Quantificazione della densità microvascolare polmonare nei topi attraverso i lobuli

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo semplice ed economico per eseguire una quantificazione imparziale della densità microvascolare polmonare per il tessuto polmonare di topi interi utilizzando una singola colorazione dell'isolectina B₄.

Abstract

L'alternanza anomala dell'angiogenesi polmonare è correlata alla disfunzione microvascolare polmonare ed è profondamente legata all'integrità della parete vascolare, alla regolazione del flusso sanguigno e allo scambio gassoso. Nei modelli murini, i lobi polmonari mostrano differenze significative in termini di dimensioni, forma, posizione e vascolarizzazione, ma i metodi esistenti non tengono conto di queste variazioni nella quantificazione della densità microvascolare. Questa limitazione ostacola lo studio completo della disfunzione microvascolare polmonare e il potenziale rimodellamento della circolazione microvascolare tra diversi lobuli. Il nostro protocollo affronta questa lacuna impiegando due metodi di sezionamento per quantificare le variazioni della densità microvascolare polmonare, sfruttando le dimensioni, la forma e la distribuzione dei rami delle vie aeree tra i lobi distinti nei topi. Utilizziamo quindi la colorazione con isolectina B₄ (IB₄) per marcare le cellule endoteliali microvascolari polmonari su diverse fette, seguita da un'analisi della densità microvascolare imparziale utilizzando il software ImageJ disponibile gratuitamente. I risultati qui presentati evidenziano vari gradi di cambiamenti di densità microvascolare nei lobuli polmonari con l'invecchiamento, confrontando topi giovani e anziani. Questo protocollo offre un approccio semplice ed economico per la quantificazione imparziale della densità microvascolare polmonare, facilitando la ricerca sugli aspetti fisiologici e patologici della microvascolarizzazione polmonare.

Introduzione

Le cellule endoteliali (EC) sono un tipo speciale di cellule situate sul rivestimento interno dei vasi sanguigni, che coprono l'intero albero arterioso e venoso e svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento della stabilità dei vasi sanguigni e degli organi¹. I polmoni sono organi altamente vascolarizzati e svolgono ruoli fisiologici e patologici essenziali nei polmoni, come la formazione della parete vascolare, la regolazione del flusso sanguigno, la facilitazione dello scambio gassoso, la modulazione delle risposte infiammatorie, il controllo dell'attività piastrinica, la secrezione di sostanze regolatorie coinvolte nella crescita vascolare, nella riparazione e nel mantenimento dell'equilibrio della coagulazione.

Le cellule endoteliali microvascolari polmonari (LMEC) sono cellule endoteliali specifiche del tessuto polmonare, in particolare nella microvascolarizzazione (capillari) dei polmoni, distinguendole dalle più generalizzate cellule endoteliali arteriose e venose nei polmoni. Queste cellule hanno varie funzioni, tra cui la regolazione del tono vascolare, il controllo della permeabilità vascolare, la partecipazione alla regolazione delle risposte infiammatorie e la regolazione della formazione di trombi. Svolgono un ruolo cruciale nella circolazione polmonare, regolando lo scambio gassoso e il trasporto di nutrienti, e sono coinvolti in vari processi fisiologici e patologici legati ai polmoni, probabilmente per l'invecchiamento². Inoltre, l'alternanza anomala dell'angiogenesi polmonare è correlata alla disfunzione microvascolare polmonare³. Utilizzando il marcatore convenzionale delle cellule endoteliali CD31 e la localizzazione spaziale (in particolare, le regioni periferiche dei polmoni), Larissa L. et al. hanno osservato una significativa diminuzione della densità delle cellule endoteliali microvascolari nei topi anziani (18 mesi) rispetto alle loro controparti più giovani (4 mesi)⁴. Nel contesto della patologia polmonare associata all'asma, Makoto H. et al. hanno dimostrato un aumento sostanziale dell'induzione dei vasi nei campioni di biopsia bronchiale colorati con anti-collagene IV da pazienti asmatici rispetto ai soggetti di controllo⁵. Recentemente, introducendo le tecniche di microscopia elettronica a trasmissione e a scansione, Maximilian A. et al. hanno riportato un notevole aumento della densità numerica delle caratteristiche correlate all'angiogenesi intussucettiva e germinativa in pazienti deceduti per Covid-19 o Influenza A (H1N1)⁶. Evidentemente, la genesi microvascolare anomala è collegata alla disfunzione polmonare. Tuttavia, attualmente non esiste un metodo semplice ed economico per quantificare le variazioni della densità microvascolare.

Nei modelli murini, i polmoni sono convenzionalmente segmentati in cinque lobi distinti: craniale destro, medio destro, caudale destro, craniale sinistro e caudale sinistro. Ogni lobo presenta caratteristiche uniche in termini di dimensioni, forma, posizione e probabile vascolarizzazione, contribuendo a un efficiente scambio di gas e alla regolazione potenzialmente sinergica della circolazione polmonare. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, nessuna metodologia tiene conto delle differenze tra questi lobi polmonari quando si studiano le alterazioni microvascolari polmonari.

Questo studio presenta un nuovo metodo per il sezionamento dei lobuli nei topi, utilizzando IB₄, un marcatore ben definito di cellule micro-endoteliali polmonari⁷, per una valutazione quantitativa imparziale della densità microvascolare polmonare. Questo approccio innovativo risponde alla necessità di una comprensione più completa delle alterazioni microvascolari nei polmoni murini considerando le proprietà distinte dei singoli lobi dei topi. A dimostrazione, nei topi anziani, è stata osservata una significativa riduzione dei rischi
La densità microvascolare si osserva specificamente sia all'interno del lobo caudale che del lobo sinistro. Il protocollo sottolinea l'importanza di integrare le analisi specifiche del lobo nelle indagini sui cambiamenti nel panorama microvascolare dei polmoni murini. In particolare, questo metodo fornisce preziosi riferimenti di ricerca per i ricercatori che cercano una comprensione completa della progressione fisiologica e patologica degli sviluppi e delle lesioni polmonari, che si estende oltre l'angiogenesi.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti seguendo le linee guida etiche del Comitato per la ricerca sugli animali dell'Università del Sichuan (n. K2023023).

1. Preparazione di sezioni di paraffina per lobi polmonari di topo

1. Acquisire tessuto polmonare dal topo.
   1. Scegli topi maschi C57Bl/6 a 6 settimane e 16 mesi per valutare la densità microvascolare nei polmoni di topo in diversi gruppi di età.
   2. Somministrare 100 mg/kg di pentobarbital sodico tramite iniezione intraperitoneale nei topi. Eutanasia dei topi mediante lussazione cervicale dopo l'anestesia. Aprire la cavità toracica e ottenere il tessuto polmonare.
2. Preparare le sezioni di paraffina.
   1. Fissare il tessuto mettendolo in una soluzione di paraformaldeide al 4% che è 10 volte il volume del tessuto per preservarne la morfologia e la struttura e prevenire la degradazione.
      NOTA: Recentemente è stato sviluppato un nuovo metodo per gonfiare l'aria durante la fissazione della perfusione vascolare nei polmoni murini. Si dice che questo metodo preservi una migliore morfologia e posizione delle vie aeree, delle cellule alveolari e dell'interstizio, rendendoli più adatti per gli studi istologici polmonari. Questo metodo è consigliato per i laboratori con le relative attrezzature e materiali di consumo con strumenti fabbricati internamente⁸.
   2. Tagliare il lobo polmonare per determinare la direzione di inclusione (Figura 1).
      1. Dopo 3 ore di fissazione, separare i cinque lobi polmonari (sotto l'osservazione diretta degli occhi) e incorporare separatamente i lobi cranico, medio e accessorio del polmone destro, con sezioni orientate nella direzione della connessione verticale lobo-bronco.
      2. Tagliare il lobo caudale del polmone destro in 2 pezzi a 4 mm da sinistra a destra nella direzione perpendicolare alla connessione lobo polmonare-bronco e incorporare le fette in un blocco di cera con la superficie tagliata rivolta verso l'alto.
      3. Fai tre tagli nel lobo polmonare sinistro. Eseguire il primo taglio trasversalmente sopra la giunzione bronchiale principale, 2 mm sotto la parte superiore. Eseguire il secondo taglio trasversalmente sopra la giunzione bronchiale principale, 5 mm sotto la parte superiore. Effettuare il terzo taglio all'estremità del lobo, 8 mm sotto la parte superiore. Scartare il pezzo di tessuto più in alto e racchiudere i tre pezzi rimanenti in un blocco di cera con la superficie tagliata rivolta verso l'alto.
         NOTA: Quando si incorporano più pezzi di polmone insieme, è possibile utilizzare una carta per microscopio per avvolgerli prima di metterli in una scatola di inclusione di fazzoletti per continuare il processo di disidratazione.
      4. Rifissare il tessuto nel fissativo per 24 ore.
   3. Mettere il blocco di tessuto in un contenitore e sciacquarlo sotto l'acqua corrente per 15 minuti.
   4. Posizionare in sequenza il tessuto nelle seguenti soluzioni: etanolo al 65% per 30 min, etanolo al 75% per 30 min, etanolo all'85% per 30 min, etanolo al 95% I per 60 min, etanolo al 95% II per 60 min, etanolo assoluto I per 60 min, etanolo assoluto II per 60 min, etanolo al 70% per 120 min, etanolo all'80% per 120 min, Etanolo al 90% per 120 minuti, etanolo al 95% per 120 minuti, etanolo assoluto I per 120 minuti ed etanolo assoluto II per 120 minuti.
   5. Mettere il fazzoletto nello xilene I per 30 minuti e nello xilene II per 30 minuti.
   6. Immergere il fazzoletto in cera morbida a una temperatura inferiore a 54 °C per 1 ora, in cera dura I a 58 °C per 1 ora e in cera dura II a 58 °C per 30 minuti.
   7. Selezionare una dimensione dello stampo adatta, riempirlo con una quantità adeguata di paraffina liquida e utilizzare una pinza per posizionare il tessuto nel telaio di inclusione al centro dello stampo nella direzione corretta. Posizionare lo stampo e il tessuto nell'area di congelamento della macchina per l'inclusione e premere delicatamente il tessuto con una pinza.
   8. Quando la paraffina inizia a sbiancare leggermente, posizionare rapidamente il telaio di inclusione scoperto sopra lo stampo ed eseguire la seconda iniezione di cera, sigillando i fori nella parte inferiore del telaio di inclusione. Trasferire l'intero stampo sul tavolo di congelamento per lo stampaggio.
   9. Dopo aver fissato il blocco di cera sull'affettatrice e aver rivelato la superficie di taglio liscia e piatta attraverso una rifilatura grossolana e fine, ruotare la manovella della rotella del microtomo per tagliare fette con uno spessore di 4 μm.
   10. Posizionare delicatamente le sezioni rimosse sulla superficie dell'acqua in ordine sequenziale. Una volta che le sezioni sono completamente estese, separare i pezzi rotti in corrispondenza delle giunzioni tra ciascuna sezione.
   11. Inclinare uno scivolo di vetro sotto la sezione e, al contatto, sollevare lentamente e uniformemente lo scivolo dalla superficie dell'acqua con un movimento verticale. Le sezioni aderiranno al vetrino.

2. Colorazione in immunofluorescenza per la rilevazione della microvascolarizzazione polmonare

1. Mettere le fette incorporate nella paraffina in forno a 65 °C per 60 minuti.
2. Posizionare le fette su una griglia per vetrini ed eseguire i seguenti passaggi nei barattoli di colorazione: immergere xilene 1, xilene 2 e xilene 3 per 15 minuti ciascuno, seguiti dall'immersione in xilene/etanolo (1:1) per 5 minuti, 100% etanolo #1, 100% etanolo #2, 85% etanolo, 75% etanolo e acqua distillata per 5 minuti ciascuno.
3. Diluire la soluzione modificata per il recupero dell'antigene del citrato di sodio 50 volte con acqua deionizzata. Preriscaldare il microonde ad alta potenza fino a ebollizione, quindi posizionare il vetrino nell'estratto di antigene. Lasciare bollire il vetrino nell'estratto di antigene per 15 minuti e poi raffreddare naturalmente a temperatura ambiente.
4. Lavare i vetrini due volte con PBS per 5 minuti ciascuno. Permeabilizzare con Triton allo 0,25% due volte per 10 minuti ciascuna.
5. Circondare il tessuto con una penna immunoistochimica e incubarlo con BSA al 5% a temperatura ambiente (RT) per 1 ora. Lavare i vetrini una volta con PBS per 5 minuti.
6. Eseguire Alexa-647 Fluor coniugato IB₄ e colorazione DAPI.
   1. Mantenere l'IB₄ in ghiaccio e diluirlo 1:50 con l'1% di BSA. Rimuovere l'acqua in eccesso intorno al cerchio, aggiungere 50-100 μl di IB₄ diluito a ciascuna sezione di tessuto e incubare per una notte a 4 °C (da questo passaggio in poi, eseguire tutte le procedure al buio).
   2. Lavare i vetrini tre volte con PBS per 5 minuti ciascuno. Permeabilizzare con Triton allo 0,25% per 10 min.
7. Diluire DAPI (10 μg/mL) con PBS in un rapporto di 1:10 e aggiungere 50-100 μL a ciascuna sezione di tessuto a RT per 5 minuti.
8. Lavare i vetrini tre volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
9. Applicare una goccia di mezzo di montaggio anti-sbiadimento sui vetrini, evitando l'esposizione alla luce. Asciugare il vetrino all'aria, quindi osservare e acquisire immagini del nucleo e dei segnali target con un microscopio a fluorescenza.

3. Quantificazione della densità microvascolare polmonare

1. Acquisisci immagini.
   1. Osservare i segnali di densità microvascolare polmonare e i segnali DAPI con un obiettivo 10x per ciascun lobo polmonare sia nei gruppi di età giovane che in quelli anziani.
   2. Standardizza l'intensità della sorgente luminosa e il tempo di esposizione per ciascun canale in base ai risultati dell'osservazione. Cattura le immagini a doppio canale che coprono l'intera area di ciascun lobo polmonare. Salvare l'immagine in formato ND2 con due canali (Figura 2).
2. Quantificare utilizzando l'immagine J (Figura supplementare 1).
   1. Avviare il software ImageJ.
   2. Importare le immagini indicate in ImageJ, quindi procedere al caricamento e alla selezione. Dividi i canali di conseguenza. Caricare un file in formato ND2 per entrambi i canali DAPI e IB₄ .
   3. Passare ad Analizza > imposta scala > configurare i parametri dell'immagine come 0,48 μm/pixel (a seconda dei parametri fotografici) > Global > OK.
   4. Impostare lo stesso intervallo di visualizzazione per regolare l'effetto di presentazione dell'immagine. Selezionare Immagine> regolare > Luminosità/Contrasto > impostare. Impostare l'intervallo di visualizzazione per ciascuno dei due canali separatamente, IB₄: 0-10000; DAPI: 0-20000.
   5. Per eliminare l'influenza dei segnali di fondo, procedere con i seguenti passaggi: Fare clic su Elabora > matematica > Sottrai; Sottrarre il segnale di fondo in base ai valori del segnale rilevati dallo strumento Bacchetta magica sullo sfondo, IB₄: 3000; DAPI:300.
   6. Per selezionare il valore di soglia che meglio si allinea con l'immagine originale, vai a Immagine > duplica.
   7. Seleziona sia l'immagine originale che quella duplicata > Tipo > 8 bit.
   8. Selezionare un valore di soglia appropriato per identificare con precisione la microvascolarizzazione polmonare. Fare clic su Immagine > Regola > soglia > intermodalità (scegliere la soglia più realistica rispetto al diagramma originale), selezionare > Sfondo scuro > Applica.
   9. Eliminare i segnali positivi IB₄ dai grandi vasi sanguigni nel polmone del topo, comprese le arterie e le vene: utilizzare lo strumento Bacchetta magica per selezionare i vasi sanguigni più grandi rispetto all'immagine duplicata, quindi fare clic su Elimina (ripetere l'operazione fino a quando non vengono rimossi i segnali positivi IB₄ nelle cellule endoteliali dei vasi sanguigni più grandi).
      NOTA: I segnali di colorazione IB₄ sono rilevati nelle cellule endoteliali delle arterie e delle vene del polmone del topo. Per ottenere un esame specifico delle occorrenze di microvascolarizzazione polmonare, si raccomanda di rimuovere uniformemente i focolai di segnale nelle cellule endoteliali dei vasi sanguigni più grandi.
   10. Contare il numero di segnali target, fare clic su Analizza > Imposta misurazioni e selezionare Area, Limita a soglia e Visualizza etichetta. Quindi seleziona Analizza particelle e imposta Dimensione: 0-infinito; Circolarità: 0,00-1,00; Spettacolo: Maschere eccessive; selezionare Riepiloga e fare clic su OK.
   11. Scegliere Riepiloga risultati > File > Salva con nome.
3. Analisi dei dati e statistiche
   1. Abbina e organizza il numero di focolai positivi IB₄ e DAPI positivi, rispettivamente, nella stessa immagine in una tabella unificata.
   2. Riassumere il numero totale di focolai positivi IB₄ e focolai positivi DAPI per ciascun lobo nei gruppi di giovani o di età indicati.
      1. Calcolare la percentuale di focolai positivi per IB4 (%) dividendo il numero totale di focolai positivi per_IB4 per il numero totale di focolai di colorazione DAPI in ciascun lobo per gruppi diversi. Presenta il numero di focolai positivi all'IB₄ , il numero di focolai di colorazione DAPI e la percentuale di focolai positivi all'IB₄ (%) come mostrato nella Figura 3A.
   3. Avvia il software di analisi dei dati e crea una nuova tabella di colonne.
      NOTA: GraphPad Prism 9 è stato utilizzato qui per l'analisi statistica.
   4. Denominali in sequenza dal Gruppo A al Gruppo J come "Lobo cranico giovane", "Lobo cranico vecchio", "Lobo medio giovane", "Lobo medio vecchio", "Lobo caudale giovane", "Lobo caudale vecchio", "Lobo accessorio giovane", "Lobo accessorio vecchio", "Lobo sinistro giovane", "Lobo sinistro vecchio". Quindi, inserire i focolai positivi IB₄ corrispondenti (%) nella tabella (Tabella supplementare 1).
   5. Utilizzare i test t non accoppiati per il confronto a coppie per valutare le differenze significative nelle regioni corrispondenti tra i due gruppi di età. Conduci un totale di cinque confronti per cinque lobi.
   6. Creare un grafico per la visualizzazione dei risultati (Figura 3B). Opta per un grafico a barre e includi l'analisi statistica nella figura.

Risultati

Per distinguere tra le lesioni nei bronchi principali e i piccoli rami delle vie aeree, è fondamentale assicurarsi che si osservi la struttura continua delle lesioni in questi due tipi di vie aeree. Ciò può essere ottenuto seguendo le procedure di taglio e incorporamento descritte nella Figura 1. Dati i numerosi lobi polmonari nei topi, che sono orientati in varie direzioni e possiedono una struttura a rete, sono più suscettibili al collasso rispetto ad ...

Discussione

Lo studio della densità microvascolare polmonare ha implicazioni significative per la comprensione dei processi fisiologici polmonari e anche per la definizione di biomarcatori per le malattie respiratorie. La circolazione polmonare vanta un'estesa superficie capillare avvolta da un sottile strato di cellule endoteliali. L'armoniosa giustapposizione di queste cellule e delle cellule epiteliali alveolari dà origine a una fragile membrana alveolo-capillare specificamente progettata per f...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	Tissue Fixative
4',6-diamidino-2-phenylindole	MCE	HY-D0814	Nucleic Dyes
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4	Thermo	I32450	Binding Microvessels
Anti-fluorescent Tablet Sealer	Abcam	AB104135	Sample Fixation
Antigen Repair Fluid	Biosharp	BL151A	Repair of Antigenic Sites
Biopsy Cassette	ActivFlo	39LC-500-1	Fixing and Positioning Tissue Samples
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064-50G	Sealing Solution
Cold Plate	Leica	HistoCore Arcadia H	Freezing Samples
Constant Temperature Electric Drying Oven	Taisite	101-0AB	High Temperature Repair
Disposable Microtome Blade	Leica	14035838383	Cutting Tissue Samples to Prepare Sections
Embedding Molds	Shitai	26155166627	Fixing Tissue Samples
Ethanol	Kelong	CAS 64-17-5	Tissue Dehydration Solution
Heated Paraffin Embedding Station	Leica	EG1150	Embedding Tssue Samples in Paraffin
HistoCore Water Bath	Leica	HI1220	Flatten and Fix Tissue Samples
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	Quantitative Tool
Immunohistochemistry Pens	Biosharp	BC004	Water-blocking Agent
Medical Forceps	Shanghai Medical Equipment	N/A	Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples
Microscope	Nikon	Ts2	Imaging Device
Mounting Media	Jiangyuan	Tasteless	Fixing and Preserving Tissue Sections
Paraffin Wax	SCHLEDEN	80200-0014	Fixing Tissue Structure
PBS	Beyotime	C0221A	Wash Buffer
Pentobarbital Sodium	Beijing Chemical Reagent Company	Q/H82-F158-2002	Anesthetic
Rotary Microtome	Biobase	Bk-2258	Preparing Slices
Sterile Scissors	Shanghai Medical Equipment	N/A	segmenting Tissue Samples
Surgical Scalpel	Shanghai Medical Equipment	N/A	Cutting Tissue Samples
Triton	Solarbio	T8200	Permeabilization Solution
Wash-Free Slide	PLATINUM PRO	PRO-04	Fixing Samples for Staining
Xylene	SUM	XK13-011-00031	Tissue De-waxing Solution