Imaging a foglio luminoso per rivelare la struttura cardiaca nei cuori dei roditori

Riepilogo

Il protocollo utilizza la microscopia avanzata a foglio di luce insieme a metodi di pulizia dei tessuti adattati per studiare strutture cardiache complesse nei cuori dei roditori, con un grande potenziale per la comprensione della morfogenesi e del rimodellamento cardiaco.

Abstract

La microscopia a foglio luminoso (LSM) svolge un ruolo fondamentale nella comprensione dell'intricata struttura tridimensionale (3D) del cuore, fornendo informazioni cruciali sulla fisiologia cardiaca fondamentale e sulle risposte patologiche. Approfondiamo lo sviluppo e l'implementazione della tecnica LSM per chiarire la microarchitettura del cuore nei modelli murini. La metodologia integra un sistema LSM personalizzato con tecniche di pulizia dei tessuti, mitigando la dispersione della luce all'interno dei tessuti cardiaci per l'imaging volumetrico. La combinazione di LSM convenzionale con approcci di cucitura delle immagini e deconvoluzione multiview consente l'acquisizione dell'intero cuore. Per affrontare il compromesso intrinseco tra risoluzione assiale e campo visivo (FOV), introduciamo inoltre un metodo di microscopia a foglio luminoso a scansione assiale (ASLM) per ridurre al minimo la luce sfocata e illuminare uniformemente il cuore attraverso la direzione di propagazione. Nel frattempo, i metodi di pulizia dei tessuti come iDISCO migliorano la penetrazione della luce, facilitando la visualizzazione delle strutture profonde e garantendo un esame completo del miocardio in tutto il cuore. La combinazione dei metodi LSM e di pulizia dei tessuti proposti presenta una piattaforma promettente per i ricercatori nella risoluzione delle strutture cardiache nei cuori dei roditori, con un grande potenziale per la comprensione della morfogenesi e del rimodellamento cardiaco.

Introduzione

L'insufficienza cardiaca rimane la principale causa di mortalità in tutto il mondo, principalmente a causa della mancanza di capacità rigenerativa dei cardiomiociti maturi¹. L'intricata architettura del cuore svolge un ruolo cruciale nella sua funzione e fornisce informazioni sui processi di sviluppo. Una profonda comprensione della struttura cardiaca è essenziale per chiarire i processi fondamentali della morfogenesi cardiaca e del rimodellamento in risposta all'infarto del miocardio. Recenti progressi hanno dimostrato che i topi neonatali possono ripristinare la funzione cardiaca dopo una lesione, mentre i topi adulti mancano di tale capacità....

Protocollo

I protocolli e gli esperimenti sugli animali sono stati approvati e condotti sotto la supervisione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Texas a Dallas (IACUC # 21-03). In questo studio sono stati utilizzati topi C57BL6, inclusi neonati al giorno 1 postnatale (P1) e adulti di 8 settimane. Non è stata osservata alcuna differenza tra maschi e femmine. Tutta l'acquisizione dei dati e la post-elaborazione delle immagini sono state effettuate utilizzando software o piattaforme open source con licenze di ricerca o didattiche. Le risorse sono disponibili presso gli autori su ragionevole richiesta.

1....

Discussione

Il progresso dei metodi di imaging, calcolo e pulizia dei tessuti ha fornito un'opportunità senza precedenti per studiare ampiamente la struttura e la funzione cardiaca. Ciò ha un grande potenziale per approfondire la nostra comprensione della morfogenesi e della patogenesi cardiaca utilizzando un modello di cuore di roditore intatto. A differenza degli studi in vivo sul cuore del pesce zebra che utilizzano un approccio simile 40,41,42,43, l'integrazione di tecniche LSM avanzate e metodi di pulizia dei tessuti.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Agarose
Low melting point agarose	Thermo Fisher	16520050
Deionized water	-	-
Chemicals for tissue clearing
5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans	Sigma-Aldrich	118184
D.E.R.™ 332	Sigma-Aldrich	31185
D.E.R.™ 736	Sigma-Aldrich	31191
Dibenzyl ether (DBE)	Sigma-Aldrich	33630
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997
Fluorescent beads	Spherotech	FP-0556-2
Hydrogen peroxide (H2O2)	Sigma-Aldrich	216736
Methanol	Sigma-Aldrich	439193
Paraformaldehyde (PFA)	Thermo Fisher	47392
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	79383
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Software and algorithms
Amira	Thermo Fisher Scientific	2021.2
BigStitcher	Hörl et al.22
Fiji-ImageJ	Schindelin et al.20	1.54f
HCImage Live	Hamamatsu Photonics	4.6.1.2
LabVIEW	National Instruments Corporation	2017 SP1
Key components of the customized light-sheet system
0.63 - 6.3X Zoom body	Olympus	MVX-ZB10
10X Illumination objective	Nikon	MRH00105
1X detection objective	Olympus	MV PLAPO 1X/0.25
473nm DPSS Laser	Laserglow Technologies	LRS-0473-PFM-00100-05
532nm DPSS laser	Laserglow Technologies	LRS-0532-PFM-00100-05
589 nm DPSS laser	Laserglow Technologies	LRS-0589-GFF-00100-05
BNC connector	National Instrument	BNC-2110
Cylindrical lens	Thorlabs	ACY254-050-A
DC-Motor Controller, 4 axes	Physik Instrumente	C-884.4DC
ETL	Optotune	EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
ETL Cable	Optotune	CAB-6-300
ETL Lens Driver	Optotune	EL-E-4i
Filter	Chroma	ET525/30
Filter	Chroma	ET585-40
Filter	Chroma	ET645-75
Filter wheel	Shutter Instrument	LAMBDA 10-B
Motorized translation stage	Physik Instrumente	L-406.20DG10
Motorized translation stage	Physik Instrumente	L-406.40DG10
Motorized translation stage	Physik Instrumente	M-403.4PD
NI multifunction I/O	National Instrument	PCIe-6363
sCMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
Stepper motor	Pololu	1474
Tube lens	Olympus	MVX-TLU