Generazione e verifica funzionale di cellule T del recettore dell'antigene chimerico sensibili all'ipossia

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per la generazione e la verifica funzionale di cellule T sensibili al recettore chimerico dell'antigene (CAR)-T sensibili all'ipossia. Questo protocollo presenta la generazione di cellule CAR-T sensibili all'ipossia basate su lentivirus e la loro caratterizzazione, inclusa la convalida dell'espressione CAR ipossia-dipendente e della citotossicità selettiva.

Abstract

Studi approfonditi hanno dimostrato la promettenza della terapia cellulare con recettore dell'antigene chimerico T (CAR-T) nel trattamento delle neoplasie ematologiche. Tuttavia, il trattamento dei tumori solidi rimane impegnativo, come esemplificato dai problemi di sicurezza che sorgono quando le cellule CAR-T attaccano le cellule normali che esprimono gli antigeni bersaglio. I ricercatori hanno esplorato vari approcci per migliorare la selettività tumorale della terapia cellulare CAR-T. Una strategia rappresentativa in questo senso è la costruzione di cellule CAR-T sensibili all'ipossia, che sono progettate fondendo un dominio di degradazione dipendente dall'ossigeno con la porzione CAR e sono strategiche per ottenere un'elevata espressione di CAR solo in un ambiente ipossico, il microambiente tumorale (TME). Questo articolo presenta un protocollo per la generazione di tali cellule CAR-T e la loro caratterizzazione funzionale, inclusi metodi per analizzare i cambiamenti nell'espressione di CAR e nella capacità di uccisione in risposta a diversi livelli di ossigeno stabiliti da una camera di incubazione mobile. Si prevede che le cellule CAR-T costruite dimostrino l'espressione e la citotossicità di CAR in modo sensibile all'ossigeno, supportando così la loro capacità di distinguere tra TME ipossico e tessuti normali normossici per l'attivazione selettiva.

Introduzione

La terapia con cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR-T) ha rappresentato una svolta significativa nel trattamento del cancro. Da quando la Food and Drug Administration (FDA) ha approvato la prima terapia CAR-T per il trattamento del linfoma avanzato/resistente e della leucemia linfoblastica acuta nel 2017 ^1,2,3, 10 terapie CAR-T mirate al CD19 o all'antigene di maturazione delle cellule B (BCMA) hanno ricevuto l'approvazione a livello globale⁴. Tuttavia, nonostante un'ampia ricerca,....

Protocollo

In questo studio, HER2-BBz-ODD, un CAR sensibile all'ipossia che ha come bersaglio HER2 (ID gene: 2064) è stato confrontato con la sua controparte regolare, HER2-BBz. Gli schemi dei due CAR sono illustrati nella Figura 1A, che mostra che HER2-BBz-ODD è derivato da HER2-BBz aggiungendo la sequenza ODD al C-terminale di CD3ξ. La costruzione di vettori lentivirali che esprimono i due CAR e la generazione del lentivirus corrispondente mediante trasfezione cellulare 293T è stata precedentemente descritta³¹.

1. Generazione di cellule CAR-T sensibili all'....

Discussione

I problemi di sicurezza sono questioni significative che devono essere affrontate affinché qualsiasi terapia cellulare CAR-T passi all'uso clinico. L'utilizzo delle proprietà uniche delle cellule tumorali o della TME è diventata una direzione di ricerca primaria incentrata sullo sviluppo di cellule CAR-T che colpiscono selettivamente i tessuti tumorali. La progettazione di un CAR-T sensibile all'ipossia è una strategia interessante in questa direzione, con diversi approcci in fase di.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Centrifuge tube	QSP	509-GRD-Q	Supernatants and cells cellection Protocol Step 2,3,4
10% ExpressCast PAGE	NCM biotech	P2012	Immunoblotting Protocol Step 3
10x PBS	NCM biotech	20220812	Cell culture Protocol Step 4
10 mL pipette	Yueyibio	YB-25H	Pipetting Protocol Step 1
10xTRIS-Glycine-SDS electrophoresis buffer	Epizyme	3673020	Immunoblotting Protocol Step 3
15 mL Centrifuge tube	Thermo Scientific	339650	Supernatants and cells cellection Protocol Step 1
25 cm2 EasYFlask	Thermo Scientific	156367	Cell culture Protocol Step 3,4
4x Protein SDS PAGE Loading Buffer	Takara	9173	Immunoblotting Protocol Step 3
6-well flat-bottom tissue culture plates	Thermo Scientific	140675	T Cells culture Protocol Step 1
96-well black flat-bottom tissue culture plates	Greiner	655090	Cytotoxicity assay Protocol Step 4
96-well ELISA plates	Corning	3590	ELISA Protocol Step 5
96-well plate shaker	QILINBEIER	MH-2	Shake Protocol Step 4
96-well U-bottom tissue culture plates	Thermo Scientific	268200	Supernatants cellection Protocol Step 4,5
anti-FLAG antibody	Sigma	F1804-50UG	Immunoblotting Protocol Step 3
Carbinol	Sinopharm	10010061	Immunoblotting Protocol Step 3
Carbon dioxide incubator	Thermo Scientific	360	Cell culture Protocol Step 1,2,3,4
Cell counting plate	Hausser scientific	1492	Cell counting Protocol Step 1,3,4
CELLection Pan Mouse IgG Kit	Thermo Scientific	11531D	Mouse IgG magnetic beads Protocol Step 1
Centrifuge	Thermo Scientific	75002432	Cell culture Protocol Step 1,3,4
Chemiluminescence gel imaging system	BIO-RAD	12003154	Immunoblotting Protocol Step 3
Cobalt chloride solution (0.5 M)	bioleaper	BR4000203	Hypoxic condition Protocol Step 2,3,4
DMEM	Corning	10-103-CV	Cell culture Protocol Step 4
Electronic balance	Sartorius	PRACTUM612-1CN	weigh Protocol Step 5
FBS	BI	04-001-1ACS	Cell culture Protocol Step 3,4
GAPDH Mouse mAb	ABclonal	AC002	Immunoblotting Protocol Step 3
Gel electrophoresis apparatus	BIO-RAD	1645070	Immunoblotting Protocol Step 3
GloMax Microplate Readers	Promega	GM3000	luciferase activity measurement Protocol Step 4
Goat anti-Mouse IgG (H+L)	Yeasen	P1126151	Immunoblotting Protocol Step 3
High speed microfreezing centrifuge	eppendorf	5810 R	Cell culture Protocol Step 1
Human IFN-γ ELISA Set	BD	555142	ELISA Protocol Step 5 Items: Recombinant Human IFN-γ Lyophilized Standard, Detection Antibody Biotin Anti-Human IFN-γ , Capture Antibody Purified Anti-Human IFN-γ, Enzyme Reagent Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP)
Human IL-2 ELISA Set	BD	555190	ELISA Protocol Step 5 Items: Recombinant Human IL-2 Lyophilized Standard, Detection Antibody Biotin Anti-Human IL-2 , Capture Antibody Purified Anti-Human IL-2, Enzyme Reagent Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP)
IL-15	R&D systems	P40933	T Cells culture Protocol Step 1
IL-21	Novoprotein	GMP-CC45	T Cells culture Protocol Step 1
IL-7	R&D systems	P13232	T Cells culture Protocol Step 1
Inverted microscope	Olympus	CKX41	Cell culture Protocol Step 1,3,4
Jurkat	ATCC	TIB-152	CAR-Jurkat construction Protocol Step 3
LSRFortessa	BD	LSRFortessa	Flow cytometry Protocol Step 2
Luciferase Assay System	Promega	E1501	luciferase reporter assay Protocol Step 4 Items: Passive lysis buffer, firefly luciferase substrate
Microplate reader	BioTek	HTX	ELISA Protocol Step 5
mobile CO2/O2/N2 Incubator Chamber	China Innovation Instrument Co., Ltd.	Smartor118	Hypoxic condition Protocol Step 2, 3, 4
Mouse Anti-Hexa Histidine tag	Sigma	SAB2702218	Immunoblotting Protocol Step 3
NcmBlot Rapid Transfer Buffer	NCM biotech	WB4600	Immunoblotting
NcmECL Ultra	NCM biotech	P10300	Immunoblotting Protocol Step 3 Items: NcmECL Ultra Luminol/Enhancer Reagent (A) ,NcmECL Ultra Stabilized Peroxide Reagent (B)
NovoNectin -coated 48-well flat plates	Novoprotein	GMP-CH38	CAR-T cells construction Protocol Step 1
OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) tablet set	Sigma	P9187	Substrate Reagent Protocol Step 5 Items: OPD tablet (silver foil),urea hydrogen peroxide tablet (gold foil)
PE-conjugated anti-DYKDDDDK	Biolegend	637310	Flow cytometry Protocol Step 2
Protamine sulfate	Sigma	P3369-1OG	Lentivirus infection Protocol Step 1
Protein Marker 10 Kda-250 KDa	Epizyme	WJ102	Immunoblotting Protocol Step 3
Purifed NA/LE Mouse Anti-Human CD3	BD	566685	T Cells culture Protocol Step 1
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28	BD	555725	T Cells culture Protocol Step 1
PVDF membrane	Millipore	168627	Immunoblotting Protocol Step 3
RPMI 1640	Corning	10-040-CVRC	Cell culture Protocol Step 3
Skim milk powder	Yeasen	S9129060	Immunoblotting Protocol Step 3
SKOV3-Luc	ATCC	HTB-77	Cytotoxicity assay Protocol Step 4
Trypsin-EDTA	NCM biotech	C125C1	Cell culture Protocol Step 4
Tween 20	Sinopharm	30189328	Immunoblotting Protocol Step 3
Water bath	keelrein	NB014467	Heating Protocol Step 1
X-VIVO 15	LONZA	04-418Q	Serum-free lymphocyte culture medium Protocol Step 1