Indagine sull'angiogenesi a livello funzionale e molecolare sfruttando il saggio di migrazione della ferita da graffio e il saggio di germinazione sferoidale

Riepilogo

Questo studio presenta il saggio bidimensionale (2D) di migrazione della ferita da graffio e il saggio tridimensionale (3D) di germinazione degli sferoidi, insieme ai rispettivi metodi di analisi a valle, tra cui l'estrazione dell'RNA e l'immunocitochimica, come saggi adatti per studiare l'angiogenesi in vitro.

Abstract

L'angiogenesi svolge un ruolo cruciale nei processi fisiologici e patologici all'interno del corpo, tra cui la crescita tumorale o la malattia neovascolare dell'occhio. Una comprensione dettagliata dei meccanismi molecolari sottostanti e modelli di screening affidabili sono essenziali per indirizzare efficacemente le malattie e sviluppare nuove opzioni terapeutiche. Sono stati sviluppati diversi saggi in vitro per modellare l'angiogenesi, sfruttando le opportunità offerte da un ambiente controllato per chiarire i driver angiogenici a livello molecolare e lo screening dei bersagli terapeutici.

Questo studio presenta i flussi di lavoro per lo studio dell'angiogenesi in vitro utilizzando cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVECs). Descriviamo in dettaglio un saggio di migrazione della ferita da graffio utilizzando un sistema di imaging di cellule vive che misura la migrazione delle cellule endoteliali in un ambiente 2D e il saggio di germinazione degli sferoidi che valuta la germinazione delle cellule endoteliali in un ambiente 3D fornito da una matrice di collagene. Inoltre, delineiamo strategie per la preparazione dei campioni per consentire ulteriori analisi molecolari come la trascrittomica, in particolare nell'ambiente 3D, compresa l'estrazione dell'RNA e l'immunocitochimica. Nel complesso, questo quadro offre agli scienziati un set di strumenti affidabile e versatile per portare avanti le loro ricerche scientifiche nei saggi di angiogenesi in vitro .

Introduzione

L'angiogenesi, che si riferisce alla formazione di nuovi vasi sanguigni da quelli preesistenti¹, è un processo cruciale durante lo sviluppo fisiologico e le condizioni patologiche. È indispensabile per fornire energia a tessuti altamente metabolicamente attivi come la retina² o il sistema nervoso centrale in via di sviluppo³ e durante la guarigione dei tessuti danneggiati⁴. L'angiogenesi anormale, d'altra parte, è alla base di numerose malattie. I tumori solidi, come il cancro del colon-retto o il carcinoma polmonare non a piccole cellule, ne facilitano la crescita e l'appo....

Protocollo

1. Coltura cellulare HUVEC

NOTA: Eseguire tutti i seguenti passaggi in condizioni di lavoro sterili (banco di lavoro sterile).

1. Espansione degli HUVEC
   1. Per entrambi i test di angiogenesi, utilizzare cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVECs) o cellule endoteliali microvascolari umane (HMVECs).
   2. Coltivare le cellule fino a raggiungere il 90% di confluenza in una fiaschetta T75 non rivestita con terreno di crescita delle cellule endoteliali (EGM) prima di eseguire una divisione. Eseguire il cambio medio 3 volte a settimana.
      NOTA: Per accelerare la crescita, il mezzo può essere cambiat....

Discussione

In questo rapporto, abbiamo presentato una gamma di tecniche con letture funzionali e molecolari per studiare l'angiogenesi in vitro.

Il saggio di migrazione rappresenta una tecnica consolidata utilizzata in tutti i campi del lavoro di laboratorio umido. Abbiamo scelto l'approccio di imaging di cellule vive disponibile in commercio per sfruttare il formato a 96 pozzetti adatto per esperimenti di screening e dose-risposta, la dimensione standardizzata e riproducibile della ferita cre.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Medium 199	Sigma-Aldrich	M0650
2-(4-(2-Hydroxyethyl)1-piperazinyl)-ethan-sulfonsäure	PAN-Biotec	P05-01100	HEPES
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-Fragment	Jackson IR	115-606-072
Axio Vert. A1	Zeiss
CapturePro 2.10.0.1	JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tail	Corning	354236
Collagenase D	Roche	11088858001
Endothelial Cell Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM
Endothelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3162	EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid	Serva	11290.02	EDTA
Fetal bovine serum	Bio&SELL	S 0615	FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooled	Lonza	C2519A	HUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates	Sartorius	4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis System	Sartorius
Methocel	Sigma	m-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBS	PB-MH-100-4090-GFP	PELOBiotech
NaOH	Carl Roth	P031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol)	Sigma-Aldrich	P5282-.1MG	Phalloidin-FITC
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientfic	14190-094	PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Systems	ACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Invitrogen by ThermoFisher Scientific	2260939
QIAzol Lysis Reagent	QIAGEN	79306
recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor	PeproTech	100-20	VEGF
Squared petri dish	Greiner	688102
Trizol	Qiagen	79306
Trypsin	PAN-Biotec	P10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)	ThermoFisher Scientific Inc.	B.309.4
WoundMaker	Sartorius	4493