Lesione iatrogena ricapitolata: tecnica di elettroescissione per la modellazione della stenosi uretrale nei ratti

Riepilogo

In questo studio, presentiamo un modello di stenosi uretrale di ratto nuovo, efficiente e stabile creato attraverso l'elettroescissione dell'uretra di ratto, che simula efficacemente il danno iatrogeno osservato in contesti clinici.

Abstract

La stenosi uretrale (US) è una condizione clinica comune in urologia, caratterizzata da un'elevata prevalenza e morbilità in tutte le età. Gli attuali trattamenti per l'ecografia, come la dilatazione uretrale e l'uretrotomia interna, non riescono a risolvere completamente la condizione e sono associati ad alti tassi di recidiva e complicanze.

Inoltre, la patogenesi dell'ecografia non è ben compresa. Per esplorare la patogenesi degli Stati Uniti e sviluppare nuove strategie terapeutiche, è fondamentale stabilire un modello standardizzato di ratto che rifletta accuratamente le manifestazioni cliniche. Questo studio delinea un metodo semplice e ripetibile per indurre l'ecografia nei ratti utilizzando un coltello elettrico ad alta frequenza. Il metodo prevede l'esecuzione di un'incisione longitudinale con la lama elettrica impostata su una modalità di taglio misto unipolare a 4 W, che infligge un danno uretrale significativo. L'analisi istopatologica mostra ispessimento dell'urotelio, infiltrazione infiammatoria e fibre di collagene disorganizzate. Questo modello replica efficacemente il danno iatrogeno attraverso l'elettroescissione nell'uretra di ratto. In sintesi, questo studio stabilisce con successo un modello di ratto nuovo, efficiente e stabile di ecografia che imita da vicino lo scenario clinico, fornendo uno strumento prezioso per ulteriori ricerche sui meccanismi e sui nuovi trattamenti per l'ecografia.

Introduzione

La stenosi uretrale (US) è tra le condizioni urologiche più antiche e continua ad essere ampiamente diffusa. Dati recenti suggeriscono che ci sono tra 229 e 627 casi di US ogni 100.000 maschi¹. Coloro che soffrono di ecografia sperimentano una serie di sintomi, tra cui i sintomi del tratto urinario inferiore², il dolore³ e la disfunzione sessuale⁴. Sono disponibili diversi trattamenti medici, come l'uretrotomia, l'uretroplastica e la dilatazione⁵. Tuttavia, questi trattamenti sono spesso complicati da problemi come sanguinamento, infezione e incontinenza, che contribuiscono al carico della malattia e mostrano tassi variabili di recidiva ^6,7. Di conseguenza, l'identificazione degli approcci terapeutici più efficaci rimane una sfida critica per ricercatori e clinici.

L'ecografia è generalmente caratterizzata da un restringimento dell'uretra anteriore causato da fibrosi e cicatrizzazione della mucosa uretrale e del tessuto spongioso circostante⁸. Nonostante la sua prevalenza, le cause e i meccanismi alla base dell'ecografia sono poco compresi e mancano modelli animali adatti per uno studio approfondito. Il danno iatrogeno, principalmente da chirurgia transuretrale, è attualmente la principale causa di ecografia, rappresentando il 41% dei casi⁹. Pertanto, un modello animale ideale per la ricerca statunitense dovrebbe replicare accuratamente le lesioni cliniche comuni, mostrare strette somiglianze genomiche e proteomiche con gli esseri umani e dimostrare efficienza e stabilità. Un tale modello faciliterebbe notevolmente indagini più approfondite sulla patogenesi dell'ecografia e lo sviluppo di trattamenti più efficaci.

Per studiare il processo patogenetico e il meccanismo dei tipi clinici comuni, sono stati sviluppati vari modelli animali utilizzando animali di grandi dimensioni come conigli^10,11, cani¹² e suini^13,14 impiegando tecniche come l'elettrocoagulazione, l'elettroresezione¹⁵ e le iniezioni di bleomicina¹⁶. Tuttavia, questi modelli spesso affrontano sfide a causa delle limitazioni delle dimensioni del campione e delle differenze genetiche rispetto agli esseri umani. Inoltre, è necessario considerare il rapporto costo-efficacia dell'utilizzo di animali di grossa taglia; Nonostante gli elevati costi associati all'assistenza quotidiana, gli animali di grossa taglia comportano anche rischi significativi di infezione, che richiedono cure postoperatorie estese e spese considerevoli. È ben documentato che i roditori condividono caratteristiche fisiologiche e patologiche con l'uomo in molti sistemi di organi. Uno studio recente ha dimostrato l'omologia tra le cellule del tratto urinario degli animali roditori e dell'uomo¹⁷. Inoltre, i costi di acquisto, alloggio e cure postoperatorie dei ratti sono significativamente inferiori a quelli degli animali di grossa taglia¹⁸. Di conseguenza, un modello di ratto degli Stati Uniti è ritenuto adatto; Tuttavia, lo sviluppo di tali modelli nei ratti è stato descritto in modo inadeguato.

Studi precedenti hanno utilizzato strumenti chirurgici come lame o aghi per indurre l'ecografia nei modelli di ratto¹⁹. Questo approccio è stato associato a rischi come il danneggiamento dei vasi sanguigni periuretrali, che porta a un sanguinamento significativo. La natura soggettiva di queste procedure chirurgiche può anche comportare una variabilità nell'entità della lesione meccanica, priva di criteri quantitativi per la modellazione, che può influenzare la valutazione dei risultati della riparazione uretrale nei successivi studi terapeutici.

Alla luce di queste considerazioni, vi è una chiara necessità di sviluppare un ulteriore modello di ratto statunitense. Per stabilire un modello statunitense efficiente, economico e stabile nei ratti, nella nostra ricerca abbiamo impiegato una macchina elettrica a coltello ad alta frequenza. Questo modello faciliterà ulteriori indagini sui meccanismi dell'ecografia e la valutazione di nuovi approcci terapeutici prima di procedere agli studi clinici.

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Protocollo

In questa indagine, sono stati impiegati venti ratti maschi di Sprague-Dawley di 6 mesi, ciascuno del peso di 400-500 g. Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali presso il Quinto Ospedale Affiliato dell'Università Sun Yat-Sen (Numero di approvazione: 00349). Gli animali sono stati alloggiati in una struttura con temperatura e condizioni di illuminazione controllate. Una caratteristica fondamentale della stenosi uretrale è lo sviluppo di cicatrici all'interno dell'uretra. Sulla base della tempistica stabilita per la formazione della cicatrice, che in genere si verifica entro 4 settimane dalla lesione, abbiamo designato la presenza di tessuto cicatriziale distinguibile nell'uretra al segno postoperatorio di 4 settimane come endpoint sperimentale.

1. Preparazione degli strumenti chirurgici

1. Preparare i seguenti materiali chirurgici: catetere rivestito in teflon (0,6 x 1 mm), suture riassorbibili (6-0), forbici da sutura, pinze per tessuti, pinze porta-aghi, pinze lisce, unità elettrochirurgica ad alta frequenza (Figura 1), compreso il pannello della lama elettrica ad alta frequenza, la bisturi elettrochirurgica ad alta frequenza dell'elettrodo e l'asta conduttiva anale (vedi Tabella dei materiali).
2. Pulire l'area chirurgica con salviettine imbevute di alcol contenenti etanolo al 75%.
3. Preparazione per l'utilizzo di un coltello elettrico ad alta frequenza in modalità di taglio elettrico unipolare.
   1. Collegare il coltello elettrico ad alta frequenza all'alimentazione principale da 220 V con messa a terra utilizzando un cavo di alimentazione.
   2. Inserire il manico del coltello sterilizzato a comando manuale e l'asta conduttiva nelle rispettive prese (Figura 1C).
      NOTA: Assicurarsi che tutti i cavi di alimentazione siano collegati saldamente per mantenere la sicurezza dell'ambulatorio.

2. Preparazione dell'animale

1. Aspirare il pentobarbital sodico (60 mg/kg) in una siringa.
2. Fissa il ratto afferrandogli la coda con la mano dominante e tenendo la pelle delle orecchie e del collo con la mano non dominante per assicurarti che sia saldamente fissato.
3. Esporre il basso ventre del ratto e disinfettare l'area utilizzando batuffoli di cotone imbevuti di etanolo al 75%.
4. Inserire l'ago della siringa a circa 1-2 mm accanto alla linea mediana addominale nell'addome inferiore, dirigendolo nella cavità addominale con un angolo di 45°.
   NOTA: Avvertirai una perdita di resistenza quando l'ago penetra nel peritoneo.
5. Tirare delicatamente indietro lo stantuffo della siringa per assicurarsi che non vi siano sangue o liquidi nella siringa.
6. Iniettare lentamente il pentobarbital sodico. Estrarre l'ago, completando l'iniezione, e disinfettare nuovamente il sito con batuffoli di cotone imbevuti di etanolo al 75%.
7. Monitora il ritmo respiratorio del ratto e pizzica la zampa posteriore per verificare la presenza di riflessi.
   NOTA: Verificare che la respirazione del ratto sia regolare e che non mostri riflessi prima di procedere con l'intervento chirurgico.
8. Spremere l'unguento all'eritromicina e immergere un batuffolo di cotone nell'unguento. Applicare l'unguento con il batuffolo di cotone sulle cornee di entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione corneale durante la procedura.
9. Utilizzare un rasoio elettrico per radere il basso addome e il perineo dopo la conferma dell'anestesia.
10. Pulire i peli sciolti dalla zona rasata con un fazzoletto inumidito con soluzione fisiologica.
11. Disinfettare l'area strofinandola due volte con una spugna di garza imbevuta di iodoforo per ridurre al minimo l'irritazione della pelle.
12. Posizionare il ratto profondamente anestetizzato su un termoforo impostato a 37°C in posizione supina. Garantire la sterilità durante le procedure chirurgiche indossando guanti medici.

3. Cateterismo uretrale e procedura di lesione

1. Inserire l'asta conduttiva nell'ano del ratto per stabilire un efficace circuito a circuito chiuso per la macchina elettrica a coltelli ad alta frequenza (Figura 2A).
2. Cateterizzare l'uretra del ratto per facilitare il posizionamento e fornire supporto durante le fasi di post-elaborazione dell'intervento.
   1. Lubrificare il catetere urinario con olio di paraffina.
   2. Esponi il pene stringendo la pelle intorno ad esso per sporgerlo dall'addome.
   3. Disinfettare il pene del ratto con una spugna di garza imbevuta di iodoforo.
   4. Aprire delicatamente l'orifizio uretrale con una pinza liscia e inserire il catetere lubrificato nell'uretra.
   5. Inserire con cautela il catetere rivestito in teflon nell'uretra con il ritmo della contrazione uretrale; evitare qualsiasi inserimento forzato (Figura 2B).
   6. Se si incontra resistenza, tirare delicatamente il pene verso il lato ventrale per regolare l'angolo di curvatura del pene e continuare a far avanzare il catetere nella vescica fino a quando l'urina non fuoriesce (Figura 2C).
   7. Confermare il successo del cateterismo assicurandosi che il pene formi un angolo di circa 45° con l'addome (Figura 2D).
3. Accendi la macchina a lama elettrica ad alta frequenza, fai clic sui pulsanti del pannello del coltello ad alta frequenza per selezionare la modalità di taglio misto unipolare e imposta la potenza su 4 W per le fasi successive di elettroeccitazione del pene strato per strato.
4. Allineare l'incisione con il catetere. Premere il pulsante giallo sull'impugnatura del coltello elettrochirurgico e praticare un'incisione lungo la linea di marcatura del catetere dalla pelle del pene allo strato esterno dell'uretra utilizzando il coltello elettrico fino a quando l'uretra non è esposta (Figura 3A, B).
   NOTA: Assicurarsi di premere il pulsante giallo per l'elettroescissione, non il pulsante blu per l'elettrocoagulazione.
5. Continuare a praticare un'incisione longitudinale di 0,5 cm nell'uretra con il coltello elettrico, assicurandosi di un diametro trasversale di 0,1 cm, fino a quando il catetere è visibile (Figura 3C).
6. Suturare la ferita e la pelle superficiale strato per strato utilizzando suture riassorbibili (6-0) con punti continui o interrotti (Figura 3D,E).
7. Rimuovere il catetere uretrale e riposizionare il pene (Figura 3F).
8. Spegni il coltello elettrico ad alta frequenza e rimuovi l'asta conduttiva dall'ano del ratto.
9. Pulire i materiali chirurgici con salviette imbevute di alcol (etanolo al 75%).

4. Assistenza postoperatoria

1. Posizionare il ratto su un tampone riscaldato (37 °C) e monitorare attentamente il suo recupero dall'anestesia. Presta molta attenzione alle condizioni fisiche del ratto, compreso il ritmo respiratorio, la temperatura corporea e il livello di coscienza.
   NOTA: Non rimettere il ratto nella sua gabbia fino a quando non si osserva il completo recupero.
2. Alloggiare i ratti in una gabbia pulita e riempire la bottiglia d'acqua con acqua aromatizzata con morfina (0,4 mg/kg) per la gestione quotidiana del dolore dopo il recupero.
3. Somministrare farmaci antinfiammatori non steroidei (come Carprofene, 0,5 mg/kg, iniezione sottocutanea) per il pieno recupero dei ratti dal dolore postoperatorio.

5. Valutazione istologica

1. Quattro settimane dopo l'intervento, indurre il riflesso della minzione sollevando la coda dei ratti. Metti il ratto in una scatola per l'eutanasia, apri la valvola del tubo di trasmissione della CO₂ e sopprimi umanamente i ratti con un'overdose di CO₂.
2. Chiudere la valvola dopo aver confermato che il ratto è immobile e non respira e aver osservato che la pupilla è dilatata. Continuare a osservare le condizioni fisiche del ratto per 2 minuti per confermare che l'eutanasia ha successo.
3. Rimuovi il topo dalla scatola dell'eutanasia.
4. Pulire l'area chirurgica e i materiali chirurgici con salviette imbevute di etanolo al 75%.
5. Sezionare l'addome per osservare lo stato di riempimento della vescica e prelevare l'intera uretra.
6. Dopo aver raccolto l'uretra, mettere il ratto in un sacchetto sigillante e conservarlo in un frigorifero a 4 °C per la lavorazione da parte dei tecnici di laboratorio.
7. Valutare morfologicamente l'ecografia per la patologia macroscopica, concentrandosi sul colore e sulla levigatezza del tessuto.
8. Colorare il tessuto uretrale con ematossilina ed eosina (H&E) per visualizzare la struttura della ferita e lo strato di cellule uroteliali.
   1. Immergere i vetrini nello xilene per la deparaffinazione (2 x 5 min).
   2. Reidratare i vetrini in etanolo nell'ordine (100% 1 x 3 min, 95% 1 x 3 min, 85% 1 x 3 min, 75% 1 x 3 min).
   3. Lavare i vetrini in acqua deionizzata (2 min).
   4. Colorare i vetrini con ematossilina (10 min).
   5. Lavare gli scivoli in acqua deionizzata (5 min).
   6. Differenziare i campioni con la soluzione di differenziazione (40 s).
   7. Lavare i vetrini in acqua deionizzata (2 x 3 min).
   8. Colorare i vetrini con eosina (2 min).
   9. Reidratare i vetrini in etanolo in un ordine (100% 1 x 3 s, 95% 1 x 3 s, 85% 1 x 3 s, 75% 1 x 3 s)
   10. Immergere i vetrini in etanolo al 100% (1 min) e trasparentizzare i vetrini con xilene (2 x 1 min).
   11. Aggiungere il balsamo neutro e sigillare con il vetrino coprioggetti.
9. Applicare la colorazione tricromica di Masson sul tessuto uretrale per evidenziare la struttura delle fibre di collagene.
   1. Immergere i vetrini nello xilene per la deparaffinazione (2 x 5 min).
   2. Reidratare i vetrini in etanolo nell'ordine (100% 1 x 3 min, 95% 1 x 3 min, 85% 1 x 3 min, 75% 1 x 3 min).
   3. Lavare i vetrini in acqua deionizzata (2 min).
   4. Colorare i vetrini con la soluzione di ferro ematossilina di Weigert (5 min).
   5. Lavare gli scivoli in acqua deionizzata (5 min).
   6. Colorare i vetrini in Biebrich Scarlet-Acid Fucshin (5 min).
   7. Lavare i vetrini in acqua deionizzata (2 x 3 min).
   8. Colorare i vetrini con una soluzione di acido fosfomolibdico (5 min).
   9. Posizionare i vetrini nella soluzione blu di anilina (5 min). Scartare la soluzione.
   10. Sciacquare i vetrini, disidratarli con alcool e ripulirli in xilene.
   11. Aggiungere il balsamo neutro e sigillare con il vetrino coprioggetti.
10. Eseguire la colorazione in immunofluorescenza utilizzando un anticorpo TGF-β per valutare lo strato di cellule uroteliali.
    1. Aggiungere il tampone di recupero dell'antigene appropriato alla pentola a pressione. Posizionare la pentola a pressione sulla piastra e accenderla a piena potenza.
    2. Una volta raggiunta l'ebollizione, trasferire i vetrini dall'acqua del rubinetto alla pentola a pressione. Far scorrere l'acqua fredda sul fornello e scaldare gli scivoli per 10 minuti.
    3. Spegnere la pentola a pressione e rimuovere le diapositive. Raffreddare i vetrini a temperatura ambiente.
    4. Lavare i vetrini con una soluzione PBS.
    5. Segnare i margini dei campioni con una penna bloccante per liquidi.
    6. Immergere i vetrini in PBS più 0,3% Triton X-100 per 30 min.
    7. Lavare i vetrini in PBS con una leggera agitazione (2 x 5 min).
    8. Bloccare il siero di capra al 10% in PBS a temperatura ambiente (60 min).
    9. Aspirare il tampone bloccante e incubare con anticorpo primario a 4 °C per una notte.
    10. Lavare i vetrini con 1x PBS (3 x 5 min).
    11. Incubare con anticorpo secondario marcato con fluorocromo diluito in tampone di diluizione anticorpale.
    12. Lavare i vetrini con 1x PBS (3 x 3 min).
    13. Montare e sigillare le diapositive.
11. Scansiona digitalmente i vetrini colorati utilizzando un obiettivo 40x in uno scanner per vetrini.
12. Analizzare le immagini e misurare lo spessore dell'urotelio utilizzando il software di riferimento (Tabella dei materiali).
    1. Apri il software.
    2. Fare clic su Computer locale per selezionare le immagini del vetrino colorato.
    3. Fare clic su Misura distanza per misurare lo spessore dell'urotelio.
    4. Registrare i dati sullo spessore dell'urotelio.

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Risultati

Il protocollo delineato in questo studio ha stabilito con successo una stenosi uretrale stabile nei ratti e ha dimostrato un'elevata riproducibilità. La durata media delle operazioni è stata di 20 minuti e non sono emersi problemi tecnici durante le procedure. I campioni uretrali sono stati raccolti con successo 4 settimane dopo la procedura.

Nel gruppo sperimentale, le vesciche dei ratti mostravano segni di sovradistensione, in contrasto con il gruppo di co...

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Discussione

Gli Stati Uniti rappresentano un onere sanitario significativo con un impatto economico sostanziale, che influisce negativamente sul benessere sia psicologico che fisico²⁰. C'è ancora bisogno di un trattamento che non solo curi completamente l'ecografia, ma ne prevenga anche efficacemente la recidiva.

In questo studio, abbiamo utilizzato un modello di ratto per sviluppare un metodo semplice e riproducibile per imitare la lesione uretra...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable sutures (6-0)	KERONG COMPANY	KR2230814
Animal operating pad	Provided by Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
CaseViewer 2.4	3DHISTECH Ltd.
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Proteintech	SA00013-2
H&E Stain Kit	Abcam	ab150669
high-frequency electrosurgical unit	Beijing Taktvoll Technology Company	ES-100v
Masson staining kit	Merck	HT15
needle-holding pliers	RWD Life Science	S15001-11
Paraffin oil	NA	NA
smooth forceps	RWD Life Science	F13019-12
Sodium pentobarbital	Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Sprague–Dawley rat	Guangdong Medical Laboratory Animal Center	GDMLAC-035
suture scissors	RWD Life Science	S15001-11
Teflon coated catheter (0.6 mm x 1 mm)	DGZF new materials company	NA
TGF Beta 1 Polyclonal antibody	Proteintech	21898-1-AP
Tissue scissors	RWD Life Science	S13029-14