Modello portante senza tensione dell'osteonecrosi indotta da steroidi della testa del femore nei ratti

Riepilogo

Il protocollo mostra la costruzione di un modello di allenamento con carico nel ratto semplice ed economico per l'osteonecrosi indotta da steroidi della testa del femore utilizzando un nastro terapeutico elastico.

Abstract

A differenza degli esseri umani, i ratti sono animali che camminano a quattro zampe, mentre gli esseri umani sono animali bipedi che stanno in piedi e i fianchi sono sottoposti a un'enorme pressione quando camminano e stanno in piedi. Nei modelli di necrosi della testa del femore indotta da steroidi nel ratto, spesso è necessario simulare le caratteristiche biomeccaniche dell'anca umana sotto pressione più elevata. Alcuni studiosi cercano di emulare lo stato della pressione dell'anca umana facendo sopportare ai ratti un certo peso, ma fissare l'oggetto portante sul ratto è difficile. I ratti possono facilmente liberarsi dall'immobilizzazione e attaccare il peso sui ratti con del nastro adesivo causerà il soffocamento o la morte dei ratti a causa dell'ostruzione intestinale. Il nostro gruppo di ricerca ha utilizzato il nastro terapeutico elastico per eseguire l'immobilizzazione senza tensione di oggetti portanti nei ratti in modo che i ratti potessero respirare liberamente e non staccarsi dall'immobilizzazione in condizioni di carico. Rispetto al consueto modello di ratto con necrosi della testa del femore indotta da steroidi, abbiamo scoperto che questo intervento di carico può aggravare la progressione della necrosi della testa del femore nei ratti.

Introduzione

La somministrazione di glucocorticoidi è il fattore di rischio più comune per l'osteonecrosi non traumatica della testa del femore (ONFH)¹. Numerose prove suggeriscono che, oltre ai glucocorticoidi, anche il carico di pressione sull'articolazione dell'anca nei pazienti è associato all'insorgenza di ONFH. Fattori come il peso corporeo e l'intensità del lavoro fisico sono riconosciuti come fattori di rischio per l'ONFH². Diversi studi clinici hanno dimostrato una stretta relazione tra le condizioni di carico dell'articolazione dell'anca e la tempistica e l'incidenza della sostituzione articolare 3,4,5,6. Pertanto, stabilire un modello che rifletta la relazione tra carico e osteonecrosi indotta da steroidi della testa del femore (SONFH) è importante per un'indagine completa di questa condizione.

I grandi uccelli bipedi, come gli struzzi e gli emù, fungono da buoni modelli per simulare lo stress dell'articolazione dell'anca, assomigliando ai carichi delle gambe umane ^7,8. Tuttavia, il mantenimento di specie di uccelli di grandi dimensioni è impegnativo e i costi di ricerca associati sono elevati. I modelli di ratto spontaneamente ipertesi ^9,10 possono mostrare tassi più elevati di ONFH, ma il carico di pressione compartimentale nel midollo generato dall'ipertensione spontanea differisce significativamente dalla pressione meccanica e non è adatto per studiare l'impatto della pressione meccanica su SONFH.

I modelli di piccoli animali sono comunemente usati nella ricerca su SONFH. Tuttavia, i rettili quadrupedi hanno uno stress minore dell'articolazione dell'anca e i loro modelli dell'anca non possono simulare l'ambiente biomeccanico delle articolazioni dell'anca umana durante la camminata bipede. I modelli di immobilizzazione a singolo arto¹¹ e i modelli a scarico parziale¹² sono comuni, ma entrambi riducono il carico dell'arto. Poiché gli esseri umani sono organismi bipedi con notevoli carichi sugli arti inferiori mentre si sta in piedi e si cammina, la riduzione del carico in questi modelli diminuisce la connessione tra i modelli animali e le malattie umane.

Questo studio mira a stabilire un modello semplice ed economico per l'allenamento con i pesi per studiare l'impatto dell'allenamento con i pesi sull'osteonecrosi indotta da steroidi della testa del femore nei ratti. Attualmente, i modelli di ratto sono stati utilizzati per studiare l'osteonecrosi indotta da steroidi della testa del femore^13,14, ma non esiste ancora un modello in grado di fornire una fissazione sicura a lungo termine con un'interruzione minima del movimento, che è anche relativamente semplice ed economico. In questo studio, viene applicato un materiale di fissaggio ad alta adesività, adottando una fissazione senza tensione, che mantiene la mobilità dei ratti e riduce la sofferenza e persino la morte causate da una fissazione impropria.

Protocollo

Il protocollo aderisce alle linee guida etiche stabilite dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) presso l'Università di Medicina Cinese di Pechino, numero di protocollo BUCM-4-2022062001-2109. Il protocollo utilizza ratti Sprague Dawley (SD) (SCXK(Jing)2019-0008), di età compresa tra 8 e 10 settimane e del peso di 200 g-250 g.

1. Formazione all'adattamento

1. I ratti albini hanno generalmente un raggio visivo inferiore a 60 cm¹⁵. Durante il processo di modellazione, posizionare i ratti in gabbie opache e tenerli il più lontano possibile dai ratti non modellati (almeno, gli altri ratti dovrebbero essere al di fuori del massimo raggio visivo dei ratti modellati) per evitare che subiscano stress traumatico.
2. Accendere l'alimentazione e impostare il tapis roulant a 10 m/min con un'inclinazione di 0°. Posiziona i ratti sul tapis roulant e assicurati che i movimenti siano il più delicati possibile per evitare lo stress. Non utilizzare ulteriori stimolazioni; I ratti strisciano naturalmente in avanti perché non hanno familiarità con l'ambiente.
3. L'allenamento dura 15 minuti. Dopo l'addestramento, pulisci le feci e l'urina lasciate dai ratti e spruzza alcol per eliminare l'odore dell'animale. Quindi, prepara il prossimo ratto per l'addestramento.
   NOTA: Se un ratto si rifiuta di camminare sul tapis roulant per 5 minuti, escluderlo dallo studio.
4. Continua l'allenamento adattivo fino alla fine della^1a settimana.

2. Misurazione della capacità di carico massima nei ratti

1. Preparare due provette, un gancio e un anello di fissaggio lungo circa 80 cm. Posizionare le sfere d'acciaio nelle provette, assicurandosi che il peso iniziale combinato delle provette, del gancio e della chiusura ad anello sia di 150 g. Preparare provette con pesi totali diversi con incrementi di 10 g, con un peso massimo di 350 g.
2. Un ricercatore usa entrambe le mani per legare i ratti usando i guanti (Figura 1). Un altro ricercatore posiziona la provetta sul retro del ratto a circa 1 cm dalla linea mediana della schiena. Poiché questo passaggio non richiede il movimento del ratto, eseguire il fissaggio semplicemente avvolgendo il dispositivo di fissaggio a strappo attorno al ratto senza utilizzare misure aggiuntive per fissare il tubo.
3. Cambia il tubo fino a raggiungere il peso massimo del ratto. Quando il ratto raggiunge il massimo carico, non può stare in piedi quando viene pungolato o lo sperimentatore se ne va. Ridurre il peso di 10 g per consentire al topo di stare in piedi. Questo peso rappresenta la capacità di carico massima del ratto.

3. Preparazione del carico di peso

1. Poiché durante l'allenamento è necessaria una fissazione sicura, fissare gli oggetti utilizzando un nastro terapeutico elastico da 1-1,5 m in base alle dimensioni del ratto, che ha una forte adesione. Utilizzare l'argilla per regolare il peso delle provette per ridurre l'oscillazione del carico.
2. Dopo aver pesato il peso delle provette e degli oggetti di fissaggio, aggiungere una quantità adeguata di argilla nelle provette per adattarle al peso target. Utilizzare un'asta di vetro per mescolare per distribuire uniformemente l'argilla all'interno delle provette. L'argilla concentrata a un'estremità della provetta può farla staccare facilmente durante l'allenamento.
3. Regolare il peso totale delle provette e dell'argilla regolate al 50% della capacità di carico massima del ratto (Figura 1A). Il superamento di questo peso renderà difficile per il ratto completare l'addestramento. Non regolare nuovamente il peso del carico fino alla fine dell'esperimento.

4. Stabilire l'osteonecrosi indotta da steroidi del modello di testa del femore

1. Utilizzare il metodo del metilprednisolone combinato con il lipopolisaccaride (LPS+MPS) per lo stabilimento del modello SONFH^16,17. Eseguire l'iniezione intraperitoneale di LPS (20 μg/kg) utilizzando un ago standard sulla linea mediana dell'addome del ratto una volta ogni 24 ore, per un totale di 2 iniezioni.
2. Dopo l'ultima iniezione di LPS, iniettare MPS (40 mg/kg) nel muscolo gluteo unilaterale 24 ore dopo l'alimentazione regolare e continuare le iniezioni ogni 24 ore, alternando le due aree glutee, per un totale di tre iniezioni.

5. Immobilizzazione del carico senza tensioni con nastro terapeutico elastico e allenamento su tapis roulant

1. Segna la linea mediana posteriore del ratto a 1-2 cm su entrambi i lati; Questo è il punto di riferimento per il carico di peso. Assicurarsi che i segni siano posizionati in modo appropriato per evitare che il ratto si ribalti o ostacoli il movimento durante l'allenamento sul tapis roulant.
2. Con un investigatore che fissa il ratto usando i guanti, metti una mano sotto l'ascella del ratto per fissare l'arto anteriore e la mascella mentre l'altra mano fissa gli arti posteriori e la coda. Evitare una forza eccessiva per evitare stress o soffocamento (Figura 1B).
3. Far aderire il nastro terapeutico elastico alla provetta senza applicare tensione per fissare il carico sulla schiena del ratto. Durante il processo di avvolgimento, non allungare il nastro terapeutico elastico per ottenere un fissaggio senza tensioni.
   NOTA: Il nastro terapeutico elastico utilizzato in questo modello è progettato per il taping durante le attività fisiche intense, fornendo un'elevata adesione ed elasticità¹⁸. Grazie alla sua elevata elasticità, riduce notevolmente l'impatto sul movimento del ratto durante il gattonamento.
4. Chiedi al secondo investigatore di fissare la provetta alla schiena del ratto parallelamente alla colonna vertebrale del ratto, con la posizione di fissazione basata sui segni fatti, cioè a 1-2 cm di distanza dalla linea mediana su entrambi i lati della schiena del ratto.
5. Per ridurre al minimo la sofferenza del ratto, ridurre l'impatto sul movimento del ratto e diminuire la mortalità causata dalla fissazione, eseguire la fissazione senza applicare tensione. Attaccare la provetta con il peso regolato sul nastro terapeutico elastico, quindi avvolgere la provetta attorno al corpo del ratto utilizzando una tecnica senza tensione.
6. Garantire un'immobilizzazione senza tensione e mantenere la lunghezza originale del nastro terapeutico elastico senza allungamento al fine di prevenire effetti negativi sulla respirazione e sul movimento del ratto (Figura 1C).
7. Dopo aver avvolto la provetta attorno al corpo del ratto, posiziona il ratto in uno spazio aperto o in una gabbia singola, monitorando la sua respirazione e direzione. Se compaiono segni di respirazione rapida o apertura della bocca, rilasciare prontamente il ratto per evitare il soffocamento.
   1. L'immobilizzazione ideale consente al ratto di muoversi liberamente e svolgere attività come bere, sollevare gli arti anteriori e nutrirsi (Figura 1D). Se l'immobilizzazione non è soddisfacente, rilasciare temporaneamente e riimmobilizzare dopo 20 minuti per ridurre al minimo lo stress sul ratto dovuto a ripetuti stimoli di immobilizzazione.
8. Accendere l'alimentazione e impostare il tapis roulant a 1 m/min con un'inclinazione di 0°. Il tempo di allenamento sul tapis roulant è di 30 minuti. Trasferisci delicatamente il ratto sul tapis roulant e avvia il timer.
9. Non fornire ulteriore stimolazione al ratto. Se il ratto non riesce a completare l'addestramento di 30 minuti, mettilo in una gabbia per un riposo di 10 minuti senza rimuovere la fissazione.
   NOTA: Il nastro terapeutico elastico utilizzato in questo studio ha un'eccellente elasticità e adesività. Se adeguatamente fissata senza tensione, la fissazione a lungo termine non causerà il distacco della provetta o provocherà il soffocamento e la morte del ratto.
10. Dopo l'addestramento, pulisci le feci e l'urina lasciate dai ratti e spruzza alcol per eliminare l'odore dell'animale.
11. Evita che i passaggi di cui sopra vengano visti da altri ratti e maneggia gli animali il più delicatamente possibile per evitare che gli animali vocalizzino, causando così stress traumatico agli altri ratti.
12. Rilasciare immediatamente il ratto dalla fissazione dopo aver completato l'addestramento (Figura 1E). Durante il rilascio, usare le dita per premere sul pelo del ratto per proteggerlo, riducendo al minimo la perdita di pelo durante il rilascio (Figura 1F).

6. Raggruppamento di animali

1. Per studiare l'impatto dell'allenamento con i pesi sulla SONFH, dividere casualmente 60 ratti in quattro gruppi.
2. Nel gruppo di controllo, non stabilire il modello comune di osteonecrosi indotta da steroidi della testa del femore (SONFH) o eseguire l'allenamento con pesi. Nel gruppo Control+Load, eseguire solo l'allenamento con pesi, senza stabilire l'osteonecrosi indotta da steroidi del modello di testa del femore. Nel gruppo Modello, stabilire l'osteonecrosi indotta da steroidi solo del modello della testa del femore. Nel gruppo Modello+Carico, eseguire l'allenamento con i pesi dopo aver stabilito l'osteonecrosi indotta da steroidi del modello di testa del femore.

7. Eutanasia e raccolta dei campioni

1. Metti i ratti in una camera per l'eutanasia di piccoli animali e inietta abbastanza anidride carbonica per raggiungere una concentrazione superiore al 5%. Una volta che i ratti perdono conoscenza, somministrare una dose di 0,3 ml/kg di peso corporeo di una soluzione di cloruro di potassio al 20%, per un totale di 20 ml, tramite un'iniezione intracardiaca.
2. Monitora la respirazione e il battito cardiaco dei ratti per assicurarti che non provino dolore o disagio durante l'eutanasia. Confermare la morte controllando l'assenza di respirazione e battito cardiaco. Spruzzare alcol per rimuovere qualsiasi odore.
3. Dopo l'eutanasia, sezionare la regione dell'anca del ratto ed estrarre la testa del femore mantenendo intatto il femore. Eseguire una scansione microCT dopo il pretrattamento, seguita dalla colorazione con ematossilina-eosina (HE).

8. Colorazione ematossilina-eosina

1. Al termine della modellazione, sopprimere i ratti. Rimuovere i femori per la colorazione HE.
2. Immergere i femori di ratto in paraformaldeide al 4% per 24 ore per preservare i tessuti biologici come campioni. Immergere i campioni di femore di ratto in acido formico al 5% per la decalcificazione per 5 giorni.
3. Sezionare i campioni in fette da 5 μm per la colorazione HE.
   NOTA: Le lacune vuote si riferiscono alla situazione nel tessuto osseo¹⁹ in cui le lacune, che normalmente dovrebbero contenere osteociti, sono prive di queste cellule. È un indicatore importante per valutare la salute del tessuto osseo. Nel processo patologico della necrosi ossea, un insufficiente afflusso di sangue può causare la morte degli osteociti, portando a lacune vuote. Nella diagnosi e nella valutazione della necrosi ossea, il numero e la distribuzione delle lacune vuote sono parametri importanti per misurare la gravità della malattia^20,21.
   1. Porre i campioni femorali di ratto in paraffina fusa (56-60 °C), immergendoli prima in paraffina a basso punto di fusione, se necessario, quindi trasferire gradualmente in paraffina con punto di fusione più alto, ogni volta per circa 1 ora, per garantire un'infiltrazione completa del tessuto con paraffina.
   2. Preparare gli stampi da incasso e versare la paraffina fusa negli stampi alla profondità appropriata. Recuperare i campioni di tessuto dalla paraffina usando una pinza dopo l'immersione, rimuovere la paraffina in eccesso e metterli negli stampi. Raffreddare a temperatura ambiente per solidificare la paraffina, formando blocchi di paraffina.
   3. Utilizzando un microtomo di paraffina, tagliare i blocchi di paraffina incorporati in sezioni spesse 5 μm.
4. Cuocere i campioni femorali di ratto con le fette attaccate in uno scaldavetrini per 1 ora per migliorare l'adesione tra le fette e il vetrino coprioggetti e ridurre il galleggiamento durante i successivi processi di colorazione.
5. Immergere le fette cotte in sequenza in xilene puro per rimuovere la paraffina, seguita da una serie di disidratazione attraverso etanolo assoluto, etanolo a gradiente (100%, 95%, 80%, 70%) e acqua, per 2 minuti ciascuna, completando il processo di deparaffinazione e reidratazione.
6. Immergere le fette deparaffinizzate in una soluzione colorante di ematossilina e colorare per 10 minuti. Sciacquare con acqua corrente per rimuovere l'ematossilina non legata.
7. Immergere le sezioni colorate con ematossilina nella soluzione colorante con eosina e colorare per 2 minuti per colorare il citoplasma e il tessuto connettivo. Risciacquato con una soluzione di acido acetico all'1% per fissare l'effetto macchiante.
8. Immergere le fette del campione di osso femorale di ratto in sequenza in etanolo al 70%, 80%, 90%, 95% e 100%, con ogni gradiente per 2 minuti, rimuovendo gradualmente l'umidità.
9. Immergere le fette del campione di osso femorale di ratto in xilene puro per trasparenza, quindi risciacquare con acqua corrente per rimuovere lo xilene. Applicare la resina di montaggio neutra, coprendo i vetrini, picchiettando delicatamente per rimuovere le bolle d'aria e lasciando solidificare il mezzo di montaggio per completare il processo di montaggio.
10. Utilizzando il pacchetto randomizr in R, selezionare 30 vetrini colorati con HE per ciascun gruppo e assegnare 15 vetrini ciascuno a due ricercatori. Senza informarli dei raggruppamenti, chiedere ai ricercatori di calcolare il tasso di lacune vuote dei vetrini e raccogliere i risultati per l'analisi statistica.

9. Analisi MicroCT

1. Al termine della modellazione, sopprimere i ratti. Rimuovere i femori per la colorazione ematossilina-eosina.
2. Immergere i femori di ratto in paraformaldeide al 4% per 24 ore per preservare i tessuti biologici come campioni. Posizionare i femori di ratto nel dispositivo microCT specifico per piccoli animali.
3. Impostare le condizioni di scansione microCT come segue: Tensione raggi X: 80 kV, Corrente: 100 μA, Tempo di esposizione singola: 50 ms, Risoluzione di scansione: 25 μm. Eseguire scansioni a intervalli di 0,5°, concentrandosi sull'osso trabecolare da sotto la cartilagine alla parte superiore dell'epifisi come regione di interesse.
4. Definisci l'area sopra il collo del femore di ratto come regione di interesse.
5. Eseguire la ricostruzione del piano coronale dei risultati della scansione utilizzando il dispositivo microCT e raccogliere le misurazioni morfometriche ossee generate dal software integrato del dispositivo microCT. Registrare i seguenti indici osservati: Volume totale (TV), Volume osseo percentuale (BV/TV), Rapporto superficie/volume osseo (BS/BV), Spessore della struttura (Tb.Th), Separazione della struttura (Tb.Sp), Numero di osso (Tb.N), Densità ossea (BD).

10. Analisi statistica

1. Presenta i dati come media ± deviazione standard (SD). Condurre analisi statistiche per micro-CT e valutazioni istologiche quantitative utilizzando il t-test a campione indipendente. Considera un valore p < 0,05 come statisticamente significativo.

Risultati

Analisi istopatologica
La colorazione con ematossilina ed eosina ha rivelato che nel gruppo di controllo e nel gruppo di controllo + carico, le trabecole ossee erano intatte e disposte regolarmente. Le cellule endoteliali dei vasi sanguigni erano presenti nelle fossette ossee e la morfologia cellulare appariva paffuta. Al contrario, il gruppo Modello e il gruppo Modello+Carico presentavano trabecole ossee fratturate e disordinate, insieme a un numero significativament...

Discussione

Attualmente, vari animali, come conigli²⁵, ratti²⁶, topi²⁷, maiali²⁸, polli da carne²⁹, struzzi⁸ ed emù³⁰ possono essere utilizzati per stabilire modelli di necrosi della testa del femore. Tra questi, ratti, topi e conigli sono le specie più comunemente usate. Il ratto, come modello per la necrosi della testa del femore,...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15ml centrifuge tube	Corning,USA	430791
5mm stainless steel bead	Gelisen,China	5mm
Acetic acid	Merck KGaA, Germany	64-19-7
Anhydrous alcohol	Merck KGaA, Germany	64-17-5
clay	Mincai stationery,China	102
Coverslip	Servicebio,China	WMWD-1818
Flat pressure bottle 10ml	BEHNCKE,China	MD10ml
Formic acid	Macklin Biochemical ,China	64-18-6
HE staining kit	Solarbio,China	G1120
HistoCore AUTOCUT	Leica, Germany	149AUTO00C1
Kinesio tape (elastic therapeutic tape)	Fuluo medicine,China	CL1819
Lipopolysaccharide	Solarbio,China	L8880
Lipopolysaccharides (LPS)	Selleck,USA	S7850
Manual carbon dioxide euthanasia box	Yuyan,China	LC-500-S1
Methylprednisolone sodium succinate,MPS	AbMole,China	M25573
MicroCT	Hiscan,China	Hiscan VM Pro
Neutral resin	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology l ,China	ZLI-9555
Paraffin	Servicebio,China	WGHB-319213129
Paraformaldehyde	Servicebio,China	G1101-500ML
Potassium chloride	Macklin Biochemical ,China	7447-40-7
Slide	Servicebio,China	WG6012
Treadmill for Rats and  mice	Litc Life Science,USA	801
Xylene	Macklin Biochemical ,China	1330-20-7