Sviluppo di una sonda per microscopia a forza atomica basata su pungiglione di zanzara bio-ibrida

Riepilogo

Indagini quantitative e controllate sui comportamenti di puntura degli insetti sono fondamentali per elaborare strategie efficaci per combattere le malattie trasmesse da vettori. In questo contesto, viene introdotto un metodo per fabbricare una sonda di microscopia a forza atomica (AFM) bio-ibrida.

Abstract

Le zanzare, note come gli animali più letali per l'uomo a causa della loro capacità di trasmettere malattie, rappresentano una sfida persistente per la salute pubblica. La strategia di prevenzione primaria attualmente in uso prevede l'uso di repellenti chimici, che spesso si rivelano inefficaci in quanto le zanzare sviluppano rapidamente resistenza. Di conseguenza, l'invenzione di nuovi metodi preventivi è fondamentale. Tale sviluppo dipende da una comprensione approfondita dei comportamenti di puntura delle zanzare, che richiede una configurazione sperimentale che riproduca accuratamente gli scenari di puntura reali con parametri di test controllabili e misurazioni quantitative. Per colmare questa lacuna, è stata progettata una sonda di microscopia a forza atomica (AFM) bio-ibrida, con un pungiglione biologico - in particolare, un labbro di zanzara - come punta. Questa sonda bio-ibrida, compatibile con i sistemi AFM standard, consente una simulazione quasi autentica dei comportamenti di penetrazione delle zanzare. Questo metodo segna un passo avanti nello studio quantitativo dei meccanismi di puntura, portando potenzialmente alla creazione di barriere efficaci contro le malattie trasmesse da vettori (VBD) e aprendo nuove strade nella lotta contro le malattie trasmesse dalle zanzare.

Introduzione

L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha riferito che le malattie trasmesse da vettori (VBD) rappresentano oltre il 17% di tutte le malattie infettive, che causano più di 7.000.000 di decessi all'anno a livello globale. Ad esempio, essendo l'animale più letale del mondo, le zanzare diffondono numerosi agenti patogeni, come dengue, malaria e Zika, attraverso artropodi che si nutrono di sangue, provocando 700 milioni di infezioni ogni anno^. Le esplorazioni verso lo sviluppo di misure efficaci per prevenire le VBD sono di fondamentale importanza, tra cui l'imitazione dei comportamenti di penetrazione delle zanzare per studiare i loro meccanismi di puntura e gli studi di potenziali barriere per dimostrare la loro efficacia nel prevenire la penetrazione. Una sfida chiave è quella di sviluppare approcci adeguati per eseguire tali indagini. Sono stati compiuti sforzi in letteratura, incluso lo sviluppo di aghi su microscala che assomigliano alla geometria di un pungiglione di zanzara; tuttavia, molti dei materiali utilizzati per realizzare questi microaghi (ad esempio, materiali viscoelastici², silicio (Si), vetro, ceramica³, ecc.) hanno proprietà meccaniche diverse rispetto al materiale biologico della proboscide della zanzara. I materiali ingegnerizzati possono essere fragili e soggetti a fratture e deformazioni ^3,4, mentre la proboscide della zanzara può resistere meglio alla frattura o all'instabilità⁴. Il vantaggio di avere una sonda bio-ibrida che utilizza il labbro di una zanzara invece di materiali ingegnerizzati è che può essere una rappresentazione più accurata del meccanismo di perforazione delle zanzare. Inoltre, strumenti specializzati devono essere integrati con micro aghi per eseguire studi quantitativi, come la misurazione accurata della forza⁵, che non è facilmente ottenibile con configurazioni personalizzate utilizzando microaghi ingegnerizzati.

L'approccio basato sulla microscopia a forza atomica (AFM) è promettente in quanto funziona impiegando un cantilever con una punta ultrasottile accuratamente posizionata vicino alla superficie di un campione. La punta può essere scansionata o premuta verso/dentro una superficie, subendo forze attrattive o repulsive variabili a causa delle sue interazioni con un campione⁶. Queste interazioni portano alla deflessione del cantilever, che viene tracciata dalla riflessione di un raggio laser dalla parte superiore del cantilever su un fotorilevatore⁶. L'eccezionale sensibilità al movimento del sistema consente all'AFM di condurre una vasta gamma di misurazioni, tra cui, ma non solo, la mappatura morfologica con precisione picometrica, le misurazioni della forza che vanno dai piconewton ai micronewton^{e le indagini} multifisiche complete. Ad esempio, le indentazioni AFM possono essere eseguite per valutare con precisione la risposta alla forza applicata di un campione e anche per misurare la durezza, l'elasticità e altre proprietà meccaniche di un campione accoppiandole con modelli analitici appropriati⁸. La sonda dell'AFM è più comunemente realizzata in silicio (Si) o nitruro di silicio (Si₃, N₄)⁸ con una lunghezza di 20-300 μm⁹ e un raggio di punta dell'ordine di diverse o decine di nanometri¹⁰. Il raggio della punta su scala nanometrica può essere ideale per applicazioni come l'imaging ad alta risoluzione; tuttavia, non possiede le caratteristiche dei pungiglioni biologici per gli studi che cercano di imitare i comportamenti di penetrazione in termini di rigidità, raggio, forma e rapporto d'aspetto. Ad esempio, la struttura a microaghi di una zanzara è il fascicolo, che ha un rapporto d'aspetto di ~60¹¹ (lunghezza da ~1,5 mm a 2 mm; diametro ~30 μm)¹². Mentre si può presumere che una sonda AFM convenzionale assomigli a un pungiglione biologico come un labbro, le sue proprietà e dimensioni distinte del materiale non rifletteranno la situazione reale durante un morso.

Per consentire indagini quantitative sui comportamenti di penetrazione che imitano i morsi biologici di insetti o altri animali con pungiglioni, qui viene sviluppato un processo per fabbricare cantilever AFM bio-ibridi con un pungiglione biologico come punta. Come caso di studio, è stato dimostrato con successo un cantilever AFM con la punta di un labbro di zanzara attaccato. Sfruttando le informazioni esistenti dalla letteratura sulle tipiche forze di inserzione che una zanzara usa per perforare la pelle di una vittima^12,13, questo cantilever AFM bio-ibrido può potenzialmente consentire un'imitazione quasi reale delle punture di zanzara sotto un normale AFM. Il protocollo di sfruttare i pungiglioni microbiologici per fabbricare cantilever AFM bio-ibridi può essere applicato anche allo sviluppo di altri cantilever AFM bioibridi a base di pungiglione affilato per indagini quantitative di una varietà di meccanismi di morso.

Terminologie
Uno schema di una proboscide e dei suoi componenti di interesse è mostrato nella Figura 1 e le loro definizioni sono (1) Proboscide: una parte del corpo della bocca di una zanzara che consente alla zanzara di nutrirsi, con una struttura nucleo-guscio composta dal fascicolo (nucleo) e dal labbro (guscio), (2) Labio: la copertura esterna scura e smussata di una proboscide², (3) Fascicolo: un gruppo di aghi sottili contenuti all'interno del labbro, tra cui due mascelle, due mandibole, un'ipofaringe e un labbro², (4) Ipofaringe: responsabile della secrezione di saliva nel flusso sanguigno dell'ospite², (5) Mascelle: membro seghettato che assiste nel meccanismo di alimentazione², (5) Mandibole: simili alla mascella, aiutano la zanzara nel meccanismo di alimentazione e hanno una punta acuminata², (6) Labbro: il membro principale per penetrare nella pelle di una vittima, che è molto più grande delle mascelle, delle mandibole e dell'ipofaringe. Ha anche strutture sensoriali che gli consentono di trovare vasi sanguigni e canali interni sotto la pelle², (7) Manipolatore: un gruppo con tre gradi di libertà e precisione su scala micron per il posizionamento, che consente il movimento nelle direzioni XYZ, (8) Gruppo morsetto: un morsetto in 2 parti su misura montato sul manipolatore utilizzato per bloccare il cantilever AFM senza punta durante l'esperimento.

Protocollo

La specie di zanzara utilizzata per questo protocollo è una femmina adulta non infetta di Aedes aegypti (A. aegypti), ricevuta congelata e conservata in un congelatore a -20 °C. La specie è stata fornita dal NIH/NIAID Filariasis Research Reagent Resource Center per la distribuzione attraverso BEI Resources, NIAID, NIH: Aedes aegypti non infetta, ceppo Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. I reagenti e le attrezzature utilizzate per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Sezionare il labbro dalla proboscide

1. Usando una pinzetta, posiziona una zanzara morta su un vetrino sotto il microscopio e assicurati che ci sia una punta affusolata all'estremità della proboscide (Figura 2A).
2. Tenendo la zanzara sul vetrino, posizionare delicatamente una lama di bisturi sul labbro vicino alla testa della zanzara (Figura 2B).
3. Procedere a praticare un'incisione su tutta la metà superiore del labbro (un taglio di circa 80 μm) con una profondità di penetrazione ridotta attraverso lo spessore del labbro. Assicurarsi di esercitare una leggera pressione sulla lama in modo da tagliare solo il labbro ma non il fascicolo sottostante.
4. Con un paio di pinzette, tieni saldamente la testa della zanzara e con un altro paio di pinzette di precisione, pizzica leggermente il labbro in qualsiasi posizione tra la punta affusolata e la posizione dell'incisione (Figura 2B).
   1. Tirare le pinzette che tengono il labbro nella direzione della punta affusolata (Figura 2C). Continua a tirare le pinzette fino a quando il labbro non si è strappato ed è stato completamente rimosso dal fascicolo.
5. Metti la zanzara al microscopio e verifica se la punta del labbro è presente. Questo può essere identificato dalla presenza di una punta affusolata sul fascicolo (Figura 2D).

2. Separare la punta del labbro dagli altri membri del fascicolo

1. Blocca e chiudi le punte di un set di pinzette di precisione e posiziona la punta della pinzetta proprio accanto al labbro vicino alla punta.
2. Utilizzare la punta della pinzetta per applicare una leggera forza sul labbro nella direzione perpendicolare alla lunghezza del fascicolo (Figura 3A).
3. Continuare a spingere il labbro attraverso il vetrino fino a raggiungere la separazione del labbro dagli altri elementi del fascicolo.
4. Ispezionare il campione al microscopio per verificare che sia stata raggiunta la corretta separazione tra il labbro e gli altri elementi del fascicolo (Figura 3, a sinistra). Se la separazione non riesce, fare riferimento al passaggio 2.1.

3. Taglio della punta del labbro

1. Mentre il labbro è ancora sul vetrino, posizionare una lama di bisturi sul labbro a circa ~200 μm di distanza dalla punta del labbro (Figura 4A). Applicare delicatamente una pressione sufficiente e tagliare la punta del labbro fino in fondo. Mentre la punta del labbro dovrebbe idealmente essere la più corta possibile, ~200 μm è il meglio che l'approccio attuale può gestire.
2. Misurare la lunghezza del labbro tagliato per assicurarsi che non sia più lungo di 300 μm (Figura 4B) utilizzando qualsiasi software di misurazione digitale. In questo protocollo, è stato utilizzato ImageJ¹⁴.

4. Afferrare la punta del labbro

1. Con un paio di pinzette di precisione, individuare e isolare la punta del labbro sul vetrino. Scartare ogni parte rimanente sul vetrino tranne la punta del labbro.
2. Con la stessa precisione delle pinzette, pizzicare lentamente e leggermente il labbro in modo che l'estremità tagliata sia libera e non ostruita dalle pinzette. Inoltre, assicurati che l'orientamento del labbro sia parallelo alla direzione della lunghezza della pinzetta e che l'estremità tagliata del labbro sia rivolta lontano dal corpo della pinzetta.
3. Una volta che il campione è saldamente pizzicato, rimuovere la forza di serraggio che tiene insieme le punte delle pinzette. La punta del labbro si attaccherà a una delle punte delle pinzette.
4. Al microscopio, ispezionare le punte delle pinzette e assicurarsi che la punta del labbro sia presente su una delle punte delle pinzette (Figura 5). Se la punta del labbro non è sulla pinzetta, fare riferimento al passaggio 4.2 e se la punta del labbro non è sulla pinzetta né sul vetrino, fare riferimento al passaggio 1.

5. Applicazione di resina epossidica sulla trave a sbalzo senza ribaltamento

1. Posizionare una goccia (~0,05 mL) di resina epossidica sul bordo di un nuovo vetrino lanciando direttamente l'adesivo dal suo flacone/contenitore originale. Posizionare il vetrino contenente resina epossidica sotto la stazione della sonda e concentrarsi su di esso.
2. Montare il cantilever AFM senza punta sul clamp gruppo fissando la base (cioè l'estremità più grande), lasciando l'estremità a sbalzo libera e sospesa nello spazio. Assicurarsi che la parte inferiore del cantilever AFM sia rivolta verso il basso.
3. Montare il manipolatore sulla stazione di sonda.
4. Sollevare l'asse Z del manipolatore in una posizione in cui il cantilever senza punta si trovi pochi millimetri sopra il vetrino contenente resina epossidica.
5. Spostare manualmente il manipolatore in modo che il cantilever senza punta sia visibile nel campo view della telecamera sulla stazione di sonda.
6. Usando il manipolatore, muovi il cantilever AFM lungo le direzioni X e Y fino a quando la punta del cantilever poggia direttamente sopra la resina epossidica sul bordo del vetrino.
7. Utilizzando nuovamente il manipolatore, abbassare lentamente il cantilever senza punta in direzione Z oltre il bordo del vetrino.
8. Quando il cantilever viene abbassato e si avvicina al vetrino, continuare ad abbassare il cantilever molto lentamente fino a toccare per la prima volta la resina epossidica. Non abbassare ulteriormente il cantilever.
9. Con cautela, innestare il manipolatore per spostare lentamente il cantilever in direzione X o Y e rimuovere il cantilever dal pool di resina epossidica spostando continuamente il cantilever nella direzione selezionata fino a quando il cantilever non è completamente separato dalla resina epossidica sul vetrino. Il cantilever senza punta dovrebbe avere una bolla in miniatura di resina epossidica sulla punta, visibile sotto la stazione della sonda.
10. Sollevare il cantilever in direzione Z utilizzando il manipolatore.

6. Incollaggio della punta del labbro alla trave a sbalzo senza punta

1. Ruotare il manipolatore attorno all'asse lungo del cantilever di 90 gradi e appoggiare il manipolatore sulla stazione della sonda su un lato. In questa configurazione, gli spessori lungo la lunghezza del cantilever AFM sono in direzione verticale.
2. Posizionare le pinzette di precisione che contengono la punta del labbro sotto la telecamera della stazione della sonda in modo che l'intera lunghezza della punta del labbro sia visibile sul monitor del computer.
3. Posizionare il gruppo manipolatore che tiene il morsetto e il cantilever senza punta sotto la telecamera della stazione di sonda, in modo che l'intera lunghezza del cantilever senza punta sia visibile sul monitor del computer.
4. Focalizzare il microscopio della stazione di sonda sulla punta del labbro e sul cantilever senza punta.
5. Orientare il cantilever perpendicolarmente alla punta del labbro ruotando con attenzione e manualmente il manipolatore (Figura 6A).
6. Utilizzando i gradi di libertà del manipolatore, spostare lentamente il cantilever senza punta nelle direzioni XY in modo che la colla sul cantilever entri in contatto con l'estremità tagliata della punta del labbro (Figura 6B).
7. Polimerizzare la resina epossidica, solidificando l'intersezione tra il cantilever e il labbro della zanzara.
8. Una volta che la resina epossidica si è indurita, innestare delicatamente il manipolatore nelle direzioni XY e allontanare il cantilever dalle pinzette, verificando che la punta del labbro sia ora in piedi sulla trave a sbalzo senza punta (Figura 6C).

Risultati

Le immagini al microscopio elettronico a scansione (SEM) della sonda AFM bio-ibrida fabbricata possono essere trovate nella Figura 7. L'estremità del labbro è stata incollata con successo alla trave a sbalzo senza punta. A causa della naturale curvatura dei pungiglioni di zanzara e del funzionamento manuale del protocollo presentato, è estremamente difficile ottenere un cantilever con una punta del pungiglione perfettamente perpendicolare al cantilever. L'angolo decentrato tra il pungigli...

Discussione

La fase 1 del protocollo ha lo scopo di pulire il campione biologico dal labbro indesiderato. Per ottenere ciò, viene praticata un'incisione sul labbro, ma non sul fascicolo, che si trova direttamente sotto il labbro (Figura 1). Poiché il fascicolo e il labbro non sono uniti insieme alla loro interfaccia (cioè, il labbro è libero di scorrere lungo il fascicolo ed è tenuto in posizione solo dal suo attacco alla testa della zanzara), l'incisione eseguita ha lo scopo di separare parte del ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers	Excelta	N/A	For manipulating/dissecting the proboscis.
C-4D Probe station	Everbeing Int’l Corp	N/A	Used for AFM assembly.
Tipless Tapping Mode Cantilever	NanoAndMore USA	TL-NCH	AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 - 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 - 497 kHz) Length: 125 µm (115 - 135 µm) Width: 30 µm (22.5 - 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 - 5 µm)
UV Expoxy	Let's resin	ALR00146	For stinger attachment.