Sintesi di perle sensibili al pH caricate con olio di semi neri, a base di alginato utilizzando la tecnica dell'elettrospruzzatura

Riepilogo

Viene presentata una tecnica che impiega un'alta tensione elettrica e un'emulsione mirata caricata con principio attivo per fabbricare microsfere uniformi e sensibili al pH.

Abstract

L'olio di semi neri (BSO), derivato dai semi della pianta Nigella sativa , ha attirato l'attenzione per le sue potenziali proprietà antitumorali, in particolare nel contesto del cancro del colon. Il suo composto attivo, il timochinone, può aiutare a inibire la crescita delle cellule tumorali e indurre l'apoptosi nelle cellule tumorali del colon. Inoltre, gli effetti antinfiammatori e antiossidanti dell'olio di semi neri potrebbero contribuire a un ambiente intestinale più sano, riducendo potenzialmente il rischio di cancro. Pertanto, questo studio ha sintetizzato perle di alginato sensibili al pH per fornire BSO nel colon in modo a rilascio controllato senza rilasciare il farmaco a pH 1,2 (stomaco), fornendo così un modello di rilascio ben definito a pH 6,8. L'uso della tecnologia elettrospray migliora le prestazioni del processo facilitando la formulazione di microsfere piccole e omogenee con un tasso più elevato di rigonfiamento e diffusione nel mezzo gastrointestinale.

Le perle formulate sono state caratterizzate da un test di forza mucoadesiva ex-vivo , dimensione delle perline, fattore di sfericità (SF), efficienza di incapsulamento (EE), microscopio elettronico a scansione (SEM), comportamento di rigonfiamento in vitro (SB) e rilascio di farmaci in vitro in terreni acidi e tampone. Tutte queste perle prodotte hanno dimostrato dimensioni modeste di 0,58 ± 0,01 mm e una forma sferica di 0,03 ± 0,00 mm in questo test. La formulazione ha mostrato promettenti proprietà di galleggiamento e rilascio in vitro. Con una percentuale cumulativa molto bassa di perline, l'EE dell'olio del 90,13% ± 0,93% era alto e lo studio di rilascio ha dimostrato oltre il 90% in pH 6,8 con una buona natura fluttuante nello stomaco. Inoltre, le perle erano uniformemente distanziate in tutto l'intestino. L'approccio di elettrospruzzatura utilizzato in questo protocollo può essere riproducibile, producendo risultati coerenti. Pertanto, questo protocollo può essere utilizzato per la produzione su larga scala a scopo di commercializzazione.

Introduzione

Il seme nero, e più in particolare il BSO, è stato utilizzato per secoli per curare una vasta gamma di malattie grazie alle sue proprietà medicinali ben consolidate. Il timochinone è forse una delle sostanze fitochimiche più importanti presenti nella BSO¹. Negli ultimi anni, i ricercatori hanno studiato i potenziali benefici terapeutici del timochinone in vivo e in vitro, producendo prove empiriche a sostegno dell'uso della BSO. Le proprietà antipertensive, antibatteriche, antistaminiche, antimicotiche, analgesiche, antidiabetiche, ipolipemizzanti e antinfiammatorie sono state tutte dimostrate da questi studi per la BSO, che può essere utilizzata per trattare sintomi come eczema, ipertensione, asma, tosse, mal di testa, influenza, febbre, antitumorale, vertigini e attività ^2,3.

L'applicazione di coperture relativamente sottili su piccole goccioline di liquidi e dispersioni, o particelle di materiale solido, è nota come microincapsulazione. Quando si tratta di olio, l'olio microincapsulato è solitamente molto prezioso perché alcune forme di olio, come il BSO, sono considerate alimenti nutrienti e offrono vantaggi medicinali⁴. Tuttavia, l'aggiunta di oli direttamente alla matrice dell'alimento può portare alla volatilizzazione, che può causare la rapida scomparsa delle attività a causa dell'esposizione all'ossigeno e ai raggi UV⁵. Inoltre, la mancanza di controllo sulla velocità di rilascio degli oli si traduce in un effetto immediato e transitorio. La creazione di un rivestimento polimerico attorno all'olio essenziale mediante microincapsulazione o microsferificazione è un metodo per superare questi inconvenienti⁶.

Le microcapsule, note anche come microsfere, proteggono gli oli dalle condizioni ambientali dannose⁷. Questo processo è stato ampiamente utilizzato per aumentare l'efficacia dei farmaci, preservare il contenuto dei farmaci, consentire compresse a rilascio prolungato, migliorare il mascheramento del gusto, ridurre la perdita di sapore durante la durata di conservazione del prodotto, prolungare la sensazione in bocca e separare gli ingredienti incompatibili in un unico dosaggio⁸. La microincapsulazione aiuta anche a mantenere l'assorbimento metabolico, a controllare la velocità di rilascio dell'olio e a mantenere le concentrazioni appropriate per ottenere il risultato desiderato in una particolare posizione⁹.

L'incapsulamento elettro-idrodinamico è un metodo semplice e adattabile. Il principio attivo è alloggiato nel nucleo interno di una microcapsula, che è composta da un guscio esterno. A questo proposito, è dotato di una matrice abbastanza forte per garantire che il componente attivo possa essere diffuso in modo più efficace piuttosto che un nucleo chiaramente definito. Prima della sfericazione, il principio attivo e la soluzione polimerica devono essere combinati per produrre le microsfere⁹. D'altra parte, poiché l'olio è volatile, la sua microincapsulazione può essere estremamente difficile e richiede un attento controllo della temperatura.

Esistono vari metodi per incapsulare gli oli. Ad esempio, alcuni oli devono essere incapsulati a basse temperature per evitare la rottura o la volatilizzazione dei loro componenti bioattivi. Per creare strutture di dimensioni micro e nanometriche, l'atomizzazione elettroidrodinamica (EHDA) è stata ampiamente studiata dai ricercatori¹⁰. In questo senso, le condizioni di lavorazione, che includono la portata, la tensione applicata e la dimensione dell'ugello, nonché le proprietà della distanza di raccolta della soluzione polimerica, sono i due fattori primari che devono essere presi in considerazione per produrre la dimensione o la morfologia delle particelle desiderata^11,12.

In questa indagine, gli alginati, un tipo di polisaccaridi presenti in natura adatti all'ingestione orale, sono stati utilizzati per incapsulare il BSO. Le alghe brune contengono alginato, un polimero anionico che si trova in natura. È costituito da due strutture monomeriche: acido α-L-guluronico (G) e acido 1-4βD-mannuronico (M)¹³. Il suo polimero non è tossico¹⁴, ha un alto grado di biocompatibilità, è poco costoso e si degrada efficacemente¹⁵. È, quindi, frequentemente impiegato nei settori delle biotecnologie e dell'ingegneria.

Gli alginati sono il materiale preferito per l'incapsulamento mediante gelificazione ionica perché possono creare una struttura reticolata tra i gruppi G di varie catene di alginato formando connessioni ioniche con cationi bivalenti come ioni Sr²⁺, Ca²⁺ o Zn²⁺. Il processo di gelificazione può essere adeguatamente caratterizzato dal modello a scatola di uova, che limita il catione bivalente a due gruppi carbossilici sulle molecole di alginato affiancate. È stato suggerito che le caratteristiche dell'idrogel delle perle di alginato di sodio possano regolare il rilascio di macromolecole e piccole molecole. Le perle di alginato di sodio possono aderire alla mucosa intestinale per un periodo di tempo prolungato a causa delle loro qualità muco-adesive. Inoltre, l'alginato offre uno scudo che può proteggere gli oli da elementi esterni come i mezzi acidi¹⁶ e trasferisce gli oli nei canali di erogazione del tratto gastrointestinale¹⁷. Da allora è stato impiegato nella ricerca per aiutare nella somministrazione sito-specifica di farmaci ai tessuti mucosi^18,19.

L'approccio elettro-idrodinamico è stato utilizzato in questo studio per studiare la fattibilità dell'emulsione di oli commerciali per creare capsule²⁰. Qui, l'approccio elettro-idrodinamico è stato utilizzato per generare e analizzare microsfere caricate con alginato-BSO²⁰. Questo studio ha valutato una serie di altri fattori, tra cui l'SF, ex-vivo, le proprietà muco-adesive delle microsfere, l'EE%, l'aspetto fisico, la distribuzione dimensionale e il potenziale zeta; la spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier a riflettanza totale attenuata (ATR-FTIR) è stata utilizzata per testare la compatibilità chimica²⁰.

Protocollo

1. Preparazione dell'emulsione di alginato-BSO

1. Disperdere il 10% p/v BSO in una soluzione di alginato di sodio all'1% p/v contenente lecitina 1, 3 e 5% p/v in un becher da 50 mL.
2. Ottenere una nano-emulsione utilizzando un omogeneizzatore ad ultrasuoni. Impostare il livello di potenza al 20%. Eseguire l'omogeneizzatore per 55 s facendo clic sul pulsante di avvio per completare il processo.

2. Caratterizzazione dell'emulsione di alginato-BSO

1. Analizzare il potenziale zeta e la distribuzione granulometrica
   1. Prelevare 0,1 mL dell'emulsione appena preparata in un becher di vetro da 25 mL e diluirla con 9,9 mL di acqua distillata.
   2. Prelevare 2,5 mL di questa soluzione diluita in una cuvetta di quarzo da 3 mL e collocare la cuvetta in una camera di misurazione.
   3. Aprire il coperchio e posizionare la cuvetta all'interno del dispositivo, assicurandosi che la cuvetta sia orientata correttamente rispetto al percorso del fascio di luce. Fare clic sull'icona di misurazione .
   4. Estrarre la cuvetta. Recuperare il campione o smaltirlo correttamente.
   5. Salva i dati come file pdf in una cartella personale per un ulteriore utilizzo.
2. Determinare la stabilità dell'emulsione (ES)
   1. Assumere 5 ml di emulsione appena preparata in provette da centrifuga da 10 ml. Centrifugare le emulsioni (n = 3) per 5 minuti a 894 × g.
   2. Utilizzando l'equazione (1), determinare l'ES in base alla posizione dell'interfaccia di separazione di fase.
      (1)
      Dove Vemul è il volume dell'emulsione rimanente dopo la centrifugazione e Vinitial è il volume dell'emulsione iniziale.
3. Preparazione delle perline
   1. Perline di alginato BSO
      1. Preparare le perle di alginato BSO utilizzando la tecnica elettrospray chiamata EHDA. Utilizzare un'emulsione BSO in peso/volume (p/v) composta da 10% BSO, 1% di alginato di sodio e 3% di lecitina).
      2. Utilizzando una pompa a siringa per regolare la portata, caricare l'emulsione in una siringa di plastica da 10 ml e spingerla attraverso un ago da 22 G. Collegare la punta dell'ago all'elettrodo positivo di un alimentatore ad alta tensione.
      3. Come collettore, utilizzare un becher messo a terra con 50 mL di cloruro di calcio all'1% p/p (bagno gelificante). Alternare la velocità di gocciolamento tra 1 mL/min e 3 mL/min a tensioni di 3, 5 e 7 kV mantenendo una distanza di 10 cm sopra la superficie della soluzione di cloruro di calcio.
      4. Per confermare la gelificazione completa, lasciare le perle nel bagno gelificante per 30 minuti mentre le si agita. Utilizzare un filtro in acciaio inossidabile per rimuovere le perle dal bagno di gelificazione e lavare le perle raccolte con acqua distillata ultrapura.
      5. Lasciare asciugare le perle per 16 ore a temperatura ambiente su un banco da laboratorio. Utilizzare l'equazione (2) per calcolare la resa percentuale delle perline.
         (2)
   2. Perle di alginato senza BSO
      1. Preparare una soluzione all'1% p/v di alginato di sodio. Aggiungere alla soluzione lecitina a concentrazioni dell'1%, 3% e 5% p/v. Mescolare accuratamente la soluzione fino a quando la lecitina non si sarà completamente sciolta.
      2. Utilizzare la soluzione del passaggio 2.3.2.1 per preparare perle di alginato prive di BSO come descritto nei passaggi 2.3.1.2-2.3.1.5. Calcolare la resa utilizzando l'equazione (2).

3. Caratterizzazione del tallone

1. Determinazione delle dimensioni e della forma
   1. Per accertare le dimensioni e la forma delle perline, utilizzare un analizzatore di immagini. Scatta foto con una fotocamera digitale delle perline bagnate e asciugate.
   2. Quindi, misurare il diametro del cordone utilizzando la barra graduata preinstallata dello strumento. Utilizzando i valori del diametro, calcolare l'SF dai valori del diametro ottenuti utilizzando l'equazione (3):
      SF = (3)
      Dove Dmax rappresenta il diametro più grande che passa per il centro di un cordone (in mm), mentre Dper si riferisce al diametro che è perpendicolare a Dmax e passa per il centro del cordone (in mm).
      NOTA: Un SF pari a zero denota un cordone idealmente sferico, con valori di SF crescenti che indicano una maggiore deviazione da una forma sferica. Inoltre, le perline sono considerate sferiche se il loro SF è 0,05 o inferiore.

4. Determinazione della percentuale EE

1. Disintegrare le perle in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimetterle in emulsione. Misurare l'assorbanza dell'emulsione risultante a 600 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-vis.
2. Utilizzare il valore di assorbanza per rappresentare la torbidità dell'emulsione. Create una curva standard utilizzando una quantità nota di BSO nell'emulsione.
3. Calcolare l'EE% utilizzando l'equazione (4):
   (4)

5. Microscopia elettronica a scansione (SEM)

NOTA: Utilizzare il SEM per osservare la microstruttura e la morfologia superficiale delle perle di alginato BSO.

1. Per ispezionare l'interno delle perline essiccate, tagliatene alcune. Individua le perline tagliate su tronchetti di alluminio e incollale usando nastri adesivi in carbonio.
2. Rivestire le perle con un modulo sputter in carbonio in un evaporatore sottovuoto in un'atmosfera di argon. Applicare uno spessore di 100 Å e 50 Å per il rivestimento in carbonio.
3. Acquisire immagini delle perle rivestite ad alto vuoto con un acceleratore di tensione compreso tra 10 kV e 15 kV.

6. Determinare l'interazione farmaco-eccipiente utilizzando ATR-FTIR

1. Impostare i numeri d'onda dello strumento tra 4.000 cm⁻¹ e 400 cm⁻¹ utilizzando l'aria ambiente come sfondo e una risoluzione di 1 cm⁻¹. Vedere il file supplementare 1.
2. Registrare separatamente gli spettri di BSO, alginato di sodio, lecitina, cloruro di calcio, perle prive di BSO, perle di alginato-BSO e miscela fisica di principio attivo ed eccipienti (alginato di sodio, lecitina, cloruro di calcio e BSO).
   1. Posizionare il campione (5-10 mg) sull'area di campionamento. Regola 20 scansioni, risoluzione 4, forza manometrica 80, braccio di pressione con punta piatta. Verificare che l'opzione Incremento automatico rimanga impostata sull'opzione Vuoto in modo che lo spettro venga memorizzato automaticamente nella cartella desiderata.
   2. Per iniziare la misurazione del campione, fare clic sul pulsante [Campione]. Dopo aver selezionato [Campione], poiché non è previsto alcun periodo di attesa, assicurarsi di avere il campione pronto e la pinza di pressione ridotta. Analizza tutti i campioni singolarmente. Analizza individualmente tutti gli spettri registrati utilizzando il software di spettroscopia.

7. Calorimetria differenziale a scansione (DSC)

NOTA: Le proprietà termiche e la compatibilità delle perle caricate con BSO sono state studiate utilizzando DSC (Supplemental File 1).

1. Sigillare le perle del peso di ~3,20 mg in una normale padella di alluminio. Riscaldare i campioni a una velocità di 10 °C/min mentre vengono analizzati a una temperatura compresa tra 50 e 350 °C sotto un flusso di azoto che scorre a una velocità di 20 L/min.

8. Caratteristiche di rigonfiamento delle perle

1. Preparare 100 mg di perle di alginato-BSO essiccate.
2. Preparare il fluido intestinale simulato (SIF) e il liquido gastrico simulato (SGF) in un recipiente di miscelazione pulito e asciutto di dimensioni adeguate: 6 L, 10 L o 25 L. Aggiungere acqua purificata a circa il 33% del volume richiesto: 2 L, 3 L o 8 L, e trasferire il contenuto del flacone di concentrato nel recipiente. Sciacquare la bottiglia con acqua purificata e aggiungere i risciacqui e l'acqua purificata al recipiente di miscelazione per ottenere il volume richiesto; Mescolare accuratamente. Misurare il pH e procedere se entro le specifiche; regolare il pH se necessario.
3. Immergere le microsfere in 50 ml di terreno contenente fluido intestinale simulato (SIF) e liquido gastrico simulato (SGF). Mantenere le condizioni per 2 ore a 37 ± 0,5 °C.
   1. Rimuovere le perline gonfiate e filtrarle attraverso una rete metallica a intervalli predefiniti di 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 e 120 minuti o più. Usa un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso dalle perline gonfie.
   2. Misurare il peso delle perle pulite utilizzando una bilancia analitica elettronica. Determinare la percentuale di indice di rigonfiamento (%SI) utilizzando l'equazione (5):
      (5)

Risultati

Preparazione di microsfere di alginato caricate con BSO
La Figura 1 rappresenta la configurazione sperimentale per preparare microsfere di alginato caricate con BSO. La quantità di lecitina utilizzata ha avuto un impatto considerevole sulla stabilità dell'emulsione BSO. Le emulsioni realizzate con tutte e tre le concentrazioni di lecitina erano relativamente stabili. Il metodo di centrifugazione (894 × g, 5 min) è stato util...

Discussione

Utilizzando il processo EHDA, sono state create microsfere di alginato caricate con BSO come vettore sensibile al pH. La rete di perle mostrava un rigonfiamento pH-dipendente e un comportamento di rilascio del farmaco a causa dell'abbondante presenza di gruppi acidi carbossilici. Il forte legame idrogeno intermolecolare tra le catene polimeriche si è rivelato essere la ragione alla base della diminuzione del carattere di rigonfiamento delle perle caricate con BSO a pH 1,2. Le perle cari...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Centrifuge Tubes	Globe Scientific	22-171-624
22 G needle	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	CAD4172
3 mL quartz-cuvette	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	Z276669
50 mL beaker
Aluminum stubs
An electronic analytical balance
ATR-FTIR	Bruker Malaysia Sdn Bhd, Kawasan Perindustrian Temasya, 40150 Shah Alam, Selangor, Malaysia.
Black seed oil	IKOP Pharmaceutical Ltd. (IKOP, Faculty of Pharmacy, IIUM, 25200 Kuantan, Pahang, Malaysia	B182111	Active ingredient
Calcium chloride dehydrate, CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	21074	Gelling agent
Carbon adhesive tapes
Centrifuge
Differential scanning calorimetry
Digital   camera
Grounded beaker
High guluronic acid content Sodium alginate (mw. 97,000) with medium viscosity (40 – 100 mPa s)	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	W201502	Polymer
High voltage power supply
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	W292912	ATR-FTIR cleaning purpose
Lecithin	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	P7568	Surfactant
Microscope
Paper towel
Scanning electron microscopy
Simulated gastric fluid	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	1651	Release media and swelling media
Simulated intestinal fluid	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	84082-64-4	Release media and swelling media
Spectroscopy software
Stainless-steel filter
Syringe pump	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
Ultrapure distilled water	Supplied by institutional lab
Ultrasonic homogenizer	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
UV-vis spectrophotometer.
Vacuum evaporator	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
Voltage accelerator	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
Zetasizer Nano-ZS	(Malvern Zetasizer Nano series Nano-S and Nano-Z, Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)