questa funzione ha permesso a Evans Blue di registrare la cronologia della degradazione della BBB, mentre il destrano FITC è stato utilizzato per registrare la rottura della BBB in un momento specifico dopo l'esposizione alla BSW. Sebbene il blu di Evans possa essere somministrato per via endovenosa o intraperitoneale¹⁰, la somministrazione endovenosa è preferibile per gli esperimenti sensibili al tempo. Questo studio mirava a dimostrare l'uso del blu di Evans e del FITC-destrano per rilevare la distribuzione spazio-temporale della degradazione della BBB in seguito all'esposizione a BSW.

In secondo luogo, lo studio ha presentato una tecnica per congelare fette di cervello dopo aver osservato la fluorescenza della degradazione della BBB e aver preparato fette più sottili adatte alle procedure immunoistochimiche. L'uso del glicerolo come mezzo di montaggio e crioprotettore semplifica il processo di immunoistochimica. Confrontando le immagini della degradazione della BBB con quelle dell'immunoistochimica, la distribuzione spazio-temporale della degradazione della BBB può essere correlata con la risposta tissutale dello stesso campione.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida etiche per gli esperimenti sugli animali stabilite dal National Defense Medical College (Tokorozawa, Giappone). Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato per la ricerca sugli animali presso il National Defense Medical College (approvazione n. 23011-1). In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J di età pari o superiore a 8 settimane e del peso di 19-23 g. Come illustrato nella Figura 1, una singola iniezione di blu di Evans e la perfusione FITC-destrano sono state eseguite in vari punti temporali in relazione a una singola esposizione a BSW. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Anestesia

NOTA: Questo è un protocollo modificato che aumenta la quantità di medetomidina di 2,5 volte rispetto a quella originale¹². I dosaggi di medetomidina cloridrato, midazolam e butorfanolo erano rispettivamente di 0,75 mg/kg, 4 mg/kg e 5 mg/kg.

1. Preparare una miscela di medetomidina cloridrato (75 μg/mL), midazolam (400 μg/mL) e butorfanolo (500 μg/mL) in soluzione fisiologica.
2. Somministrare la miscela per via intraperitoneale per anestetizzare il topo (10 μL/g)¹³.
3. Dopo circa 5-10 minuti, verificare una sufficiente anestesia osservando l'assenza di riflessi di pizzicamento della coda e di ritiro del pedale.
4. Tenere il mouse al caldo fino a quando non si riprende dagli effetti dell'anestesia.

2. Esposizione BSW

NOTA: In questo studio è stato utilizzato un tubo d'urto interno¹⁴.

1. Anestetizzare il topo come descritto nel passaggio 1.
2. Posizionare il mouse a 5 cm di distanza dall'estremità di uscita del tubo dell'ammortizzatore, assicurandosi che l'asse del corpo sia parallelo ma non allineato con l'asse del tubo.
3. Eroga una singola esposizione BSW con una sovrapressione di picco di 25 kPa alla testa.
   NOTA: Tenere il mouse al caldo fino a quando non si riprende dagli effetti dell'anestesia. Monitorare regolarmente le condizioni del topo trattato. Se si osservano segni di angoscia, come difficoltà a nutrirsi o bere, curvatura o aspetto anormale prolungato senza segni di recupero, sopprimere il topo e terminare l'esperimento in anticipo. Evitare la somministrazione di analgesici, poiché potrebbero potenzialmente influenzare la risposta gliale.

3. Iniezione di blu di Evans nella vena caudale

NOTA: La soluzione blu di Evans deve essere somministrata per via endovenosa senza anestesia. In presenza di anestesia, il colorante spesso non penetra a sufficienza nel corpo, probabilmente a causa della diminuzione della pressione sanguigna e della temperatura corporea¹³. Il blu di Evans è stato somministrato alla dose di 100 mg/kg.

1. Preparare la soluzione di blu di Evans (4% p/v in soluzione fisiologica) in una microprovetta, quindi agitarla e conservarla al buio prima dell'uso.
2. Iniettare la soluzione nella vena caudale (2,5 μL/g)¹³.

4. Perfusione transcardica con soluzione di FITC-destrano e fissazione

1. Aggiungere eparina a soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per ottenere una concentrazione di 1 U/mL, quindi aggiungere FITC-destrano al PBS eparinizzato per ottenere una concentrazione di 3 mg/mL.
2. Sciogliere completamente la polvere di FITC-destrano prima dell'uso. Per fare ciò, agitare delicatamente la soluzione per 30 minuti o più. Prima dell'uso, controllare attentamente la presenza di polvere di destrano FITC non disciolta. Se ne rimane, continuare ad agitare fino a quando non si sarà completamente sciolto.
3. Anestetizzare il topo come descritto nel passaggio 1.
4. Procedere con il protocollo standard di fissazione della perfusione utilizzando una pompa peristaltica ^15,16. In primo luogo, perfondere con PBS eparinizzato contenente FITC-destrano per 2 minuti a una velocità di 4,0 ml/min. Quindi, perfondere con una soluzione tampone neutra di formalina al 10% o paraformaldeide-PBS al 4% per 2 minuti a una velocità di 4,0 mL/min, seguiti da 8 minuti a una velocità di 3,5 mL/min.
5. Rimuovere con cautela il cervello utilizzando forbici chirurgiche e pinzette ^15,16. Dopo la dissezione, post-fissare il cervello per una notte nello stesso fissativo (cioè soluzione tampone neutra di formalina al 10% o paraformaldeide-PBS al 4%) a 4 °C.
6. Il giorno successivo, sostituire il fissativo con PBS.

5. Elaborazione del tessuto cerebrale

NOTA: Anche se la fissazione della perfusione è completa, il blu di Evans e il FITC-destrano possono disperdersi nel tampone. Pertanto, le procedure che portano alla fase 6.8 devono essere completate entro una settimana dalla fissazione della perfusione. Inoltre, evitare di esporre il campione alla luce.

1. Preparare una piastra a 24 pozzetti con 500 μl di glicerolo al 20% in tampone fosfato (PB; pH 7,4) in ciascun pozzetto.
2. Usando un'affettatrice per cervelli, taglia il cervello coronalmente in 12 fette, ciascuna spessa 1 mm.
3. Trasferire ogni fetta nell'apposito pozzetto della piastra a 24 pozzetti e conservarla a 4 °C per almeno 2 ore.
4. Sostituire la soluzione con glicerolo-PB al 50% e conservarla a 4 °C per almeno 2 ore.
5. Infine, sostituire la soluzione con glicerolo al 100%. Per un'osservazione microscopica immediata, lasciare riposare le fette per almeno 2 ore a temperatura ambiente o conservarle a 4 °C. Le fette saranno ora traslucide e pronte per l'osservazione microscopica.

6. Misura della fluorescenza dello stravaso del colorante

NOTA: L'efficienza della marcatura a fluorescenza varia da mouse a topo. Pertanto, l'intensità della fluorescenza deve essere normalizzata. I valori di fluorescenza sono espressi rispetto a quelli all'interno del nucleo reticolare gigantocellulare (GRN) perché questa regione è minimamente influenzata dal trattamento con BSW.

1. Aggiungere 500 μl di glicerolo sul fondo di una capsula con fondo di vetro da 35 mm.
2. Trasferire la fetta nella soluzione di glicerolo e coprirne la superficie con un vetrino.
3. Rimuovere il glicerolo in eccesso dal bordo del vetrino.
4. Misurare l'intensità della fluorescenza della fetta al microscopio a fluorescenza.
5. Dopo la misurazione microscopica, rimettere la fetta nel pozzo.
6. Ripetere la misurazione per tutte e 12 le fette.
7. Aggiungere 500 μl di PB in ciascun pozzetto e conservare la piastra a 24 pozzetti a 4 °C per una notte; il giorno successivo, le fette saranno sature con il 50% di glicerolo-PB.
8. Sostituire la soluzione con glicerolo-PB al 30% e conservarla a 4 °C per almeno 2 ore.
9. Eseguire le procedure del passaggio 7 entro poche settimane.

7. Criosezione e immunoistochimica

1. Preparare una piastra a 24 pozzetti aggiungendo 1000 μl di una miscela di volumi uguali di terreno di congelamento tissutale e glicerolo-PB al 30% al pozzetto 1. Quindi, aggiungere 1000 μL di terreno di congelamento tissutale al pozzetto 2.
2. Trasferire la fetta alla fontana 1 e agitare la piastra a 4 °C per 1 h.
3. Trasferire la fetta nella vasca 2 e agitare la piastra a 4 °C per 1 ora.
4. Congelare velocemente la fetta con l'isopentano usando ghiaccio secco, facendo attenzione a non piegare la fetta. Conservare le fette a -80 °C fino alla criosezione.
5. Criosezionare la fetta a uno spessore di 6 μm. Dopo l'essiccazione sul vetrino del microscopio, conservare le sezioni a -80 °C.
6. Per il recupero dell'antigene¹⁷, immergere le sezioni in 10 mM di citrato di sodio (pH 6,0), riscaldare a 100 °C una volta, quindi mantenere a 98 °C per 1 ora.
7. Lavare abbondantemente le sezioni in acqua distillata. Le sezioni sono ora pronte per la colorazione immunoistochimica.

Risultati

La Figura 1A mostra l'andamento temporale dell'iniezione del colorante in relazione all'inizio della BSW, con una sovrapressione di picco di 25 kPa. Nel protocollo "Post", la soluzione di blu di Evans è stata somministrata per via intravascolare 2 ore prima della perfusione FITC-destrano, che è stata condotta 6 ore, 1 giorno, 3 giorni e 7 giorni dopo l'esposizione alla BSW. Nel protocollo "Pre", la soluzione di blu di Evans è stata iniettata immediatament...

Discussione

Una nuova tecnica di doppia marcatura che utilizza il blu di Evans e il destrano FITC è stata utilizzata per visualizzare con precisione la precisa distribuzione spazio-temporale della degradazione della BBB in un singolo cervello. Nel modello BSW a bassa intensità, sono state osservate notevoli variazioni nell'estensione, nella posizione e nel grado di stravaso del colorante nei cervelli esaminati (Figura 2 e Figura 3). Le di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin Neutral Buffer Solution	FUJIFILM Wako Chemicals	062-01661
Anti GFAP, Rabbit	DAKO-Agilent	IR524
Anti Iba1, Rabbit	FUJIFILM Wako Chemicals	019-19741
Chicken anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21200
Cryo Mount	Muto Pure Chemicals	33351	tissue freezing medium
Domitor	Orion Corporation		medetomidine
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10040
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129
Falcon 24-well Polystyrene Clear Flat Bottom Not Treated Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile, 50/Case	CORNING	351147
Fluorescein isothiocyanate–dextran average mol wt 40,000	Sigma-Aldrich	FD40S	FITC-dextran
Glass Base Dish 27mm (No.1 Glass)	AGC TECHNO GLASS	3910-035	35 mm glass bottom dish
IX83 Inverted Microscope	OLYMPUS
MAS Hydrophilic Adhesion Microscope Slides	Matsunami Glass	MAS-04
Matsunami Cover Glass (No.1) 18 x 18mm	Matsunami Glass	C018181
Midazolam Injection 10mg [SANDOZ]	Sandoz
Paraformaldehyde EMPROVE ESSENTIAL DAC	Merck Millipore	1.04005.1000
Peristaltic Pump	ATTO	SJ-1211 II-H
RODENT BRAIN MATRIX Adult Mouse, 30 g, Coronal	ASI INSTRUMENTS	RBM-2000C	brain slicer
Vetorphale	Meiji Animal Health	VETLI5	butorphanol