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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La valutazione delle differenze anatomiche tra le sezioni trasversali delle foglie C3 e C4 aiuta a comprendere l'efficienza della fotosintesi. Questo articolo descrive la preparazione e l'esame delle sezioni trasversali delle foglie a mano libera e semisottili, insieme alle avvertenze nella preparazione per le specie di colture Triticum aestivum e Zea mays.

Abstract

La maggiore efficienza della fotosintesi del C4 , rispetto al meccanismo del C3 , deriva dalla sua capacità di concentrare il CO2 nelle cellule della guaina del fascio. L'efficacia della fotosintesi del C4 e l'efficienza intrinseca nell'uso dell'acqua sono direttamente collegate alla quota di cellule fogliari del mesofillo e del fascio, alle dimensioni e alla densità delle guaine dei fasci e alle dimensioni, alla densità e allo spessore della parete cellulare delle cellule della guaina del fascio. L'analisi microscopica rapida di questi caratteri può essere eseguita su sezioni a mano libera e semi-sottili utilizzando la microscopia ottica convenzionale, fornendo preziose informazioni sull'efficienza fotosintetica nelle colture C4 mediante l'identificazione e l'esame di specifici tipi di cellule. Inoltre, vengono mostrati gli errori nella preparazione di sezioni a mano libera e semisottili che influiscono sulle misurazioni anatomiche e sulle diagnosi del tipo di cellula, nonché come evitare questi errori. Questo approccio microscopico offre un mezzo efficiente per raccogliere informazioni sull'acclimatazione fotosintetica alle variazioni ambientali e aiuta nella rapida selezione delle colture per i climi futuri.

Introduzione

La fotosintesi è un processo fondamentale in cui l'energia luminosa viene convertita in energia chimica, fungendo da pietra angolare delle reti trofiche terrestri. La maggior parte delle piante segue la via della fotosintesi C3, in cui il prodotto fotosintetico primario è il composto a tre atomi di carbonio glicerato 3-fosfato. La fotosintesi del C3 si è evoluta oltre 2 miliardi di anni fa nell'atmosfera ricca di CO2 e povera di O21. L'enzima fotosintetico chiave ribulosio 1,5 bisfosfato carbossilasi/ossigenasi (Rubisco), che si è evoluto in queste condizioni, non è ottimale per le attuali condizioni di basso CO2 e alto O2 in quanto reagisce in modo competitivo con O2, avviando la fotorespirazione2. La fotorespirazione è un percorso dispendioso che consuma energia invece di produrla e rilasciare CO2 come sottoprodotto. Di conseguenza, è fondamentale mantenere un'elevata concentrazione di CO2 intorno a Rubisco nei cloroplasti per prevenire l'ossigenazione 3,4. A causa dell'incapacità delle piante di C3 di concentrare la CO2, si verifica un significativo abbassamento di CO2 dall'aria ambiente ai cloroplasti, frenando la fotosintesi e influenzando la crescita delle piante e la produzione di biomassa 2,5,6.

Nelle piante C3, la fotosintesi è limitata dall'ingresso di CO2 attraverso gli stomi, dalla sua diffusione attraverso il mesofillo e dall'attività biochimica degli enzimi fotosintetici. L'ingresso di CO2 è inizialmente limitato dalla conduttanza stomatica, che è controllata dalle condizioni ambientali come la temperatura e l'umidità dell'aria. Quindi la CO2 si diffonde attraverso la fase gassosa e liquida interna della foglia a Rubisco7. Nelle piante C3, tutte le fasi della fotosintesi si verificano nei cloroplasti delle cellule mesofille e le piante devono mantenere un afflusso costante di CO2 dall'atmosfera ai cloroplasti. La dipendenza della disponibilità di CO2 nei cloroplasti dall'apertura stomatica, dall'architettura del mesofillo e dalle caratteristiche delle singole cellule e dei cloroplasti lascia le piante suscettibili ai vincoli ambientali che alla fine influenzano la fotosintesi, come la bassa disponibilità di acqua e le alte temperature 7,8,9,10, evidenziando in particolare la loro vulnerabilità alle condizioni di cambiamento climatico11.

Date le sfide poste dalle inefficienze della via del C3, nonché le limitazioni nel mantenere livelli ottimali di CO2 e la suscettibilità ai fattori ambientali, in alcune piante si è evoluta un'altra via, la via della fotosintesi del C4. Tipicamente, le piante C4 hanno due percorsi biochimici spazialmente separati; la fissazione iniziale della CO2 avviene nelle cellule del mesofillo da parte della fosfoenolpiruvato carbossilasi, che ha una maggiore affinità per la CO2 rispetto al Rubisco e manca anche di attività di ossigenazione. Il prodotto C4 formato viene ulteriormente trasportato alle cellule della guaina del fascio, dove viene decarbossilato, e la CO2 viene nuovamente rilasciata e fissata da Rubisco (fotosintesi C3)12,13,14. La maggiore affinità della PEP carbossilasi con la CO2 e le spesse pareti cellulari delle cellule della guaina del fascio consentono la concentrazione di CO2 nelle cellule della guaina del fascio e, quindi, le piante di C4 riducono al minimo la fotorespirazione segregando spazialmente la fissazione della CO2 e il ciclo di Calvin. L'adozione del percorso C4 mette in evidenza la risposta adattativa della natura ai vincoli ambientali, offrendo approfondimenti sulle potenziali strategie per migliorare la produttività e la resilienza delle colture in condizioni climatiche mutevoli15.

L'anatomia specializzata della struttura fogliare nelle piante C4 è caratterizzata da vene circondate da cellule della guaina del fascio vascolare allargate contenenti cloroplasti e con una disposizione radiale delle cellule del mesofillo in un anello esterno che si modella attorno alle cellule della guaina del fascio. Le cellule del mesofillo si trovano in prossimità delle cellule della guaina del fascio, il che consente un trasporto rapido e continuo dei metaboliti tra i due tipi di cellule. La disposizione di questa cellula è tipica delle piante C4 ed è indicata come anatomia di Kranz16. Nelle specie C3, la specializzazione e la disposizione delle cellule mesofille possono variare, ma le cellule della guaina del fascio sono nettamente più piccole e hanno pochi cloroplasti o nessun cloroplasto. L'anatomia specifica di Kranz consente di concentrare la CO2 nei cloroplasti in cellule della guaina del fascio dove si trova l'enzima C 3-carbossilante Rubisco, ostacolando efficacemente la fotorespirazione 4,17,18. Nonostante la sua disposizione apparentemente complessa, questi cambiamenti si sono verificati indipendentemente più volte nell'evoluzione delle angiosperme, indicando che si tratta di un percorso evolutivo relativamente fattibile 19,20,21, e vari taxa hanno dimostrato di essere in uno stadio intermedio tra il metabolismo del carbonio C3 e C 4, indicato come C3-C 4 o C2, avere capacità di concentrazione e riassimilazione di CO2 22,23,24,25.

Molte piante di C4 sono colture con un'elevata importanza economica e l'ingegneria genetica delle colture C3, come il riso, per migliorare la loro resilienza climatica e garantire la resa è stato un argomento di interesse negli ultimi decenni26,27. Tuttavia, gli sforzi ingegneristici richiedono una comprensione dettagliata dell'anatomia specializzata del C4 e di come controlla la fotosintesi 2,28.

Stabilire l'anatomia del C4 Kranz è un prerequisito per raggiungere l'ambizioso obiettivo di ingegnerizzare la fotosintesi del C4 nelle colture C3 25. Tuttavia, l'attuale comprensione della regolazione dell'anatomia di Kranz e dei metodi per lo screening rapido dei suoi tratti anatomici chiave è limitata, rendendo difficile l'identificazione delle specie ibride. Studi precedenti hanno dimostrato che i tratti chiave che regolano l'efficienza fotosintetica nelle piante C3 e C4 includono la distanza interveinale, il diametro del complesso della guaina del fascio e la dimensione delle celle della guaina del fascio14,29. Questi caratteri possono essere facilmente sottoposti a screening utilizzando sezioni a mano libera e analizzati quantitativamente utilizzando sezioni semisottili. Qui, descriviamo il metodo di valutazione dei tratti che consentono la diagnostica della differenziazione anatomica C3 e C4 attraverso la microscopia incrociata e ottica a mano libera, vale a dire l'area della guaina del fascio, la distanza interveinale e la frequenza delle vene.

Protocollo

1. Condizioni di crescita delle piante

  1. Selezionare il frumento (Triticum aestivum L. Var. Winter Wheat, "Fredis") e il mais (Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam") come piante rappresentative rispettivamente di C3 e C4 . Coltiva entrambe le specie vegetali in una camera di crescita a temperatura controllata dai semi.
  2. Mantenere l'umidità relativa al 55% con la temperatura dell'aria a 25 °C/18 °C (giorno/notte) con un periodo di luce di 12 ore. Mantenere la densità del flusso di fotoni fotosintetici (Q) sulla superficie della pianta a 1200 μmol/m2/s per rappresentare le loro condizioni di crescita naturali. Coltiva tutte le piante a una concentrazione ambiente di CO2 di 400 μmol/mol.
  3. Innaffia le piante ogni 2giorni con acqua distillata e concima con la soluzione di Hoagland 10 giorni dopo l'emergenza della piantina. Coltiva le piante alle condizioni date per 60 giorni e usa foglie completamente espanse per analisi microscopiche.

2. Preparazione e visione delle sezioni a mano libera

  1. Seleziona 3 foglie mature non senescenti da ogni pianta e tienile in acqua distillata. Utilizzando una nuova lama di rasoio su un lato, eseguire un taglio livellante per formare un angolo retto con la superficie della foglia per garantire che le sezioni siano sezioni trasversali rese perpendicolari alla superficie della foglia.
  2. Posizionare il campione di foglia su una lastra di vetro su un pezzo di cera dentale per stabilizzare il campione ed evitare che scivoli. Tagliare muovendo la lama verso il basso sul campione fogliare per tagliare in modo netto le cellule. Conservare le sezioni trasversali in acqua distillata.
  3. Montare i campioni su un vetrino posizionandoli su una goccia d'acqua e coprendoli con un vetrino coprioggetti per la visualizzazione e l'imaging microscopici. Evitare di intrappolare bolle d'aria.
  4. Visualizzate il vetrino con un microscopio ottico composto con ingrandimento 10x e 20x. Salva le immagini come da guida del software, insieme alla relativa scala.

3. Preparazione di sezioni semisottili

  1. Tagliare sezioni di circa 3 mm x 5 mm dalle aree intercostali lungo la nervatura centrale dalle foglie di Z. mays e T. aestivum su una lastra di vetro come al punto 2.2. Assicurarsi che la lunghezza della sezione tagliata scorra lungo la venatura della foglia.
  2. Mettere il materiale vegetale in una siringa con 1 mL di tampone di fissazione (aldeide glutarica al 4% in tampone fosfato 0,1 M, pH = 6,9, Tabella 1).
  3. Tenere la siringa in verticale, rimuovere l'aria e, tenendo un dito sulla punta, pompare la siringa per creare il vuoto. Ripetere l'operazione fino a quando i campioni si trovano sul fondo della siringa, indicando che l'infiltrazione è riuscita.
  4. Trasferire il contenuto della siringa in un flaconcino di vetro etichettato e conservare a 4 °C per 48 ore prima del passaggio successivo (Tabella 2).
  5. Per ogni flaconcino, rimuovere delicatamente il fissativo con una pipetta e aggiungere il tampone fosfato fino a coprire il campione. Lasciare agire per 30 min. Ripeti questo passaggio 3 volte.
  6. Rimuovere il tampone fosfato con una pipetta e aggiungere il tetrossido di osmio (ATTENZIONE) fino a coprire il campione. I campioni e altra materia organica diventeranno neri. Usa i doppi guanti. Lasciare agire per 1 ora.
  7. Rimuovere la soluzione precedente con una pipetta e coprire i campioni con acqua distillata. Lasciare agire per 30 minuti Ripetere questo passaggio 3 volte e utilizzare i guanti doppi.
  8. Rimuovere la soluzione precedente con una pipetta e coprire i campioni con la soluzione di acqua distillata 50/50 ed etanolo. Lasciare agire per 30 min. Ripetere questo passaggio con soluzioni di acqua distillata ed etanolo nelle seguenti serie: 30/70, 20/80, 10/90 e 2x al 100% di etanolo. I campioni in una di queste soluzioni possono essere lasciati per una notte a 4 °C.
  9. Rimuovere la soluzione precedente con una pipetta e coprire i campioni con 1/3 di soluzione di resina-etanolo. Mettere i campioni su una piastra miscelatrice e lasciare agire per 2 ore. Ripetere questo passaggio con soluzioni resina-etanolo nelle seguenti serie: 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 e 2x al 100% di resina. I campioni in una di queste soluzioni possono essere lasciati per una notte a 4 °C.
  10. Coprire le cavità di uno stampo da inclusione piatto (16 cavità, dimensioni della cavità: 14 L x 4,8 L x 3 P (mm)) con resina al 100% e posizionare i campioni su un'estremità della cavità. Prepara etichette di carta scritte a matita per ogni campione e posizionale sull'altra estremità della cavità.
  11. Riempi completamente tutte le cavità con resina al 100% e raddrizza i campioni e le etichette se si sono spostati. Coprire lo stampo con pellicola da incasso, e polimerizzare in forno secondo le linee guida del prodotto in resina acrilica.
  12. Posizionare il blocco polimerizzato con il campione nel portacampioni dell'ultramicrotomo. Tagliare il blocco con un coltello da vetro ruvido fino a quando il tessuto diventa visibile e la resina in eccesso viene eliminata.
  13. Tagliare sezioni semisottili trasversalmente (1 μm) utilizzando un coltello da vetro o diamantato. Raccogliere le sezioni utilizzando un anello di inoculazione metallico dalla superficie dell'acqua e posizionarle su un vetrino. Asciugare il vetrino su una piastra calda (60 °C) per fissare le sezioni sul vetro.
  14. Colorare le sezioni fisse con blu di toluidina (soluzione acquosa all'1%) per 5 s prima di risciacquare con acqua distillata e asciugare nuovamente sulla piastra calda.
    NOTA: Assicurarsi che il processo di fissazione chimica venga eseguito sotto una cappa aspirante. I coltelli di vetro devono essere sostituiti periodicamente per garantire tagli netti che consentano sezioni senza strappi o distorsioni.

4. Imaging dei campioni

  1. Imaging di sezioni di foglie fresche
    1. Configurare il microscopio ottico composto con il software in dotazione come da manuale.
    2. Posiziona il vetrino sul tavolino. Regolare l'oculare e visualizzare la sezione a 10x per ottenere una panoramica, quindi a obiettivi 20x e 40x.
    3. Ad ogni obiettivo, naviga nel canale Live, concentrati sull'area di interesse e individua le cellule della guaina del fascio attorno alla vena.
    4. Una volta messo a fuoco, fai clic sul pulsante Blocca e aggiungi la scala premendo il pulsante Barra della scala nella scheda Strumenti. Salvate l'immagine in formato . Formato TIF per l'analisi delle immagini.
  2. Imaging di sezioni infiltrate di resina
    1. Impostare il microscopio ottico automatizzato in combinazione con il software in dotazione sul computer.
    2. Caricare il canale trasparente e posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio. Metti a fuoco la sezione utilizzando un ingrandimento dell'obiettivo 40x e regola la luminosità per assicurarti che tutte le strutture cellulari siano visibili.
    3. Impostare l'area di posizione della sezione utilizzando la funzione navigatore per assicurarsi che l'intera sezione sia riprodotta e fare clic sul pulsante Unisci .
    4. Fare clic su Fine , quindi su Avvia per consentire al microscopio di visualizzare l'intera sezione. Aprire il software di analisi delle immagini e aprire le tessere scattate dal microscopio.
    5. Utilizzando la funzione Allinea, assicurarsi che le tessere non si sovrappongano. Dopo aver generato l'immagine, regolare il posizionamento, la luminosità e la rotazione utilizzando la scheda Regola.
    6. Stampare la scala sull'immagine prima di salvarla in formato . Formato TIF.
  3. Misurazioni anatomiche con il software ImageJ
    1. Aprire il software ImageJ e caricare l'immagine trascinandola nella finestra.
    2. Utilizzando lo strumento Linea, calibrare la scala come segue: Disegna una linea sopra la barra della scala, scegli Analizza > Imposta scala, modifica la distanza nota alla lunghezza della barra della scala e modifica l'unità di lunghezza all'unità corretta.
    3. Misura il tratto potenziale selezionando lo strumento Linea, tracciando una linea attraverso l'area di interesse e premendo il tasto M .
    4. Per le misurazioni dell'area, selezionare lo strumento di selezione poligonale e disegnare intorno al tessuto di interesse. Concludere premendo il tasto M . Le misurazioni vengono visualizzate come una finestra pop-up, che può essere copiata in un foglio di calcolo per un'ulteriore analisi dei dati.

Risultati

La Figura 1A mostra l'orientamento corretto per il sezionamento della foglia sia per il sezionamento fresco che per la microscopia ottica. Il metodo per tagliare sezioni fresche utilizzando un rasoio su un lato e un foglio di cera dentale può essere visto nella Figura 1B. Le sezioni risultanti sono mostrate nella Figura 1C.

La Figura 2 mostra sezioni a mano libera di foglie ...

Discussione

In questo articolo, discutiamo i metodi quantitativi e qualitativi per misurare l'anatomia delle foglie e i modi in cui possono essere ottimizzati. Inoltre, la metodologia viene applicata a specie di colture rappresentative in modo da determinare quali tratti anatomici sono più utili per distinguere tra sezioni trasversali C3 e C4 . Comprendere questi tratti è essenziale poiché le specie ibride, denominate fotosintesi C2 , stanno diventando una via di ricerca più promettente. Al momen...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Gli autori riconoscono il Programma H2020 dell'Unione Europea (progetto GAIN4CROPS, GA n. 862087). Il Centro di Eccellenza AgroCropFuture Agroecology and new crops in future climates è finanziato dal Ministero dell'Istruzione e della Ricerca dell'Estonia. Desideriamo ringraziare il professor Evelin Loit-Harro per aver fornito i semi di T. aestivum e Z. mays, Paula Palmet e Vaiko Vainola per la loro assistenza nella preparazione delle sezioni trasversali delle foglie, e João Paulo de Silva Souza per l'assistenza nell'analisi. Tutte le immagini sono state ottenute dall'unità di microscopia dell'Università estone di scienze della vita nell'ambito di vari progetti.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO42H2O) purePENTA, CZ10028-24-7
Embedding Film, 7.8 mil Thick, 8 x 12.5, (203 x 318mm)ACLAR, US10501-10
Ethanol, abs. 100% a.r.Chem-Lab NV, BECL00.0505.1000Danger: Highly inflammable liquid and vapour.
EVOS Invitrogen FL Auto 2 Imaging SystemThermo Fisher Scientific, US
Flat Embedding PTFE Mold with Metal Frame, 16 cavitiesPELCO, US10501
Glass vial 2 mlVWR Life Science, US548-0045
Glutaraldehyde 50% solutionVWR Life Science, US23H2856331Danger: Fatal if inhaled. Toxic if swallowed. Causes severe skin burns and eye damage. May cause respiratory irritation. Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.
Histo diamond knifeDiatome, US
LEICA EM UC7Leica Vienna, AT
LR White resin hard gradeElectron Microscopy Sciences, US14383Danger: Causes skin irritation. Causes severe eye irritation May cause respiratory irritation. May cause drowsiness or dizziness Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.
Microscope slidesNormax, PT5470308A
Nikon Eclipse E600 and Nikon DS0Fi1 5 MPNikon Corporation, JP
Osmium Tetroxide (OsO4)Agar Scientific Ltd, GBR1019Danger: Fatal if swallowed, in contact with skin or if inhaled. Causes severe skin burns and eye damage Wear double protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.
Pipette and pipette tipsThermo Scientific, FIKJ16047
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 . 2H2O) purePENTA, CZ13472-35-0
Syringe 10 mlEcoject, DE20010
Toluidine blue, general purpose gradeFisher Scientific, GB2045836

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