Prelievo di sangue e misurazione ormonale per determinare lo stadio del ciclo ovarico negli uistitì

Riepilogo

Questo protocollo descrive il campionamento di sangue e urine per misurare i livelli di progesterone/estradiolo e gonadotropina corionica per determinare la fase del ciclo ovarico. I livelli ormonali vengono utilizzati per prevedere e determinare i tempi dell'ovulazione e gli ormoni vengono iniettati per regolare il ciclo ovarico e la crescita degli ovociti.

Abstract

Gli uistitì comuni sono piccole scimmie del Nuovo Mondo. Poiché molti dei loro meccanismi biologici sono simili a quelli degli esseri umani, gli uistitì sono potenzialmente utili per la ricerca medica e di biologia umana in una vasta gamma di campi, come le neuroscienze, la medicina rigenerativa e lo sviluppo. Tuttavia, c'è una mancanza di letteratura che descriva i metodi per molti esperimenti e procedure di base. Qui vengono descritti metodi dettagliati per determinare i livelli di ormoni sessuali (progesterone, estradiolo e gonadotropina corionica) negli uistitì. La misurazione di questi ormoni consente di prevedere la fase del ciclo ovarico, che in genere è di 26-30 giorni negli uistitì; Una determinazione accurata è essenziale per il prelievo di ovociti/zigoti al momento giusto e per la preparazione delle femmine ospiti per la generazione di uistitì geneticamente modificati.

Inoltre, la misurazione dei livelli di ormoni sessuali è utile per gli studi di endocrinologia, etologia, sviluppo precoce e biologia riproduttiva. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata dei metodi per il prelievo di sangue dalla vena femorale, la separazione del plasma per la misurazione ormonale, la misurazione dei livelli di gonadotropina corionica utilizzando urina e plasma, il ripristino del ciclo ovarico utilizzando iniezioni di un analogo della prostaglandina F2α per abbreviare e sincronizzare il ciclo e promuovere la crescita follicolare e l'ovulazione iniettando l'ormone follicolo-stimolante e la gonadotropina corionica. Utilizzando questi protocolli, è possibile determinare le fasi del ciclo ovarico per la raccolta tempestiva di ovociti/zigoti.

Introduzione

L'uistitì comune (Callithrix jacchus) è una piccola scimmia del Nuovo Mondo con molte caratteristiche simili a quelle dell'uomo, e la durata del suo ciclo ovarico è di 26-30 giorni ^1,2. Gli studi sullo sviluppo precoce e sulla generazione di uistitì geneticamente modificati richiedono il prelievo di ovociti e zigoti in fasi specifiche del ciclo ovarico. Pertanto, la determinazione accurata dello stadio è fondamentale e può essere stimata misurando i livelli ematici degli ormoni progesterone (P4) ed estradiolo (E2)^2,3. Questi ormoni promuovono la crescita endometriale, necessaria per l'impianto. P4 è prodotto dal corpo luteo, che si forma nelle ovaie immediatamente dopo l'ovulazione. L'E2 è secreto dai follicoli ovarici in risposta all'ormone follicolo-stimolante (FSH) dal complesso ipotalamo-ipofisi nel cervello. I livelli di E2 aumentano man mano che il follicolo matura, raggiungendo il picco prima dell'ovulazione³. Alti livelli di E2 causano il rilascio pulsato dell'ormone luteinizzante (LH) attraverso il complesso ipotalamo-ipofisi nell'uomo; questo picco di LH induce l'ovulazione. Tuttavia, negli uistitì, il gene LH ha subito una degenerazione durante l'evoluzione, e l'ovulazione è invece indotta dal rilascio di gonadotropina corionica (CG), che ha una struttura simile a quella di LH, dalla ghiandola pituitaria ^4,5.

Il ciclo ovarico può essere controllato con iniezioni di ormoni. Le iniezioni di FSH, nell'uomo, agiscono sui recettori ovarici dell'FSH e vengono utilizzate per promuovere la sintesi degli estrogeni e la crescita dei follicoli⁶. L'iniezione di CG umano (hCG) come sostituto dell'LH alla fine della fase follicolare viene utilizzata per stimolare l'ovulazione nell'uomo⁷. Le iniezioni di CG sono anche usate per trattare l'infertilità umana perché il CG stimola il corpo luteo all'inizio della gravidanza, con conseguente aumento della produzione di P4. Le iniezioni di prostaglandina F2α (PGF2α) ripristinano il ciclo ovarico⁸. Nei bovini domestici, l'iniezione di PGF2α viene utilizzata per accorciare la fase luteale e sincronizzare il ciclo dell'estro per la gestione riproduttiva.

Sebbene gli uistitì e gli esseri umani abbiano meccanismi biologici simili, che li rendono animali modello ideali, c'è una mancanza di letteratura che descriva i metodi di base per molte tecniche spesso utilizzate. Il prelievo di sangue è una delle tecniche più utilizzate 9,10,11,12. Tuttavia, i principianti a volte hanno difficoltà a trovare la vena. Pertanto, questo studio ha condotto analisi anatomiche della regione della vena femorale. Sulla base di osservazioni anatomiche, questo protocollo introduce la regione prossimale del triangolo femorale come un sito facile per la venipuntura.

Protocollo

Tutti i metodi che coinvolgono gli uistitì utilizzano elevati standard etici e di benessere e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il National Center for Child Health and Development. Gli animali utilizzati qui erano alloggiati in un solo alloggio o in coppia (una femmina e un maschio) con 12 ore di luce al giorno.

1. Prelievo di sangue dalla vena femorale

1. Preparare una siringa da 1 ml (il tipo corto è facile da usare) con un ago da 25 G attaccato con la lama rivolta verso l'alto. Per evitare l'ostruzione del sangue, eparinizzare la siringa aspirando 200 μL di soluzione di eparina sodica non diluita nella siringa. Rivestire uniformemente l'interno della siringa tirandola su e giù più volte; Quindi, espellere la soluzione di eparina dalla siringa.
   NOTA: Poiché spesso è necessario passare a una nuova siringa, preparare alcune siringhe eparinizzate aggiuntive.
2. Preparare tamponi assorbenti di cotone e alcol Accendi una lampada regolabile per illuminare l'area in cui verrà posizionato l'uistitì per il prelievo di sangue.
3. Preparare il dispositivo di ritenuta (420 x 85 x 85 mm, Figura 1A), disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali per i dettagli). Per posizionare un uistitì nel dispositivo, aprire la parte di ritenzione con il nastro in spugna, che fissa gli uistitì. Inserire l'uistitì nel dispositivo di ritenuta rivolto verso l'alto.
   NOTA: Gli uistitì sono generalmente calmi nei dispositivi di contenzione, il che può annullare la necessità di acclimatazione o addestramento alla contenzione.
4. Cattura l'uistitì; inserire l'uistitì nella parte cilindrica; e fissarlo premendo verso il basso il nastro di spugna. Posizionare la gamba da cui deve essere raccolto il sangue sopra l'altra (Figura 1A). Tenere le gambe usando la mano non dominante; Posiziona il medio e l'anulare all'interno di ciascuna gamba per fissarli e le altre dita all'esterno di ciascuna gamba per fissarli.
   NOTA: Si consigliano guanti da morso quando si catturano gli uistitì. Se non è presente un dispositivo di contenzione, eseguire il prelievo di sangue sotto anestesia o con un'altra persona che trattiene l'uistitì.
5. Controlla se la vena femorale è visibile vicino alla base della coscia. In caso contrario, palpare per trovare l'arteria pulsante e usarla come punto di riferimento per verificare che la vena scorra al suo interno (Figura 1B-D).
   NOTA: Si consiglia l'illuminazione della scrivania e la rasatura dei capelli per migliorare la visibilità. La visibilità può essere migliorata anche strofinando con tamponi imbevuti di alcol. I linfonodi nel triangolo si trovano spesso vicino alla vena e mostrano un colore blu scuro come una vena. Come distinguerli è descritto nella sezione Risultati rappresentativi.
6. Disinfettare il sito di puntura utilizzando un tampone imbevuto di alcol. Inserire l'ago con la lama rivolta verso l'alto con un angolo di 15°-20°. Per evitare che l'ago scivoli fuori dal vaso sanguigno durante la raccolta del sangue, stabilizzare la mano che tiene la siringa, ad esempio appoggiandola sull'altra mano.
7. Tirare delicatamente indietro lo stantuffo per applicare una pressione negativa (Figura 1E). Spingere in avanti la punta dell'ago. Una volta che il sangue entra nella siringa, mantenere la posizione della punta dell'ago fino a quando non è stato raccolto il volume richiesto (500-700 μL).
   1. Quando il sangue non entra nella siringa, cambiare il sito di puntura. Se il sangue fuoriesce quando si estrae l'ago, interrompere l'emorragia applicando pressione sul sito di puntura per 3 minuti. Dopo aver fermato l'emorragia, riavviare la venipuntura.
   2. Se il sangue aspirato nella siringa smette di fluire durante il processo di prelievo, spingere lentamente la punta dell'ago in avanti e poi tirarla indietro per trovare il vaso sanguigno. Questo può ripristinare il flusso di sangue nella siringa. In caso contrario, estrarre l'ago ed eseguire l'iniezione venosa utilizzando una nuova siringa.
      NOTA: Utilizzare la coscia sull'altra gamba quando è difficile raccogliere il sangue dallo stesso lato.
8. Estrarre con cautela l'ago premendo leggermente sul sito di puntura con il mignolo. Quindi, utilizzando un batuffolo di cotone assorbente, applicare immediatamente una pressione sul sito di puntura per 3 minuti per fermare l'emorragia. Capovolgere la siringa per mescolare sangue ed eparina.
   NOTA: Applicare una pressione più lunga (5 minuti) durante il raffreddamento quando viene prelevato il sangue arterioso e verificare attentamente la frequenza del sanguinamento per prevenire la formazione di ematoma, che a volte può provocare un esito fatale.
9. Dopo aver confermato che l'emorragia è cessata, rimuovere la cintura di spugna, tenere la vita dell'animale con una mano e ruotare l'animale in modo da poterlo tenere sotto le ascelle usando un'altra mano dal retro.
10. Rimetti l'uistitì nella sua gabbia. Per ridurre lo stress e facilitare il prelievo ripetuto di sangue, fornisci all'uistitì il suo cibo preferito (ad esempio, biscotti, marshmallow o pan di spagna). Controllare l'insorgenza di ematoma di tanto in tanto.
    NOTA: Quando l'ematoma viene rilevato nella fase iniziale, applicare una benda a pressione per prevenire la progressione dell'ematoma. Quando viene trovato dopo molto tempo, può essere necessaria la rimozione chirurgica dell'ematoma con legatura dell'arteria femorale e trasfusione di sangue ^9,13.
11. Staccare l'ago dalla siringa per prevenire l'emolisi. Quindi, espellere lentamente il sangue raccolto lungo la parete interna di una microprovetta da 1,5 mL.
    NOTA: Il sangue raccolto può essere conservato a 4 ^oC per un massimo di 24 ore prima della separazione del plasma per misurare i livelli di P4/E2.

2. Separazione del plasma e determinazione dei livelli ormonali

1. Centrifugare il sangue in una provetta da 1,5 ml a 1.100 × g per 5 minuti a 4 ^oC.
2. Trasferire il plasma separato (surnatante) dalla provetta da 1,5 mL in una nuova provetta/coppa, evitando accuratamente l'inclusione di cellule del sangue (sedimenti).
3. Misurare i livelli di P4 ed E2 utilizzando un kit ELISA o un analizzatore automatico. Se la quantità di plasma non è sufficiente per l'analizzatore automatico, utilizzare una soluzione di diluizione del campione.
   NOTA: Per la misurazione con un analizzatore automatico, sono necessari >175 μL di plasma per determinare solo un livello di P4 e >250 μL di plasma per determinare sia P4 che E2.

3. Misurazione del baricentro urinario per rilevare l'ovulazione e la gravidanza

NOTA: I livelli di CG negli uistitì possono essere misurati utilizzando un kit di test immunocromatografico sia per l'ovulazione che per la gravidanza. In caso di ovulazione, un risultato positivo può essere ottenuto 0-2 giorni prima dell'ovulazione. In caso di gravidanza, viene rilevato un risultato positivo dal 15° al 20° giorno circa al 100° giorno di gravidanza. Il test richiede una piccola quantità (90 μL) di urina (una goccia di urina è ~30 μL).

1. Metodo del vassoio: se ci sono più di due animali nella stessa gabbia, sposta l'uistitì bersaglio (o gli altri animali) in un'altra gabbia il giorno prima. Metti un vassoio pulito sul fondo della gabbia la sera prima o prima dell'accensione. L'urina non viene drenata dalla vescica durante la notte. Pertanto, l'urina viene solitamente rilasciata dalla vescica poco dopo l'accensione.
   NOTA: Entrare nella stanza al mattino prima dell'illuminazione può interrompere il ciclo del sonno della coorte. L'urina di solito può essere raccolta entro circa 30 minuti dall'accensione.
2. Metodo di spremitura: Preparare i vassoi lavati per la raccolta delle urine. Dopo aver individuato la vescica dell'uistitì, stringerla con cura dalla parte anteriore e da entrambi i lati utilizzando l'intera lunghezza delle dita (Figura 1F). Raccogli l'urina appena prima di illuminare la stanza al mattino.
   NOTA: Se la raccolta delle urine non riesce a causa dell'assenza di urina nella vescica, attendere un po' e riprovare. Fare attenzione a non usare una forza eccessiva perché ciò ferirà l'animale.
3. Immediatamente dopo la raccolta, posizionare il campione di urina nel pozzetto del kit per il test immunocromatografico. Leggere il risultato dopo 10 minuti secondo le istruzioni del produttore.

4. Controllo e determinazione della fase del ciclo ovarico per il prelievo di ovociti, zigoti ed embrioni

1. Raccolta di ovociti della vescicola germinale (GV) dalle ovaie
   1. Somministrare un'iniezione intramuscolare di 3 μL di 0,263 mg/mL di cloprostenolo (un analogo sintetico di PGF2α) diluito in 150 μL di soluzione fisiologica¹⁴ (Figura 2) per ripristinare il ciclo ovarico alla fine della fase luteale (cioè ≥10 giorni dopo l'inizio della fase luteale).
      NOTA: Preparare la soluzione diluita in un volume maggiore può essere conveniente poiché il cloprostenolo diluito rimane stabile per almeno diverse settimane a +4 °C.
   2. Il giorno successivo (giorno 1), confermare l'inizio della fase follicolare controllando che il livello di P4 sia diminuito.
      NOTA: È stato riportato che l'iniezione di cloprostenolo riduce drasticamente i livelli di P4 (di solito <10 ng/mL) entro 24 ore³.
   3. Dal giorno 1, iniettare FSH (25 UI, per via intramuscolare) una volta ogni 2 giorni per un totale di 5 volte (giorni 1, 3, 5, 7 e 9). Il giorno 10, iniettare hCG (75 UI, intramuscolare) nel pomeriggio.
   4. Raccogliere i GV dalle ovaie l'11° giorno mediante aspirazione follicolare in anestesia secondo la letteratura^15,16.
      NOTA: A volte, l'ovulazione avviene prima del previsto. Pertanto, si consiglia di controllare i livelli di CG a partire dall'8° giorno. Se il test CG è positivo, eseguire la raccolta GV in questo giorno.
2. Raccolta di ovociti, zigoti ed embrioni precoci di metafase II (MII)
   1. Reimpostare il ciclo ovarico utilizzando il cloprostenolo come descritto al punto 4.1.1.
   2. Il giorno successivo (giorno 1), confermare l'inizio della fase follicolare controllando che il livello di P4 sia diminuito.
   3. Per la raccolta di zigoti ed embrioni, ospita le femmine di uistitì insieme ai maschi di uistitì per l'accoppiamento dal giorno 6.
   4. Dal 7° giorno, controlla i livelli di P4/E2 nel sangue e i livelli di CG nelle urine delle femmine. Il rilevamento della CG è un'indicazione dell'ovulazione entro pochi giorni (di solito il giorno successivo). Il giorno in cui i livelli di P4 aumentano e i livelli di E2 diminuiscono rispetto al giorno precedente, prelevare gli ovociti MII o gli zigoti embrionali del giorno 0 (E0) dagli ovidotti^17,18.
   5. Per la raccolta degli embrioni, come descritto in letteratura, eseguire il lavaggio dagli ovidotti (E1-E3, 1-8 cellule)^17,18 o dall'utero (E5-E10, 8 cellule-blastocisti)19,20,21,22 al momento opportuno, a seconda dello stadio target.

Risultati

I dettagli relativi agli animali utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella 1.

Analisi anatomiche della vena femorale
Le analisi anatomiche della vena femorale sono state eseguite utilizzando un uistitì comune maschio di 2 anni (I 7713M) sottoposto a eutanasia. Le vene e le arterie femorali si trovano nel triangolo femorale. Il triangolo femorale si forma ai confini tra la parete addominale e i muscoli della c...

Discussione

La localizzazione della vena è il passaggio più critico nella raccolta del sangue. Sulla base di osservazioni anatomiche, questo protocollo introduce l'area prossimale nel triangolo femorale come un sito facile per la raccolta del sangue negli uistitì. Utilizzando quest'area, è possibile eseguire facilmente il prelievo di sangue da una vena di grandi dimensioni. Tuttavia, anche utilizzando questo protocollo, a volte si verificano lesioni a un'arteria. Quando si ferisce un'arteria, si...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AIA-360	Tosoh Corporation	0019945	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK DILUENT CONCENTRATE	Tosoh Corporation	0020956	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK SUBSTRATE SET II	Tosoh Corporation	0020968	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK WASH CONCENTRATE	Tosoh Corporation	0020955	Hormone measurement (P4/E2)
CMS-1	CLEA Japan		Marmoset food
Estrumate	MSD Animal Health		PGF2alpha analog (cloprostenol)
Gonal-f Subcutaneous Injection 150	Merck Biopharma Co., Ltd.		FSH
Gonatropin for intramuscular injection 1000	ASKA Pharmaceutical Co., Ltd.	872413	hCG
Heparin sodium injection solution 5,000 units/5 mL	Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.	224122458	Blood collection
Immunochromatographic Test Kit for Detection of Common Marmoset Chorionic Gonadotropin (Dual Checker)	CLEA Japan, Inc.		Determining CG level
Low-profile double-arm microscope illumination LPF-SD	SHIOKAZE GIKEN		Desk lamp for blood collection
Marmoset blood collection restraint device	JIC Japan	JM-1006	Blood collection http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html email: vi@jic-japan.jp
Metacam 0.05%	Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co., Ltd.		Hematoma treatment
Sample Cup, 3 mL, PS, for Tosoh 360 and AIA-600 II, 1000/Bag	Globe Scientific	110913	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2	Tosoh Corporation	0025224	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 CALIBRATOR SET	Tosoh Corporation	0025324	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 SAMPLE DILUTING SOLUTION	Tosoh Corporation	0025524	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII	Tosoh Corporation	0025240	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII CALIBRATOR SET	Tosoh Corporation	0025340	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII SAMPLE DILUTING SOLUTION	Tosoh Corporation	0025540	Hormone measurement (P4/E2)
Syringe with 25 G (0.50 x 25 mm) needle	TERUMO	SS-01T2525	Blood collection
Tensolvet 5.000 I.E. gel.	Dechra Pharmaceuticals	14033492	Hematoma treatment
TOSOH MULTI-CONTROL SET	Tosoh Corporation	0015965	Hormone measurement (P4/E2)