Un modello preclinico di miopatia indotta da sepsi con disuso nei topi

Riepilogo

Questo modello murino combina un insulto settico con il disuso dei muscoli degli arti posteriori per ricapitolare la caratteristica costretta a letto del tipico paziente settico. Il modello rappresenta un allontanamento significativo dai modelli precedenti per studiare la disfunzione muscolare nella sepsi ed è un approccio riproducibile per affrontare le strategie terapeutiche per trattare questa condizione.

Abstract

La sepsi è una delle principali cause di decessi in ospedale. I miglioramenti nel trattamento si traducono in un numero maggiore di sopravvissuti alla sepsi. Circa il 75% dei sopravvissuti sviluppa debolezza muscolare e atrofia, aumentando l'incidenza di riammissioni ospedaliere e di mortalità. Tuttavia, i modelli preclinici disponibili di sepsi non affrontano il disuso del muscolo scheletrico, una componente chiave per lo sviluppo della miopatia indotta da sepsi. Il nostro obiettivo in questo protocollo è fornire una linea guida passo dopo passo per un modello murino che riproduca l'ambiente clinico vissuto da un paziente settico costretto a letto. Per sviluppare questo modello sono stati utilizzati topi maschi C57Bl/6. I topi sono stati sottoposti a legatura e puntura cecale (CLP) per indurre la sepsi. Quattro giorni dopo il CLP, i topi sono stati sottoposti a sospensione degli arti posteriori (HLS) per sette giorni. I risultati sono stati confrontati con interventi chirurgici sham matched e/o animali con deambulazione normale (NA). I muscoli sono stati sezionati per la meccanica muscolare in vitro e le valutazioni morfologiche. Il modello provoca una marcata atrofia e debolezza muscolare, un fenotipo simile osservato nei pazienti settici. Il modello rappresenta una piattaforma per testare potenziali strategie terapeutiche per la mitigazione della miopatia indotta da sepsi.

Introduzione

La sepsi è una condizione pericolosa per la vita a causa di una risposta immunitaria iperattiva che influisce negativamente su più sistemi di organi, con conseguente grave onere per i sistemi sanitari di tutto il mondo¹. Più recentemente, la mortalità ospedaliera legata alla sepsi è diminuita grazie al miglioramento della gestione dell'unità di terapia intensiva (ICU) ^1,2. Tuttavia, circa il 75% dei pazienti sopravvissuti all'insulto settico iniziale sviluppa atrofia del muscolo scheletrico (ad esempio, riduzioni dell'area della sezione trasversale) e debolezza (ad esempio, riduzioni della capacità di produzione di forza)^3,4. Questo fenomeno è stato caratterizzato come miopatia indotta da sepsi, altamente legata a un'attività fisica compromessa e alla mancanza di indipendenza nello svolgere le attività della vita quotidiana, che porta alla riospedalizzazione e alla mortalità entro cinque anni dall'episodio iniziale⁵.

A causa di un'infezione aggressiva e generalizzata, i pazienti settici sono esposti a periodi prolungati di riposo a letto durante il recupero in terapia intensiva. In questo contesto, il muscolo scheletrico subisce un grave disuso, che probabilmente aggrava l'atrofia e la debolezza muscolare ^3,4. Attualmente, nessun trattamento ha affrontato efficacemente la miopatia indotta da sepsi. I modelli preclinici disponibili progettati per affrontare la miopatia hanno utilizzato la legatura e la puntura cecale (CLP)⁶, il liquame cecale⁷ o l'iniezione di lipopolisaccaride purificato (LPS), che è un componente della parete cellulare nei batteri gram-negativi⁸. Sebbene questi modelli riescano a trasmettere l'infezione, non riproducono correttamente il disuso muscolare osservato negli ospiti settici al di là di una naturale riduzione dell'attività fisica osservata negli animali settici⁹.

L'obiettivo principale di questo studio è fornire una descrizione dettagliata di come eseguire correttamente il modello di miopatia indotta da sepsi con disuso nei topi. Dimostriamo la fattibilità di combinare la CLP come modello di sepsi con la sospensione degli arti posteriori (HLS) come modello di disuso per studiare la miopatia indotta da sepsi nei topi³. Inoltre, vengono forniti anche risultati rappresentativi della meccanica muscolare e cambiamenti morfologici tipici in risposta al modello.

Protocollo

Le procedure sono state esaminate e approvate dall'Università della Florida IACUC (#202200000227). Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J, di 17 settimane, con una massa corporea compresa tra 27 g e 34 g. Le procedure sperimentali e la tempistica delineate in questo protocollo sono illustrate nella Figura 1. Come indicato, il protocollo si estende su un totale di 11 giorni. Gli animali vengono sottoposti a chirurgia di sopravvivenza (CLP/Sham) il giorno 0, seguito da quattro giorni di supporto idrico e analgesico. Il giorno 4, gli animali iniziano l'HLS per una durata di 7 giorni. Gli esperimenti terminali vengono condotti l'11° giorno. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Legatura e puntura cecale (CLP)

1. Dopo aver ottenuto gli animali da una fonte commerciale, lasciali acclimatare nella struttura per animali per almeno 1 settimana prima di eseguire interventi chirurgici CLP (o sham). Ciò contribuirà a ridurre al minimo lo stress associato al trasporto.
2. Raggruppare i topi, aderendo alle linee guida locali IACUC.
   NOTA: Come indicazione generale, gli animali sono alloggiati in un massimo di 5 topi per gabbia fino al giorno dell'intervento. Le gabbie standard, che misurano 7,25 pollici di larghezza, 11,75 pollici di lunghezza e 5 pollici di altezza, sono utilizzate e arredate con lettiera di pannocchia. Viene mantenuto un ciclo luce-buio di 12 ore, con luci accese alle 7 del mattino e spente alle 7 del pomeriggio. La temperatura dell'alloggiamento viene mantenuta a 20-22 °C e l'umidità relativa (RH) viene mantenuta tra il 30% e il 60%. L'accesso ad libitum alla dieta standard e all'acqua è garantito.
3. Per eseguire la CLP, anestetizzare l'animale con isoflurano (2,5%, 500 ml/min) in una camera di induzione. Confermare l'anestesia pizzicando la zampa con una pinzetta. Una volta in anestesia profonda, come confermato dall'assenza di ritiro riflesso dal pizzicamento della zampa, trasferire l'animale in anestesia continua utilizzando un cono nasale (2,5%, 100-125 ml/min).
   NOTA: Le tecniche asettiche devono essere impiegate durante l'intera procedura.
4. Applicare un unguento lubrificante veterinario per gli occhi per salvaguardare gli occhi dell'animale da potenziali danni o lesioni indotti dall'ogiva durante l'intervento chirurgico.
5. Per pulire il sito chirurgico, utilizzare un depilatore disponibile in commercio. Rimuovere il pelo solo dal basso addome, evitando la sovraesposizione della pelle.
   NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un tagliacapelli per animali, ma è necessario prestare attenzione per evitare danni alla pelle.
6. Una volta esposto il sito chirurgico, detergere l'area con tre applicazioni di iodio povidone (o uno scrub germicida equivalente), seguite da un risciacquo con alcol al 70% tra ogni applicazione.
7. Somministrare una singola dose di 3,25 mg/kg di buprenorfina a rilascio prolungato o equivalente, secondo il trattamento analgesico approvato dall'IACUC locale.
8. Trasferire il mouse nell'area chirurgica. Isolare il sito chirurgico utilizzando un telo adesivo. In anestesia profonda, praticare un'incisione ventrale sulla linea mediana (~2 cm) nella pelle utilizzando una lama di bisturi.
   1. Usa le forbici per separare la pelle dallo strato muscolare. Usando la lama del bisturi, praticare un'incisione più piccola (~1 cm) nello strato muscolare. Una volta visualizzati gli intestini, utilizzando una pinza smussata, individuare il cieco ed esteriorizzarlo.
9. Una volta esteriorizzato, legare il cieco utilizzando una sutura riassorbibile sterile 5-0 in poliglactina. Considera l'area del cieco legato, definita come la distanza dall'estremità distale del cieco al punto di legatura, in quanto contribuirà alla gravità dell'infezione. Per riprodurre i risultati qui presentati, legare il cieco a 1 cm dal suo punto distale.
   NOTA: Legare un'area del cieco più ampia comporterà un aumento della gravità¹⁰.
10. Utilizzando un ago da 27 G, perforare il cieco fino in fondo, consentendo la fuoriuscita del contenuto fecale. Con cautela, spremere delicatamente il cieco per esternalizzare il contenuto fecale. Per eseguire un intervento chirurgico fittizio, seguire gli stessi passaggi esponendo il cieco animale. Tuttavia, non legare né perforare il cieco.
    NOTA: Il calibro dell'ago influisce direttamente sulla gravità dell'infezione. Per produrre un'infezione di basso grado, si consigliano aghi da 26 G a 28 G. Si prega di notare che l'uso di aghi più spessi comporterà un aumento del tasso di mortalità e gli animali potrebbero non tollerare la successiva fase di sospensione degli arti posteriori del protocollo.
11. Riposizionare il cieco nella cavità addominale. Chiudere lo strato muscolare con una sutura sterile 5-0 assorbibile. Chiudere la pelle con una sutura in nylon 5-0 non assorbibile. Al termine della sutura cutanea, fornire soluzione fisiologica sterile (1 ml per i maschi e 0,5 ml per le femmine) tramite iniezione sottocutanea nella parte posteriore dell'animale.
    NOTA: Per la chiusura dello strato muscolare si consiglia una tecnica di sutura continua, mentre per lo strato cutaneo si consiglia una tecnica di sutura interrotta. Consultare e conformarsi alle linee guida IACUC locali per la sutura in chirurgia di sopravvivenza.
12. Dopo l'intervento, alloggiare gli animali in una gabbia pulita sopra un materasso riscaldante o un termoforo impostato a 35 °C. Osservare il topo ogni 15 minuti durante l'ora iniziale successiva al recupero dell'anestesia, dopodiché può essere restituito alla struttura di accoglienza.
    NOTA: Fornire una quantità minima di cibo sul pavimento della gabbia per consentire agli animali di consumare cibo ad libitum senza intaccare il sito chirurgico. Dopo il rientro in struttura, gli animali vengono controllati due volte al giorno dopo la valutazione settica degli animali (fase 3).
13. Fornire soluzione salina sterile e supporto analgesico nei quattro giorni successivi per consentire la guarigione dell'incisione chirurgica.
    NOTA: Il monitoraggio quotidiano della temperatura superficiale xifoidea e del peso corporeo aiuta a tenere registri accurati della gravità della sepsi¹¹.

2. Sospensione degli arti posteriori (HLS)

1. Per eseguire l'HLS, gli investigatori devono seguire le linee guida etiche locali dell'IACUC. Ciò include la garanzia dell'uso di gabbie e pavimenti di dimensioni adeguate, che sono aspetti cruciali per accogliere la locomozione, l'alimentazione e le abitudini di consumo degli animali in condizioni di HLS.
   NOTA: Si raccomandano 4 giorni di recupero dopo la CLP per la guarigione delle ferite.
2. Dopo 4 giorni di recupero dalla CLP o da un intervento chirurgico fittizio, anestetizzare l'animale sotto un leggero flusso di isoflurano (2,5%, 100-125 ml/min). Attacca la coda del topo a una corta catena di metallo usando del nastro di gommapiuma. Posiziona la catena di metallo parallelamente alla coda mentre il nastro di schiuma abbraccia saldamente la coda e la catena.
3. Per garantire la sospensione degli arti posteriori, fissare la catena metallica a un gancio collegato a una traversa lungo il centro della gabbia. Inoltre, apporre una seconda piccola barra che può muoversi lungo la traversa per consentire una maggiore capacità di movimento per l'animale.
   NOTA: Gli animali devono essere in grado di muoversi attraverso gli arti anteriori utilizzando la griglia metallica sul pavimento della gabbia.
4. Regolare l'altezza degli arti sospesi per evitare il contatto delle zampe con i pellet di chow. Monitorare gli animali e pulire a mano l'area rasata intorno alla pelle suturata con un batuffolo di cotone imbevuto d'acqua almeno due volte al giorno durante il periodo di sospensione.
   NOTA: La pulizia è fondamentale per evitare infezioni nel sito dell'intervento, in particolare da scottature urinarie dovute alla posizione del corpo sollevata.
5. Per riprodurre i risultati, assicurarsi che gli animali siano sottoposti a 7 giorni di sospensione degli arti posteriori. La durata è stata determinata sulla base di precedenti studi che mostravano il tempo minimo richiesto per la sospensione degli arti posteriori per suscitare effetti significativi sui muscoli scheletrici in condizioni non settiche ^12,13.
   NOTA: La sopravvivenza, il disagio o l'angoscia degli animali aumenteranno in base alla gravità dell'infezione.

3. Valutazione degli animali settici

NOTA: La valutazione delle condizioni cliniche dell'animale è un aspetto chiave per tenere traccia della gravità dopo gli interventi chirurgici CLP/sham. Inoltre, come richiesto dall'IACUC, devono essere stabiliti endpoint umanitari per il benessere degli animali. Per affrontare queste preoccupazioni e fornire standard per la cura quotidiana degli animali, sono state utilizzate le indicazioni per eseguire la valutazione degli animali utilizzando il punteggio di sepsi murina modificata (MMSS)¹⁴.

1. Utilizzare l'MMSS (Supplementary File 1) per valutare l'animale. Si noti che per ogni categoria, un punteggio di 0 rappresenta un animale sano. Assegna un punteggio all'animale due volte al giorno da 0 a 3 in base alla gravità dell'infezione.
2. Per migliorare la precisione, misurare la temperatura superficiale xifoidea e il peso corporeo due volte al giorno^11,15 e registrare insieme al foglio di valutazione MMSS.
   NOTA: Le tipiche fluttuazioni della temperatura superficiale xifoidea e del peso corporeo sono fornite nella Figura 1 supplementare.
3. Consultare l'IACUC locale per gli endpoint umani.
   NOTA: Per riprodurre i risultati, sono stati utilizzati i seguenti criteri come endpoint: (1) Perdita di peso corporeo del >40% rispetto al basale. (2) Temperatura <30 °C o riduzione di >5 °C rispetto al valore precedente. (3) Un punteggio di 3 nei seguenti punti: Risposta allo stimolo, livello di coscienza o qualità della respirazione. (4) MSSS giornaliero totale ≥17. La valutazione qui descritta è progettata per essere eseguita dopo l'intervento chirurgico e in animali sottoposti a normale deambulazione. Si raccomanda di astenersi dal maneggiare animali sottoposti a HLS per evitare il contatto tra gli arti posteriori e le superfici. Dopo la valutazione finale, sopprimere l'animale secondo le raccomandazioni del comitato etico animale locale.

Risultati

Per i dati rappresentativi riportati nei risultati, sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J, di 17 settimane, con una massa corporea compresa tra 27 e 34 g. L'intero protocollo richiede undici giorni per essere completato e consiste nell'intervento chirurgico (CLP o sham), nel supporto salino e analgesico (giorni da 0 a 4) e nel disuso di HLS (giorni da 4 a 11). Gli esperimenti terminali possono essere eseguiti in qualsiasi momento durante la fase di sospensione. Per comprendere megli...

Discussione

L'attuale protocollo fornisce linee guida tecniche per l'implementazione di un nuovo modello preclinico di miopatia indotta da sepsi. Tutti i materiali e i passaggi importanti sono descritti in dettaglio per la riproduzione del modello. Questo approccio è in grado di riprodurre la disfunzione del muscolo scheletrico osservata nei pazienti settici, evidenziando il ruolo del disuso come componente cruciale nel peggioramento della miopatia. Finora, la maggior parte degli studi preclinici c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Ethicon Coated Vicryl	Ethicon	D5792	Absorbable suture used for closure of muscle layer and for ligation of the cecum.
4-0 Ethilon Black 18"	Ethicon	662G	Non absorbable suture for closure of the skin layer.
BD  PrecisionGlide Needle 26-28 G	BD	305136 for 27g needle	Needle for puncturing the cecum.
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	strain #000664
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	Swabs for topical application of iodine.
Cryostat	(Leica CM1950)
Dynarex Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415	Topical Antiseptic Liquid for Skin and Mucosa
Ethanol 200 Proof (100%)	Fisher Scientific		To make 70% ethanol for cleaning skin.
Hindlimb Suspension Cages	Custom Made	N/A	These custom made cages will be highlighted in the video recordings of the MS.
Optixcare Eye Lube	Optixcare		Eye lube for protection during survival surgery.
Scalpel blades #11	Fine Science		Blade used to make incisions on skin and muscle.
Skin-Trac	Zimmer	736579	Foam tape for fixing the tail to the suspension apparatus.
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific Corporation	SS-01	Vaporizer for Isoflurane Anesthesia
Tissue bath apparatus	Aurora Scientific	Model 800A, Dual Mode Muscle Lever 300C