Pipeline per lo studio anatomico tridimensionale multiscala del cuore umano

Riepilogo

Questo protocollo presenta una pipeline completa per analizzare campioni ottenuti da cuori umani che abbracciano le scale microscopiche e macroscopiche.

Abstract

Lo studio dettagliato dei cuori umani non falliti rigettati per il trapianto offre un'opportunità unica per eseguire analisi strutturali su scala microscopica e macroscopica. Queste tecniche includono la pulizia dei tessuti (imaging tridimensionale (3D) di organi puliti con solvente abilitati per l'immunomarcatura modificata) e la colorazione immunoistochimica. Le procedure di esame mesoscopico comprendono la dissezione stereoscopica e la tomografia microcomputerizzata (TC). Le procedure di esame macroscopico includono la dissezione macroscopica, la fotografia (compresi gli anaglifi e la fotogrammetria), la TC e la stampa 3D del cuore sezionato fisicamente o virtualmente o dell'intero cuore. Prima dell'esame macroscopico, può essere eseguita la fissazione pressione-perfusione per mantenere l'architettura 3D e la morfologia fisiologicamente rilevante del cuore. L'applicazione di queste tecniche in combinazione per studiare il cuore umano è unica e cruciale per comprendere la relazione tra caratteristiche anatomiche distinte come la vascolarizzazione coronarica e l'innervazione miocardica nel contesto dell'architettura 3D del cuore. Questo protocollo descrive le metodologie in dettaglio e include risultati rappresentativi per illustrare i progressi nella ricerca sull'anatomia cardiaca umana.

Introduzione

Poiché la funzione segue la forma, la comprensione dell'architettura del cuore è fondamentale per apprezzarne la fisiologia. Sebbene numerose indagini abbiano rivelato l'anatomia cardiaca dalla micro alla macroscala ^1,2,3, molte questioni rimangono irrisolte, in particolare quelle relative all'anatomia cardiaca umana. Ciò è in parte dovuto al fatto che gli studi di base incentrati sull'anatomia funzionale hanno generalmente utilizzato cuori di animali ^4,5,6, che sono spesso distinti dai cuori umani ^1,7,8. Inoltre, ogni singolo studio, anche quelli che utilizzano campioni di cuore umano, tende a concentrarsi su strutture molto specifiche, il che rende difficile applicare i risultati nel contesto dell'intero cuore. Questo è ancora più vero se le strutture focalizzate si trovano su micro o mesoscale, come il perinexus⁹ e i plessi gangliari¹⁰.

In questo contesto, lo studio strutturale sistemico del cuore umano rigettato per il trapianto offre un'opportunità unica e rara per ottenere un atlante completo delle strutture cardiache a fuoco su scale microscopiche e macroscopiche¹¹. I protocolli di esame microscopico includono la pulizia dei tessuti (imaging tridimensionale (3D) di organi puliti con solvente abilitati per l'immunomarcatura modificata, iDISCO+)^{12,13 e la} colorazione immunoistochimica. I protocolli di esame mesoscopico includono la dissezione stereoscopica, la macrofotografia e la scansione tomografica microcomputerizzata (TC). I protocolli di esame macroscopico includono la dissezione macroscopica¹⁴, la fotografia (inclusi anaglifi e fotogrammetria)15,16,17, la TC, la dissezione virtuale ¹⁸ e la stampa 3D del cuore sezionato fisicamente o virtualmente o dell'intero cuore¹⁷. In preparazione all'esame macroscopico, viene eseguita la fissazione pressione-perfusione per mantenere l'architettura 3D e la morfologia fisiologicamente rilevante del cuore 14,19,20,21. L'applicazione combinata di queste tecniche è unica e cruciale per correlare caratteristiche anatomiche distinte nel contesto dell'architettura 3D del cuore umano.

Poiché l'opportunità di ottenere un campione di cuore umano non patologico è estremamente limitata, un approccio multiscala qui descritto massimizza l'uso del campione. Applicando le varie procedure descritte di seguito, i risultati rappresentativi illustreranno al lettore come i risultati possano essere utilizzati per molteplici scopi, tra cui la scoperta nella ricerca scientifica¹¹ (analisi complete dell'innervazione cardiaca, distribuzione dei plessi ganglionati), il miglioramento delle procedure cliniche (simulazione per approcci chirurgici e interventistici) e l'educazione anatomica (vera dimostrazione 3D dell'anatomia cardiaca).

Protocollo

Questo studio ha utilizzato campioni di tessuto anonimizzati raccolti da cuori umani di donatori non falliti ed è stato approvato dall'Institutional Review Board dell'Università della California, Los Angeles (UCLA). I campioni sono stati ottenuti da cuori non falliti che sono stati rifiutati per il trapianto. I cuori sono stati perfusi a pressione, fissati in paraformaldeide al 4% (PFA) e sottoposti a imaging prima dell'elaborazione dei tessuti con i seguenti metodi. La Figura 1 riassume il diagramma di flusso dell'ordine dello studio. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Esame su microscala

1. Pulizia dei tessuti utilizzando il protocollo iDISCO+ (Modified Immunolabeling-enabled 3D imaging of solvent-cleared organis).
   1. Sezionare il tessuto fissato al 4% con PFA con un bisturi per adattarlo alla camera da 3 mm × 16 mm × 25 mm per la microscopia confocale. Per visualizzare i tessuti più spessi, è possibile impilare camere e/o distanziatori aggiuntivi sul vetrino.
   2. Disidratare i campioni utilizzando la serie di metanolo graduato (MeOH) (20%, 40%, 60%, 80% e 100% MeOH in H₂O deionizzato [vol/vol]) per 1 ora ciascuno a temperatura ambiente (RT) con agitazione.
   3. Lavare con 100% MeOH per 1 ora a RT e immergere in 66% diclorometano/33% MeOH a RT agitando per una notte.
   4. Il giorno successivo, lavare due volte in MeOH (100%) per 1 ora a RT, raffreddare a 4 °C e trattare con 5% di H₂O₂ in MeOH (vol/vol) per una notte a 4 °C.
   5. Reidratare con la serie di MeOH graduata (80%, 60%, 40% e 20% MeOH) e lavare in 0,01 mol/L PBS per 1 ora ciascuno a RT con agitazione.
   6. Lavare i fazzoletti due volte a 0,01 mol/L PBS con Triton X-100 allo 0,2% per 1 ora a RT.
   7. Prepararsi per l'immunomarcatura mediante permeabilizzazione in 0,01 mol/L di PBS, 20% dimetil solfossido (DMSO), 0,2% Triton X-100 e 0,3 mol/L di glicina per 2 giorni a 37 °C con agitazione.
   8. Bloccare in 0,01 mol/L di PBS con il 10% di DMSO, lo 0,2% di Triton X-100 e il 5% di siero d'asino normale per altri 2 giorni a 37 °C con agitazione.
   9. Etichettare con un anticorpo primario compatibile con MeOH coniugato a fluorofori diluito in PBS 0,01 mol/L con 10 mg/mL di eparina (PTwH), 0,2% Tween-20, 5% DMSO e 3% siero d'asino normale per 3-4 giorni a 37 °C con agitazione.
   10. Reintegrare la soluzione anticorpale e incubare per altri 3-4 giorni a 37 °C con agitazione.
   11. Dopo 1 settimana di incubazione in soluzione di anticorpi primari, lavare da 4 a 5 volte in PTwH durante la notte a RT.
   12. Incubare con anticorpo secondario coniugato a fluorofori diluiti in PTwH, siero d'asino normale al 3% per 3 giorni a 37 °C con agitazione.
   13. Reintegrare la soluzione di anticorpi secondari, incubare per altri 3 giorni a 37 °C con agitazione.
   14. Dopo 6 giorni di incubazione in soluzione di anticorpi secondari, lavare in PTwH 4-5 volte durante la notte a RT.
   15. Disidratare con una serie di MeOH graduata (20%, 40%, 60%, 80%, 100% e 100% MeOH). Il campione può essere conservato per una notte a RT.
   16. Incubare in 66% diclorometano/33% MeOH per 3 ore a RT con agitazione.
   17. Lavare due volte in diclorometano al 100% per 15 minuti a RT con agitazione.
   18. Incubare e conservare i campioni in etere benzilico. Riempire la provetta per ridurre al minimo l'ossidazione del campione da parte dell'aria.
2. Imaging di campioni puliti dal tessuto
   1. Fissare una camera contenente adesivo su un vetrino e applicare lo smalto per unghie attorno al perimetro della camera. Per tessuti più spessi, è possibile impilare camere e/o distanziatori aggiuntivi sul vetrino.
   2. Posizionare il tessuto pulito nella camera, riempirlo con etere benzilico e applicare un vetrino coprioggetti.
   3. Applicare lo smalto intorno al vetrino coprioggetti per creare un sigillo.
   4. Ottenete immagini tilecan e Z stack utilizzando un microscopio confocale a scansione laser verticale con una lente 5x o 10x per ottenere immagini a una profondità fino alla distanza di lavoro della lente.
   5. Immagine con una risoluzione di 1024 x 1024 utilizzando linee laser appropriate per gli spettri di emissione dei fluorofori utilizzati. L'autofluorescenza muscolare è visibile utilizzando la linea laser a 488 nm.
   6. Assicurarsi che la dimensione del passo dell'asse z sia commisurata al campionamento di Nyquist in base all'apertura numerica dell'obiettivo¹¹ specificato.
   7. Unisci le immagini e usa il software per la visualizzazione 3D.
   8. Crea figure utilizzando immagini MIP (Maximum Intensity Projection) di stack Z per canali singoli e uniti (Figura 2).
3. Immunoistochimica
   NOTA: Dopo che il tessuto è stato incorporato in paraffina²², la seguente procedura viene utilizzata per creare vetrini per lo studio immunoistochimico.
   1. Preparazione della soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione (RIMS).
      1. Preparare 0,1 mol/L di tampone fosfato aggiungendo 10,9 g di Na₂HPO₄ (anidro) e 3,1 g di NaH₂PO₄ (monoidrato) all'H₂O deionizzato per un volume totale di 1 L (pH 7,4). Sterilizzare con filtro la soluzione e conservarla in RT.
      2. Diluire il tampone fosfato a 0,02 mol/L.
      3. Sciogliere Histodenz in 30 mL di tampone fosfato 0,02 mol/L agitando la soluzione per 10 minuti con un'ancoretta magnetica nel flacone di conservazione finale che può essere sigillato per ridurre al minimo l'evaporazione e la contaminazione.
      4. Aggiungere sodio azide a una concentrazione totale dello 0,01% (p/v) e regolare il pH a 7,5 con NaOH.
      5. Regola l'indice ricursale variando la concentrazione finale di Histodenz.
      6. Conserva i RIMS presso RT per mesi. Scartare se si nota una contaminazione microbica.
         NOTA: NON sterilizzare in autoclave soluzioni contenenti sodio azide.
   2. Preparazione di vetrini per lo studio immunoistochimico
      1. Crea sezioni di 5 μm di spessore con il microtomo. Applicare la sezione di tessuto ai vetrini carichi.
      2. Rimuovere la paraffina incubando i vetrini in xilene al >75% per 10 minuti. Spostare i vetrini in un secondo contenitore con xilene per altri 10 minuti.
      3. Rimuovere lo xilene immergendo i vetrini in EtOH al 100% per 10 minuti, poi in EtOH al 95% per 5 minuti e EtOH al 70% per 5 minuti.
      4. Sciacquare i vetrini con H₂O deionizzato per 5 min.
      5. Immergere i vetrini nel tampone di recupero dell'antigene per 25 minuti a 90-95^°C.
      6. Lasciare raffreddare il contenitore a RT per 1 ora agitando.
      7. Immergere i vetrini nel tampone di ammollo (0,01 mol/L PBS + 0,4% Triton X-100) per 30 minuti a 4^°C.
      8. Circondare il fazzoletto con una penna PAP. Aggiungere PBS a ciascun vetrino e posizionarlo in una camera umidificata per evitare l'essiccazione.
      9. Lavare i vetrini con PBS a RT agitando per 5 min.
      10. Blocco con tampone bloccante (0,01 mol/L PBS + 10% siero d'asino + 0,1% TX-100) per 1 ora con agitazione.
      11. Incubare con un anticorpo primario diluito in tampone bloccante per una notte a 4^°C.
      12. Il giorno successivo, lasciare che i vetrini si ritirino a RT per 15 minuti.
      13. Lavare i vetrini 3 volte con 0,01 mol/L PBS + 0,2% TritonX-100 per 5 minuti.
      14. Incubare con un anticorpo secondario diluito in tampone bloccante per 1 ora a RT con agitazione.
      15. Lavare i vetrini 3 volte con 0,01 mol/L PBS + 0,2% TritonX-100 per 5 minuti.
      16. Lavare i vetrini 3 volte con 0,01 mol/L di PBS per 5 min.
      17. Posiziona 1 goccia di RIMS con un contagocce e applica un vetrino coprioggetti.
      18. Applicare lo smalto per unghie intorno al vetrino coprioggetti per creare il sigillo.
      19. Come controllo negativo, eseguire un campione senza l'anticorpo primario per dimostrare l'assenza di colorazione specifica.
   3. Vetrini immunocolorati per imaging
      1. Visualizzare i vetrini con un microscopio confocale a scansione laser con obiettivi 10x, 20x e 40x.
      2. Immagine con una risoluzione di 1024 x 1024 utilizzando linee laser appropriate per gli spettri di emissione degli anticorpi secondari utilizzati.
      3. Crea figure utilizzando immagini MIP (Maximum Intensity Projection) di stack Z per canali singoli e uniti (Figura 3).

2. Esame in mesoscala

1. Dissezione stereoscopica
   1. Esegui dissezioni delicate concentrandosi su strutture minuscole o sottili, come il nodo atrioventricolare, l'arteria del nodo atrioventricolare e il plesso nervoso cardiaco (scala da submillimetrica a millimetri) con una lampada da tavolo ingranditrice con morsetto, telescopi chirurgici o stereomicroscopio.
2. Scansione micro-CT
   NOTA: L'imaging TC viene eseguito dopo la perfusione e la fissazione a pressione e in qualsiasi fase della dissezione utilizzando una tomografia a emissione di micropositroni (PET)/scanner CT (Figura 4).
   1. Riscaldare la sorgente di raggi X CT per 25 minuti prima dell'imaging del campione.
   2. Posizionare il campione di cuore sul piano dello scanner.
   3. Spostare il piano dello scanner in una posizione orizzontale di 544 mm e in una posizione verticale di 14 mm per centrare il cuore nel campo visivo (FOV) della TC.
   4. Acquisizione di immagini TC a 80 kVp, 150 μA, con 720 proiezioni durante un tempo di scansione di 1 minuto a una risoluzione spaziale di 200 μm.
   5. Ricostruisci i dati CT con un campo visivo di 12 cm x 12 cm x 10 cm e una matrice di 600 x 600 x 500 voxel e salvali come file DICOM.

3. Esame su macroscala

1. Perfusione e fissazione a pressione
   NOTA: Gli autori modificano le tecniche di perfusione e fissazione pressoria precedentemente descritte e le applicano ai cuori umani non falliti respinti per il trapianto 14,19,20,21.
   1. Utilizzare pompe ad alto flusso per la fissazione della perfusione. Utilizzare il 100% di etanolo¹⁴, il 4% di PFA o il 10% di formalina per il fissativo.
      NOTA: Il cuore viene recuperato con l'aorta ascendente, il tronco polmonare e entrambe le vene cave e polmonari resecate il più distalmente possibile e consegnate nella soluzione²³ dell'Università del Wisconsin.
   2. Utilizzare due cannule chirurgiche da 20-24 Fr per la perfusione del cuore destro e sinistro. Per la perfusione del cuore destro, incannulare la vena cava superiore e posizionare uno sfiato sul tronco polmonare o sull'arteria polmonare con siringhe di plastica da 12-30 ml tagliate a metà con punte Luer-Lock attaccate a rubinetti a tre vie.
   3. Occludere la vena cava inferiore e l'altra arteria polmonare con lo spago dopo aver inserito una siringa di plastica semitagliata bloccata di dimensioni adeguate o una provetta da centrifuga da 1,5-5,0 ml.
      1. Per la perfusione anterograda del cuore sinistro, incannulare una delle vene polmonari e posizionare uno sfiato all'estremità tagliata distale dell'aorta con le siringhe di plastica da 12-30 ml tagliate a metà con punte Luer-Lock attaccate a rubinetti a tre vie.
      2. Per la perfusione retrograda del cuore sinistro, incannulare uno dei rami dell'arco aortico e posizionare uno sfiato in un altro ramo dell'arco aortico. Posizionare le punte delle cannule in entrambi i ventricoli.
   4. Occludere gli altri orifizi dei vasi con lo spago dopo aver inserito una siringa di plastica semitagliata bloccata di dimensioni adeguate o una provetta per microcentrifuga da 1,5-5,0 mL. Utilizzare una garza sottile per coprire la parte di inserimento delle siringhe/tubi/cannule per evitare perdite e scivolamenti. Ripara le perdite di grandi dimensioni usando sutura, fasciatura o agglomerazione. Sono consentite piccole perdite.
   5. Sospendi il cuore in un contenitore di plastica.
   6. Collegare un tubo di plastica morbida da 22-24 Fr a ciascuna cannula e inserire l'altra estremità del tubo nel contenitore riempito di fissativo.
   7. Far circolare il fissativo attraverso i circuiti del cuore destro e sinistro utilizzando una pompa ad alto flusso impostata a circa 100-300 mL/min per il cuore destro e 200-400 mL/min per il cuore sinistro per raggiungere rispettivamente circa 20 mmHg nel ventricolo destro e 80 mmHg nel ventricolo sinistro.
   8. Mantenere la perfusione a 4 °C per 24 ore.
   9. Lavare il cuore con 0,01 mol/L di PBS per 30 minuti agitando quattro volte.
   10. Conservare il cuore in 0,01 mol/L di PBS/0,02% di sodio azide a 4 °C.
       NOTA: La fissazione pressione-perfusione è efficace solo per un cuore fresco, non per un cuore recuperato da un cadavere imbalsamato.
2. Dissezione grossolana
   1. Eseguire la dissezione progressiva con registrazioni fotografiche in ogni fase della dissezione.
   2. Per mantenere la rilevanza clinica, prestare particolare attenzione a evitare di distorcere/deformare qualsiasi struttura per mantenere la morfologia fisiologica del cuore.
   3. Immagine delle strutture target utilizzando l'orientamento clinicamente rilevante, come l'orientamento obliquo anteriore destro.
3. Fotografia
   1. Posizionare il cuore fisso e a pressione su un treppiede con una piattaforma montata con più rebbi e la possibilità di ruotare di 360^o.
   2. Fotografare il cuore utilizzando una fotocamera reflex digitale a obiettivo singolo (Figura 5)²⁴ utilizzando più pannelli luminosi a diodi emettitori di luce posizionati sui cavalletti C e un ampio panno di sfondo nero per piumino.
   3. Fotografare utilizzando l'obiettivo con una lunghezza focale lunga (200 mm) per una distanza di lavoro di 4-6 piedi per ridurre al minimo la distorsione del soggetto¹⁴.
4. Anaglifi
   1. Per visualizzare immagini anaglifiche, ricostruire una coppia di fotografie o immagini renderizzate in volume da set di dati CT con una differenza di 10° nell'angolo di rotazione sul piano orizzontale.
   2. Converti una serie di queste immagini bidimensionali (2D), denominate stereogrammi, in anaglifi utilizzando il freeware¹⁶.
   3. Per visualizzare un anaglifo, utilizzare occhiali rossi/ciano.
5. Fotogrammetria
   NOTA: La fotogrammetria è la scienza applicata alla generazione di una ricostruzione tridimensionale della superficie da più fotografie bidimensionali scattate a varie angolazioni¹⁷.
   1. Sospendi il campione su C-Stand o posizionalo sulla tavola rotante per ottenere centinaia di fotografie multidirezionali con uno smartphone.
   2. Genera il modello 3D in formato FBX utilizzando software disponibili in commercio.
6. Scansione TC
   NOTA: La TAC può essere eseguita dopo la perfusione a pressione e la fissazione e in qualsiasi fase della dissezione.
   1. Sospendi il campione di cuore da una barra posta sulla parte superiore del contenitore. Per evitare che il cuore oscilli durante la scansione, sostenere la base del cuore con rebbi di plastica fissati sul fondo del contenitore. Pertanto, l'aria fungerà da contrasto negativo.
   2. Eseguire la scansione TC utilizzando uno scanner CT multi-rivelatore disponibile in commercio con i seguenti parametri: tensione del tubo di 120 kV, corrente del tubo di 800-900 mA e rotazione del gantry di 280 ms. La lunghezza della dose del prodotto è generalmente di 500-1200 mGy.cm.
   3. Ricostruire i dati dell'immagine assiale utilizzando i seguenti parametri: uno spessore di sezione, 0,6 mm; un intervallo incrementale, 0,3 mm; un campo visivo, il più piccolo possibile (generalmente 100-200 mm); e una matrice, 512 × 512.
7. Dissezione virtuale
   1. Analizza le immagini della scansione TC utilizzando il software disponibile in commercio per generare immagini di dissezione virtuale.
      NOTA: La dissezione virtuale è una modifica del processo di rendering del volume in cui l'attenzione viene spostata sulle pareti delle camere cardiache e dei vasi¹⁸. In questo processo, la soglia manuale rimuove virtualmente la camera migliorata dai set di dati originali.
   2. Visualizza le pareti, i setti e le valvole non migliorate con la dissezione virtuale per produrre immagini simili alla dissezione grossolana. A differenza della dissezione grossolana dei campioni di cuore, i piani di taglio durante la dissezione virtuale sono praticamente illimitati. Quasi tutte le viste possono essere ricreate per visualizzare le strutture di interesse in base alle esigenze.
8. Stampa 3D
   1. Apri il file compatibile del campione di cuore nel software della stampante 3D.
   2. Utilizzare il profilo di 0,10 mm Fast DETAIL per le impostazioni di stampa nella stampante 3D e ridurre la velocità di stampa a 20 mm/s. Abilitare Genera materiale di supporto.
   3. Utilizzare il profilo del filamento TPU per "Impostazioni filamento" nella stampante 3D.
   4. Utilizzare il profilo dell'ugello Original Prusa MK4 Input Shaper 0.4 per "Impostazioni stampante" nella stampante.
   5. Al termine dello slicing, salvare il file BGCODE in un'unità flash USB per la stampa 3D.
   6. Usa il filamento TPU da 1,75 mm per stampare in 3D il campione di cuore umano. Prima della stampa 3D, asciugare il filamento TPU per 6 ore utilizzando un essiccatore di filamenti.
   7. Per ridurre la tensione del filamento durante la stampa 3D, posiziona la bobina di filamento su un supporto per bobina con un cuscinetto incorporato per facilitare la rotazione della bobina di filamento. Esegui la stampa 3D utilizzando una stampante 3D disponibile in commercio con una lamiera di acciaio verniciata a polvere testurizzata.
   8. Al termine della stampa 3D, rimuovere con cautela i materiali di supporto.

Risultati

Esami su microscala
L'applicazione della pulizia dei tessuti consente l'imaging di volumi maggiori di tessuto in 3D utilizzando la microscopia confocale. Nel cuore è possibile visualizzare i gangli contenenti i neuroni cardiaci e il pattern neurale dell'innervazione miocardica (Figura 2). La Figura 3 mostra un'immagine confocale del miocardio del ventricolo sinistro umano immunocolorato per i nervi e le cellule muscolari lisce. Si nota che i...

Discussione

Il presente studio dimostra la pipeline completa per analizzare campioni ottenuti da cuori umani interi. I risultati rappresentativi mostrano esami anatomici su micro-macroscala eseguiti di routine per un singolo cuore. Poiché un campione di cuore umano è estremamente prezioso, un approccio multiscala è ideale ed efficace in modo da non sprecare alcuna parte del campione applicando più protocolli per vari scopi, tra cui la scoperta nella ricerca scientifica, il miglioramento delle procedure cliniche e l'educazione an...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813
3D Viewer	Microsoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lens	Nikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle - Cy3 antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0)	Abcam	ab93680
Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5)	Abcam	ab108986
Anti-TH (tyrosine hydrox ylase)	Abcam	ab1542
Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter)	Synaptic Systems	139 103
Benzyl ether	Sigma-Aldrich	108014
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-10G
Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mm	NinjaTek
Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5	VWR	48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-165-152
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997-100ML
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-500ML
Ethanol, 100%	Decon laboratories	2701
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
GNEXT PET/CT	SOFIE Biosciences
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Histodenz	Sigma-Aldrich	D2158-100G
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Imaging software	Zeiss	ZEN (black edition)
Imaging software	Oxford Instruments	Imaris 10
iSpacer	Sunjin Labs	iSpacer 3mm
KIRI Engine	KIRI Innovation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 880
LEAD-2 - Vertical & Multi-channels Peristaltic Pump	LONGER
Lightview XL	Brightech
Methanol (Certified ACS)	Fischer Scientific	A412-4
Nikon D850	Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4	NinjaTek
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-121
Original Prusa MK4 3D printer	Prusa Research
PAP pen	Abcam	ab2601
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Polycam	Polycam
Primary antibody
PrusaSlicer 2.7.1	Prusa Research
SARA-Engine	pita4 mobile LLC
Scaniverse	Niantic
Secondary antibody
SlowFade Gold Antiface Mountant	Invitrogen	S36936
Sodium azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical Company	7144.8-32
SOMATOM Definition AS	Siemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Telescopes,	Designs for Vision
Stereomicroscope System SZ61	OLYMPUS
StereoPhoto Maker	Free ware developed by Masuji Suto
Superfrost Plus Microscope Slides, Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ML
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4L
Ziostation2	Ziosoft, AMIN