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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In questo studio, sono stati sviluppati e caratterizzati idrogel compositi nervo-mimetici che possono essere utilizzati per studiare e capitalizzare il comportamento pro-rigenerativo delle cellule staminali di derivazione adiposa per la riparazione delle lesioni del midollo spinale.

Abstract

La lesione traumatica del midollo spinale (SCI) induce un deficit sensomotorio permanente al di sotto del sito della lesione. Colpisce circa un quarto di milione di persone negli Stati Uniti e rappresenta un problema incommensurabile per la salute pubblica. Sono state condotte ricerche per fornire una terapia efficace; tuttavia, la lesione midollare è ancora considerata incurabile a causa della natura complessa del sito della lesione. Vengono studiate una varietà di strategie, tra cui la somministrazione di farmaci, il trapianto di cellule e i biomateriali iniettabili, ma una strategia da sola ne limita l'efficacia per la rigenerazione. Pertanto, le terapie combinatorie hanno recentemente guadagnato attenzione in grado di mirare a molteplici caratteristiche della lesione. È stato dimostrato che le matrici extracellulari (ECM) possono aumentare l'efficacia del trapianto di cellule per la lesione midollare. A tal fine, sono stati sviluppati e caratterizzati idrogel 3D costituiti da midollo spinale decellularizzato (dSC) e nervi sciatici (dSN) in diversi rapporti. L'analisi istologica delle dSC e delle dSN ha confermato la rimozione dei componenti cellulari e nucleari e le architetture tissutali native sono state mantenute dopo la decellularizzazione. Successivamente, sono stati creati idrogel compositi con diversi rapporti volumetrici e sottoposti ad analisi della torbidità, della cinetica di gelificazione, delle proprietà meccaniche e della vitalità delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo umano (hASC) incorporate. Non sono state riscontrate differenze significative nelle proprietà meccaniche tra i diversi rapporti tra idrogel e matrici del midollo spinale decellularizzate. Gli ASC umani incorporati nei gel sono rimasti vitali per tutta la coltura di 14 giorni. Questo studio fornisce un mezzo per generare idrogel combinatoriali di ingegneria tissutale che presentano ECM nervosamente specifica e cellule staminali mesenchimali pro-rigenerative. Questa piattaforma può fornire nuove informazioni sulle strategie neuro-rigenerative dopo la lesione midollare con indagini future.

Introduzione

Circa 296.000 persone soffrono di lesione midollare traumatica e ogni anno si verificano circa 18.000 nuovi casi di lesione midollare negli Stati Uniti1. La lesione midollare traumatica è comunemente causata da cadute, ferite da arma da fuoco, incidenti stradali e attività sportive e spesso causa la perdita permanente della funzione sensomotoria al di sotto del sito della lesione. Le spese stimate per il trattamento della lesione midollare variano da uno a cinque milioni di dollari per individuo, con aspettative di vita significativamente più basse1. Tuttavia, la lesione midollare è ancora poco conosciuta e in gran parte incurabile, principalmente a causa delle complesse conseguenze fisiopatologiche dopo la lesione2. Sono state studiate varie strategie, tra cui il trapianto di cellule e gli scaffold basati su biomateriali. Sebbene il trapianto di cellule e biomateriali abbia dimostrato un potenziale, la natura multiforme della lesione midollare suggerisce che gli approcci combinatori potrebbero essere più vantaggiosi3. Di conseguenza, molte strategie combinatorie sono state studiate e hanno dimostrato una migliore efficacia terapeutica rispetto ai singoli componenti. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per fornire nuovi biomateriali per la somministrazione di cellule e farmaci3.

Un approccio promettente alla fabbricazione di idrogel naturali è la decellularizzazione dei tessuti. Il processo di decellularizzazione utilizza metodi ionici, non ionici, fisici e combinatori per rimuovere tutti o la maggior parte dei materiali cellulari e nucleici preservando i componenti della ECM. Rimuovendo tutti o la maggior parte dei componenti cellulari, gli idrogel derivati dalla ECM sono meno immunoreattivi per l'ospite dopo l'impianto/iniezione4. Ci sono diversi parametri da misurare per valutare la qualità dei tessuti decellularizzati: rimozione del contenuto cellulare/nucleico, proprietà meccaniche e conservazione della ECM. Per evitare risposte immunitarie avverse, sono stati stabiliti i seguenti criteri: 1) meno di 50 ng di DNA a doppio filamento (dsDNA) per mg di peso secco della MEC, 2) lunghezza del frammento di DNA inferiore a 200 bp e 3) materiale nucleare quasi visibile o assente colorato con 4'6-diamidino-2-fenuilindolo (DAPI)5. Le proprietà meccaniche possono essere quantificate mediante test di trazione, compressione e/o reologia e dovrebbero essere simili al tessuto originale6. Inoltre, la conservazione delle proteine può essere valutata mediante proteomica o saggi quantitativi incentrati sui principali componenti dei tessuti decellularizzati, ad esempio laminina, glicosaminoglicano (GAG) e condroitina solfato proteoglicano (CSPG) per il midollo spinale 7,8. Gli idrogel derivati dalla ECM verificati possono essere ricellularizzati con diversi tipi di cellule per aiutare la terapia cellulare9.

Una varietà di tipi di cellule, come le cellule di Schwann, le cellule di rivestimento olfattivo, le cellule staminali mesenchimali (MSC) derivate dal midollo osseo e le cellule staminali/progenitrici neurali, sono state studiate per la riparazione della LM 10,11,12. Tuttavia, l'uso clinico di queste cellule è limitato a causa di preoccupazioni etiche, scarsa integrazione con cellule/tessuti vicini, mancanza di fonti tissutali per un'elevata resa, incapacità di autorinnovarsi e/o limitata capacità proliferativa 13,14,15. A differenza di questi tipi di cellule, le MSC umane di derivazione adiposa (hASC) sono un candidato interessante perché sono facilmente isolabili in modo minimamente invasivo utilizzando lipoaspirati e si può ottenere un gran numero di cellule16. Inoltre, le hASC hanno la capacità di secernere fattori di crescita e citochine che hanno il potenziale di neuroprotezione, angiogenetica, guarigione delle ferite, rigenerazione tissutale e immunosoppressione 17,18,19,20,21.

Come è stato descritto, sono stati condotti diversi studi 22,23,24 e molto è stato imparato da essi, ma le caratteristiche eterogenee della lesione midollare hanno limitato la loro efficacia nel promuovere il recupero funzionale. Pertanto, sono stati proposti approcci combinatori per aumentare l'efficacia del trattamento per la lesione midollare. In questo studio, gli idrogel compositi sono stati sviluppati combinando midollo spinale decellularizzato e nervi sciatici per una coltura tridimensionale (3D) di hASC. Il successo della decellularizzazione è stato confermato da analisi istologiche e del DNA e diversi rapporti di idrogel compositi nervosi sono stati caratterizzati da cinetiche di gelificazione e test di compressione. La vitalità delle hASC negli idrogel compositi nervosi è stata studiata per dimostrare che questo idrogel può essere utilizzato come piattaforma di coltura cellulare 3D.

Protocollo

I tessuti suini sono stati ottenuti commercialmente, quindi l'approvazione non è stata richiesta dal comitato etico degli animali.

1. Decellularizzazione del midollo spinale suino (tempo stimato: 5 giorni)

NOTA: Eseguire la decellularizzazione utilizzando protocolli precedentemente stabiliti con modifiche25,26. Tutte le procedure devono essere eseguite in una cabina di biosicurezza sterile a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione. Tutte le soluzioni devono essere filtrate in modo sterile utilizzando un filtro per flaconi (dimensione dei pori di 0,2 μm) in flaconi sterilizzati in autoclave. Le procedure da eseguire a 37 °C possono essere eseguite all'interno di un'incubatrice o di un forno pulito impostato a 37 °C.

  1. Preparazione di soluzioni di decellularizzazione
    NOTA: Tutte le soluzioni sono calcolate per 1 L. Gli utenti potrebbero dover regolare il volume finale richiesto in base alle loro esigenze sperimentali.
    1. Diluire 500 mL di tripsina/acido etilendiamminotetraacetico allo 0,05% (EDTA) con 500 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per ottenere lo 0,025% di tripsina/EDTA.
    2. Diluire 300 mL di Triton X-100 al 10% con 700 mL di PBS per ottenere il 3% di Triton X-100. Mescolare 0,56 g di NaCl, 1,31 g di NaH2PO4H2O e 10,85 g di HNa2O4P·7H2O in 1 L di acqua deionizzata per ottenere 100 mM di tampone Na/50 mM di fos.
    3. Mescolare 32,4 g di saccarosio in 1 L di acqua deionizzata per ottenere 1 M di saccarosio. Mescolare 40 g di desossicolato di sodio (SD) in 1 L di acqua deionizzata per ottenere una soluzione SD al 4%. Diluire 6,7 mL di acido peracetico al 15% con 993,3 mL di etanolo al 4%.
  2. Preparazione del midollo spinale suino
    NOTA: I midollo spinali sono stati spediti congelati senza alcuna soluzione e mantenuti a -80 °C fino all'uso.
    1. Scongelare il midollo spinale a 4 °C in frigorifero per 18-24 ore prima della decellularizzazione. Utilizzare forbici sterili per rimuovere con cura la dura madre.
    2. Tagliare il midollo spinale in piccoli pezzi (circa 1 cm di lunghezza). Inserire un pezzo in una provetta da 15 ml o un massimo di tre pezzi in una provetta da 50 ml.
  3. Decellularizzazione del midollo spinale
    NOTA: Dopo ogni fase, le soluzioni di decellularizzazione vengono versate manualmente in un grande becher per essere scartate. Il piccolo filtro autoclavabile in acciaio inossidabile può essere utilizzato per scartare le soluzioni di decellularizzazione senza perdere i tessuti necessari per ogni fase. Il midollo spinale è stato agitato a 83 giri/min, se non diversamente specificato.
    1. Sciacquare il midollo spinale con acqua deionizzata per 18-24 ore a 4 °C e 60 giri/min.
    2. Sciacquare il midollo spinale con tripsina/EDTA allo 0,025% per 1 ora a 37 °C e 40 giri/min. Quindi, sciacquare il midollo spinale con PBS per 15 minuti, 2 volte.
    3. Sciacquare il midollo spinale con Triton X-100 al 3% per 2 ore. Sciacquare il midollo spinale con 100 mM di Na/50 mM di tampone phos per 15 min, 2x.
    4. Sciacquare il midollo spinale con 1 M di saccarosio per 1 ora. Quindi, sciacquare il midollo spinale con acqua deionizzata per 1 ora.
    5. Sciacquare il midollo spinale con il 4% di SD per 2 ore. Quindi, sciacquare il midollo spinale con 100 mM di Na/50 mM di tampone phos per 15 minuti, 2 volte.
    6. Sciacquare il midollo spinale con acido peracetico allo 0,1% in etanolo al 4% per 4 ore. Quindi, sciacquare il midollo spinale con PBS per 1 ora.
    7. Sciacquare il midollo spinale con acqua deionizzata per 1 ora, 2x. Quindi, sciacquare il midollo spinale con PBS per 1 ora.
    8. Liofilizzare il midollo spinale a 0,01 mbar e -56 °C per 3 giorni e conservare all'asciutto fino al momento dell'uso.

2. Decellularizzazione del nervo sciatico suino (tempo stimato: 5 giorni)

NOTA: Eseguire la decellularizzazione utilizzando un protocollo27 precedentemente stabilito. Tutte le procedure devono essere eseguite in una cabina di biosicurezza sterile a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione. Tutte le soluzioni devono essere filtrate in modo sterile utilizzando un filtro per flaconi (dimensione dei pori di 0,2 μm) in flaconi sterilizzati in autoclave. Le procedure da eseguire a 37 °C possono essere eseguite all'interno di un'incubatrice o di un forno pulito impostato a 37°C.

  1. Preparazione di soluzioni di decellularizzazione
    NOTA: Tutte le soluzioni sono calcolate per 1 L. Gli utenti potrebbero dover regolare il volume finale richiesto in base alle loro esigenze sperimentali.
    1. Preparare 50 mM di Na/10 mM di tampone fos mescolando 1,86 g di NaCl, 0,262 g di d NaH2PO4H2O e 2,17 g di HNa2O4P·7H2O in 1 L di acqua deionizzata.
    2. Preparare 125 mM di soluzione di sulfobetaina-10 (SB-10) mescolando 38,4 g di SB-10 in 1 L di tampone fos 50 mM Na/10 mM.
    3. Preparare una soluzione di sulfobetaina-16 (SB-16) al 3% di SD/0,6 mM mescolando 30 g di SD e 0,24 g di SB-16 in 1 L di tampone fos 50 mM Na/10 mM.
  2. Preparazione del nervo sciatico suino
    NOTA: I nervi sciatici sono stati spediti congelati con PBS e mantenuti a -80 °C fino all'uso.
    1. Scongelare il nervo sciatico a 4 °C in frigorifero 18-24 h prima della decellularizzazione.
    2. Tagliare il nervo sciatico in piccoli pezzi (lunghi circa 1 cm). Inserire un pezzo in una provetta da 15 ml o un massimo di tre pezzi in una provetta da 50 ml.
  3. Decellularizzazione del nervo sciatico
    NOTA: Dopo ogni fase, le soluzioni di decellularizzazione vengono versate manualmente in un grande becher per essere scartate e un piccolo filtro in acciaio inossidabile autoclavabile può essere utilizzato per aiutare a scartare le soluzioni di decellularizzazione senza perdere i tessuti necessari per ogni fase. Il nervo sciatico è stato agitato a 15 giri/min se non diversamente specificato.
    1. Sciacquare il nervo sciatico con acqua deionizzata per 7 ore. Quindi, sciacquare il nervo sciatico con 125 mM di sulfobetaina-10 (SB-10) in 50 mM di tampone Na/10 mM di fos per 18 ore.
    2. Sciacquare il nervo sciatico con 100 mM di Na/50 mM di tampone phos per 15 min. Quindi, sciacquare il nervo sciatico con 3% SD/0,6 mM di sulfobetaina-16 (SB-16) in 50 mM Na/10 mM di tampone fos per 2 ore.
    3. Sciacquare il nervo sciatico con 100 mM di Na/50 mM di tampone phos per 15 min, 3x. Quindi, sciacquare il nervo sciatico con 125 mM SB-10 in 50 mM Na/10 mM di tampone phos per 7 ore.
    4. Sciacquare il nervo sciatico con 100 mM di Na/50 mM di tampone phos per 15 min. Quindi, sciacquare il nervo sciatico con il 3% di SD/0,6 mM SB-16 in 50 mM Na/10 mM di tampone phos per 1,5 ore.
    5. Sciacquare il nervo sciatico con 50 mM di Na/10 mM di tampone phos per 15 minuti, 3 volte. Quindi, sciacquare il nervo sciatico con 75 U/mL di desossiribonucleasi (DNasi) per 3 ore senza agitazione.
    6. Sciacquare il nervo sciatico con 50 mM Na/10 mM di tampone phos per 1 ora, 3 volte. Quindi, sciacquare il nervo sciatico con 0,2 U/mL di condroitinasi ABC per 16 ore senza agitazione a 37 °C.
    7. Sciacquare il nervo sciatico con PBS per 3 ore, 3 volte. Liofilizzare il nervo sciatico a 0,01 mbar e -56 °C per 3 giorni e conservare all'asciutto fino al momento dell'uso.

3. Digestione di tessuti decellularizzati e fabbricazione di idrogel compositi (Tempo stimato: 4 giorni)

  1. Tritare o macinare i tessuti decellularizzati in polvere utilizzando forbici o omogeneizzatore. Sterilizzare gli strumenti per tritare o macinare i tessuti utilizzando un'autoclave a 121 °C per 45 min. È applicabile anche il metodo dell'ossido di etilene.
  2. Digerire i tessuti separatamente in una soluzione di acido cloridrico 0,01 N (HCl) contenente 1 mg/mL di pepsina a una concentrazione di 15 mg/mL. I pesi stimati del midollo spinale decellularizzato e del nervo sciatico sono rispettivamente di 50-100 mg e 100-150 mg per pezzo.
  3. Posizionare la barra magnetica e agitare a 500 giri/min e 4 °C per almeno 4 giorni per generare soluzioni pregel.
  4. Mescolare il pregel per il nervo sciatico e il midollo spinale ai seguenti rapporti volumetrici: 2:1, 1:1 e 1:2. Regolare il pH 7,4 utilizzando 1 N di idrossido di sodio (NaOH) e HCl e diluire alla concentrazione desiderata utilizzando terreni M199 e 1x PBS. Incubare a 37 °C per 30 min.
    NOTA: Aggiungere NaOH 1 μl alla volta. Il terreno M199 può essere utilizzato come indicatore di pH poiché diventa rosa chiaro quando il pH è 7,4, ma è necessario utilizzare strisce di pH per confermare il livello di pH.

4. Verifica della decellularizzazione

  1. Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E; Tempo stimato: 8 giorni)
    NOTA: Dopo ogni fase di risciacquo, le soluzioni vengono versate manualmente in un grande becher per essere scartate.
    1. Fissare il midollo spinale e il nervo sciatico freschi e decellularizzati in formaldeide al 3,7% a 4 °C per 18 ore. Mettere un pezzo in una provetta da 15 mL.
    2. Rimuovere la formaldeide e mettere i fazzoletti in saccarosio al 10% per 1 giorno. Rimuovere il 10% di saccarosio e mettere i fazzoletti nel saccarosio al 30% per 6 giorni.
    3. Riempire a metà un criomold di dimensioni adeguate con temperatura di taglio ottimale (OCT). Posizionare i tessuti decellularizzati, coprirli con OCT e lasciarli assorbire per 1 giorno.
    4. Dopo 1 giorno, congelare i tessuti per una notte a -80 °C. Criosezione dei tessuti a 10 μm di spessore utilizzando un criostato.
    5. Risciacquare con 1x PBS per 5 min, 2x. Quindi, sciacquare con acqua di rubinetto per 5 minuti.
    6. Colorare con la soluzione di ematossilina per 1 min. Sciacquare con acqua di rubinetto per 1 minuto, 3 volte.
    7. Colorare con la soluzione di eosina per 1 min. Sciacquare con etanolo al 95% per 1 minuto, 2 volte e con etanolo al 100% per 1 minuto, 3 volte.
    8. Risciacquare con xilene per 1 minuto, 2 minuti e poi 1 minuto. Lasciare asciugare i vetrini per 5 minuti.
    9. Utilizzare un batuffolo di cotone per gocciolare 3-4 gocce di soluzione di montaggio di polistirene xilene dibutilftalato (DPX) sui vetrini. Posizionare i vetrini coprioggetti sopra i vetrini ricoperti di DPX. Lasciare asciugare i vetrini per una notte.
  2. Analisi del DNA (Tempo stimato: 1 h)
    1. Pesare tessuti decellularizzati e liofilizzati. Isolare e quantificare il DNA utilizzando i kit disponibili in commercio secondo le istruzioni del produttore.

5. Caratterizzazione di idrogel compositi

  1. Test di torbidità di gelificazione (Tempo stimato: 1 h)
    1. Mettere 100 μL di soluzioni di pregel in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti su ghiaccio. Leggere l'assorbanza a 405 nm ogni 2 minuti per 45 minuti utilizzando un lettore di piastre.
    2. Calcolare l'assorbanza normalizzata utilizzando la seguente equazione:
      (Assorbanza -Assorbanza iniziale) / (Assorbanzamassima - Assorbanzainiziale)
    3. Calcola la pendenza della curva e il tempo per ottenere una gelificazione del 50% e del 95%, rispettivamente t1/2 e t95.
  2. Test di compressione (tempo stimato: 1 min per idrogel)
    1. Fabbricare idrogel compositi alla concentrazione di 12 mg/mL con diametro di 8 mm e altezza di 2 mm.
    2. Utilizzare un reometro per comprimere i campioni con un carico di 250 N tra piastre parallele in acciaio inossidabile a una velocità di deformazione del 10% dell'altezza del campione/min. Il software che fornisce le letture del reometro fornirà una curva sforzo-deformazione applicando la forza e misurando la deformazione fino alla rottura degli idrogel.
    3. Calcola il modulo di Young dalla pendenza della regione lineare delle curve sforzo-deformazione.

6. Coltura tridimensionale di ASC umane in idrogel compositi nervosi

  1. Allestimento della piattaforma tridimensionale (3D) (Tempo stimato: 3 h)
    1. Incidere il wafer di silicio con il fotoresist SU-8 per generare modelli circolari di 200 μm di profondità e 4 mm di diametro.
    2. Miscelare la base di polidimetilsilossano (PDMS) e l'agente indurente in un rapporto di 10:1. Versare il composto sul wafer di silicone e lasciarlo riposare per 20 minuti per rimuovere tutte le bolle che derivano dalla miscelazione della base PDMS e dell'agente indurente.
    3. Mettere in forno e polimerizzare per 2 ore a 70 °C. Sformare il foglio PDMS polimerizzato e punzonarlo utilizzando un punzone per biopsia di 8 mm di diametro per realizzare micropozzetti PDMS.
    4. Posizionare i micropozzetti in una piastra da 96 pozzetti e mettere la piastra a pozzetti in un pulitore al plasma ad aria per sterilizzare i micropozzetti PDMS.
    5. Funzionalizzare i micropozzetti PDMS con polietilenimmina (PEI) all'1% e glutaraldeide (GA) allo 0,1% rispettivamente per 10 minuti e 20 minuti. Lavare i micropozzetti con acqua distillata, 2x.
  2. Preparazione di hASC (Tempo stimato: 7 giorni)
    1. Cellule di passaggio di coltura per 2-5 passaggi nei terreni di crescita delle hASC (terreni basali delle hASC integrati con siero fetale bovino (FBS) e penicillina/streptomicina (Pen-strep)) fino a quando non sono confluenti. Passaggio e calcolo del numero di cellule utilizzando un ematocitometro o un contatore di cellule.
  3. Idrogel compositi nervosi carichi di ASC (Tempo stimato: 2 h)
    1. Mescolare il pregel del nervo sciatico e del midollo spinale con un rapporto volumetrico di 2:1, 1:1, 1:2 e preparare l'idrogel del solo midollo spinale senza mescolare alcun pregel del nervo sciatico.
    2. Aggiungere il terreno M199 e regolare il pH 7,4 utilizzando 1 N NaOH e HCl. Risospendere le hASC con i terreni di crescita nel pregel a una densità di 1 x 106 cellule/mL.
      NOTA: La quantità di M199 e la sospensione cellulare devono essere pari al 10% di pregel.
    3. Diluire il pregel a 12 mg/mL utilizzando 1x PBS. Posizionare il pregel su micropozzetti e incubare per 30 minuti. Coltura di idrogel carichi di ASC in terreni di crescita hASC.
  4. Test di vitalità cellulare (tempo stimato: 4 ore al giorno)
    1. Preparare le soluzioni per i test di vitalità utilizzando i reagenti disponibili in commercio secondo le istruzioni del produttore.
    2. Aspirare i terreni nei giorni 1, 4, 7 e 14. Aggiungere il reagente ai pozzetti e incubare a 37 °C per 3 ore seguendo le istruzioni del produttore.
    3. Lettura della fluorescenza ad eccitazione/emissione di 560/590 nm utilizzando un lettore di piastre. Calcola la differenza percentuale utilizzando la seguente equazione:
      [(campione di fluorescenza -bianco di fluorescenza) /bianco di fluorescenza] x 100

Risultati

I tessuti decellularizzati sono stati preparati utilizzando protocolli precedentemente stabiliti con lievi modifiche26,27. Dopo la decellularizzazione, la liofilizzazione e la digestione, sono stati fabbricati idrogel compositi nervosi con rapporti SN:SC = 2:1, 1:1, 1:2 e idrogel solo del midollo spinale (Figura 1). La rimozione dei componenti nucleari è stata confermata dalla colorazione H&E (

Discussione

È opinione diffusa che la fisiopatologia della lesione midollare sia complessa e sfaccettata. Anche se singole terapie come il trapianto di cellule, la somministrazione di farmaci e i biomateriali hanno fornito preziose informazioni sulla lesione midollare, la natura complicata della lesione midollare può limitarne l'efficacia individuale 28,29,30,31. Pertant...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla PhRMA Foundation e dal National Institutes of Health attraverso il premio numero P20GM139768 e R15NS121884 assegnato a YS. Vogliamo ringraziare il Dr. Kartik Balachandran e il Dr. Raj Rao del Dipartimento di Ingegneria Biomedica dell'Università dell'Arkansas per averci permesso di utilizzare le loro apparecchiature. Inoltre, vogliamo ringraziare il Dr. Jin-Woo Kim e il Sig. Patrick Kuczwara del Dipartimento di Ingegneria Biologica e Agraria dell'Università dell'Arkansas per aver fornito formazione sui reometri.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
3-(Decyldimethylammonio)propane sulfonate inner saltSigma-AldrichD4266Used during sciatic nerve decellularization, SB-10
3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propane sulfonateSigma-AldrichH6883Used during sciatic nerve decellularization, SB-16
AlamarBlue reagentFisher ScientificDAL1100Used during AlamaBlue cell viabiiltiy test
Chondroitinase ABCSigma-AldrichC3667Used during sciatic nerve decellularization
CryostatLeicaCM1860
DeoxyribonuclaseSigma-AldrichD4263Used during sciatic nerve decellularization
Disodium hydrogen phosphate heptahydrateVWRBDH9296Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
DNeasy Blood & Tissue kitQiagen69506Used during DNA analysis
Dpx Mountant for histology,slide mounting mediumSigma-Aldrich6522Used during H&E staining
EosinSigma-AldrichHT110216Used during H&E staining
EthanolVWR89125-172
FormaldehydeSigma-Aldrich252549Used during H&E staining
Glutaraldehyde (GA)Sigma-AldrichG6257Used during PDMS surface functionalization
hASC growth mediaLonzaPT-4505Used to culture hASCs, containing of fetal bovine serum and penicilin/streptomycin
HematoxylinVWR26041-06Used during H&E staining
human adipose-derived stem cellLonzaPT-5006
Hydrochloric acid (HCl)Sigma-Aldrich320331Used to digest decellularizied tissues and adjust pregels solutions
M199 mediaSigma-AldrichM0650Used to dilute pregels to desired concentration
Optimal cutting temperatue compoundTissue-Tek4583
PepsinSigma-AldrichP7000Used to digest decellularized tissues
Peracetic acidLab AlleyPAA1001Used during spinal cord decellularization
Phosphate buffered saline (PBS)VWR97062-948
Plate readerBioTek InstrumentsSynergy Mx
Polyethyleneimine (PEI)Sigma-Aldrich181978Used during PDMS surface functionalization
Porcine sciatic nerveTissue Source LLCLive pigs, with no identifiable information and no traceability details
Porcine spinal cordTissue Source LLCLive pigs, with no identifiable information and no traceability details
QuantiFluor dsDNA systemPromegaE2670Used to analyze DNA contents
RheometerTA InstrumentsDHR 2
Rugged rotatorGlas-co099A RD4512Used during spinal cord decellularization
Sodium chloride (NaCl)VWRBDH9286Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateVWRBDH9298Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
Sodium hydroxide solution (NaOH)Sigma-Aldrich415443Used to adjust pregels solutions
SU-8Kayaku advnaced materialsSU8-100Used to coat silicon wafer
SucroseSigma-AldrichS8501Used during spinal cord decellularization
Sylgard 184 silicone elastomer kitDOW1317318Polydimethylxiloxane (PDMS) base and curing agent
Triton X-100Sigma-AldrichX100Used during spinal cord decellularization
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermo Fisher25300062Used during hASC work and during spinal cord decellularization
Tube revolver rotatorThermo Fisher88881001Used during sciatic nerve decellularization
XyleneVWRMK866816Used during H&E staining

Riferimenti

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