Integrazione della valutazione comportamentale animale e della rete neurale convoluzionale per studiare l'interazione gusto-odore wasabi-alcol

Riepilogo

Questo articolo descrive una serie di metodi per misurare la capacità soppressiva dello sniffare bevande alcoliche sulla sensazione di bruciore indotta dal wasabi.

Abstract

Le paste di wasabi commerciali comunemente utilizzate per la preparazione del cibo contengono un composto omologo di isotiocianati chemiosensoriali (ITC) che suscitano una sensazione irritante al momento del consumo. L'impatto dell'annusare bevande alcoliche alimentari sulla sensazione di piccantezza del wasabi non è mai stato studiato. Mentre la maggior parte degli studi di valutazione sensoriale si concentra separatamente su singoli cibi e bevande, mancano ricerche sullo studio olfattivo dello sniffare liquore durante il consumo di wasabi. Qui, viene sviluppata una metodologia che combina l'uso di uno studio comportamentale animale e di una rete neurale convoluzionale per analizzare le espressioni facciali dei topi quando contemporaneamente sniffano liquore e consumano wasabi. I risultati dimostrano che il modello di deep learning addestrato e convalidato riconosce il 29% delle immagini raffiguranti il co-trattamento di wasabi e alcol appartenenti alla classe del gruppo wasabi-negativo-liquore-positivo senza la necessità di un precedente filtraggio dei materiali di formazione. L'analisi statistica dei punteggi della scala delle smorfie del topo ottenuti dalle immagini dei fotogrammi video selezionati rivela una differenza significativa (P < 0,01) tra la presenza e l'assenza di liquori. Questa scoperta suggerisce che le bevande alcoliche alimentari potrebbero avere un effetto decrescente sulle reazioni indotte dal wasabi nei topi. Questa metodologia combinatoria ha un potenziale per lo screening individuale dei composti ITC e per le analisi sensoriali dei componenti degli spiriti in futuro. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per indagare il meccanismo alla base della soppressione della pungenza del wasabi indotta dall'alcol.

Introduzione

La Wasabia japonica, comunemente nota come wasabi, ha ottenuto riconoscimenti nella preparazione del cibo ^1,2. È nota l'intensa esperienza sensoriale che suscita al momento del consumo, caratterizzata da lacrime, starnuti o tosse. Questa particolare pungenza del wasabi può essere attribuita a un composto omologo di isotiocianati chemiosensoriali (ITC). Sono sostanze fitochimiche organosolforate volatili che possono essere classificate in ω-alchenil e ω-metiltioalchilisotiocianati³. Tra questi composti, l'isotiocianato di allile (AITC) è il prodotto naturale ITC più diffuso nelle piante appartenenti alla famiglia delle Crucifere, come il rafano e la senape⁴. Le paste di wasabi commerciali sono comunemente preparate a partire dal rafano, rendendo l'AITC un marcatore chimico utilizzato per il controllo di qualità di questi prodotti commerciali⁵.

L'abbinamento di bevande alcoliche dietetiche con piatti infusi di wasabi può essere considerato un esempio di disposizione culturale⁶. Soggettivamente, questa combinazione può completare la piccantezza e il calore tra il wasabi e lo spirito, migliorando l'esperienza culinaria complessiva. La valutazione comportamentale qualitativa degli animali (QBA) è un approccio metodologico completo che esamina i cambiamenti comportamentali nei soggetti in risposta a stimoli esterni a breve o lungo termine utilizzando termini numerici⁷. Questo metodo comprende test del dolore, test motori, test di apprendimento e memoria, nonché test emotivi specificamente progettati per i modelli di roditori⁸. Tuttavia, gli studi che indagano la valutazione sensoriale sinergica della gustazione insieme all'olfatto rimangono scarsi in letteratura fino ad ora ^9,10. La maggior parte degli studi sulla sensazione chimica si limita ad esaminare separatamente il consumo individuale di cibi e bevande¹¹. Di conseguenza, c'è una carenza di ricerca sull'interazione gusto-odore che coinvolge l'atto di annusare il liquore mentre si consuma wasabi.

Poiché si ritiene che la sensazione di bruciore indotta dal wasabi sia una forma di nocicezione¹², le valutazioni comportamentali degli animali sono adatte per valutare le risposte sensoriali nocicettive negli animali roditori ^8,13,14. Un metodo per valutare la nocicezione nei topi, noto come punteggio della scala della smorfia del topo (MGS), è stato sviluppato da Langford et ^al.15,16. Questo metodo di studio comportamentale è un approccio di valutazione correlato al dolore, che si basa sull'analisi delle espressioni facciali esibite dai topi sperimentali. La configurazione sperimentale è semplice e prevede una gabbia trasparente e 2 telecamere per la registrazione video. Incorporando tecnologie avanzate 17,18,19 per l'acquisizione automatica dei dati, è possibile ottenere misure comportamentali quantitative e qualitative, migliorando il benessere degli animali durante il monitoraggio comportamentale ²⁰. Di conseguenza, la MGS ha il potenziale per essere applicata nello studio degli effetti di vari stimoli esterni sugli animali in modo ininterrotto e ad libitum. Tuttavia, il processo di assegnazione dei punteggi prevede solo la selezione di alcune (meno di 10) immagini di fotogrammi video per la valutazione da parte dei relatori ed è necessaria una formazione preliminare. L'assegnazione di un punteggio a un gran numero di immagini campione può essere laboriosa. Per superare questa sfida dispendiosa in termini di tempo, diversi studi hanno impiegato tecniche di apprendimento automatico per prevedere il punteggio MGS^21,22. Tuttavia, è importante notare che l'MGS è una misura continua. Pertanto, un modello di classificazione multiclasse sarebbe più adatto per valutare un problema logico e categoriale, come determinare se le immagini di topi che ingeriscono contemporaneamente wasabi e sniffano liquore assomigliano a quelle di topi normali.

In questo studio, è stata proposta una metodologia per studiare l'interazione gusto-odore nei topi. Questa metodologia combina studi comportamentali sugli animali con una rete neurale convoluzionale (CNN) per analizzare le espressioni facciali dei soggetti topo. Due topi sono stati osservati tre volte in condizioni comportamentali normali, durante l'esperienza della nocicezione indotta da wasabi e mentre sniffavano liquore in una gabbia appositamente progettata. Le espressioni facciali dei topi sono state videoregistrate e le immagini dei fotogrammi generate sono state utilizzate per ottimizzare l'architettura di un modello di deep learning (DL). Il modello è stato quindi convalidato utilizzando un set di dati di immagini indipendente e distribuito per classificare le immagini acquisite dal gruppo sperimentale. Per determinare l'entità della soppressione della pungenza del wasabi quando i topi hanno sniffato contemporaneamente il liquore durante il consumo di wasabi, le intuizioni fornite dall'intelligenza artificiale sono state ulteriormente corroborate attraverso la convalida incrociata con un altro metodo di analisi dei dati, il punteggio MGS¹⁶.

Protocollo

In questo studio, per la valutazione del comportamento animale sono stati utilizzati due topi maschi ICR di 7 settimane di peso compreso tra 17 e 25 g. Tutte le procedure di stabulazione e sperimentazione sono state approvate dal Comitato dell'Università Battista di Hong Kong sull'uso di soggetti umani e animali nell'insegnamento e nella ricerca. La stanza degli animali è stata mantenuta a una temperatura di 25 °C e un'umidità ambientale del 40%-70% con un ciclo luce-buio di 12 ore.

1. Design della gabbia

1. Preparare mattoni di acrilonitrile butadiene stirene in 3 diverse dimensioni per la costruzione di gabbie: 8 mm x 8 mm x 2 mm, 16 mm x 16 mm x 6 mm e 32 mm x 16 mm x 6 mm.
2. Preparare una piastra in acrilonitrile butadiene stirene (312 mm x 147 mm x 2 mm) come base della gabbia.
3. Preparare una lastra acrilica non trasparente di 239 mm x 107 mm con uno spessore di 2 mm da utilizzare come piastra inferiore.
4. Preparare una lastra acrilica trasparente di 239 mm x 107 mm con uno spessore di 5 mm da utilizzare come piastra superiore.
5. Preparare una lastra acrilica trasparente di 107 mm x 50 mm con uno spessore di 7 mm da utilizzare come piastra terminale.
6. Costruisci 2 pareti laterali opache impilando i mattoni a un'altezza di 54 mm.
7. Incorporare le lastre acriliche nella gabbia a base di acrilonitrile butadiene stirene, come illustrato nella Figura 1A.
8. Preparare una camera per chows costruita con cinque lastre acriliche trasparenti da 90 mm x 50 mm con uno spessore di 2 mm, come illustrato nella Figura 1B. Tra le 5 piastre acriliche trasparenti, utilizzare 2 piastre per i lati, 1 piastra per la parte superiore, 1 piastra per la parte inferiore e 1 piastra per il terminale.
9. Preparare una piastra in acrilico trasparente di 60 mm x 50 mm e 2 mm come piastra di introduzione al cibo e posizionarla nella camera del chow.

2. Valutazione del comportamento animale

1. Ospita i compagni di cucciolata di 2 topi maschi ICR di 7 settimane insieme in una gabbia normale.
2. Fornisci ai compagni di cucciolata di 2 topi l'accesso gratuito ai pellet di cibo e all'acqua del rubinetto per un periodo di adattamento di 1 settimana.
3. Dopo 1 settimana, introdurre i compagni di cucciolata di 2 topi con una bottiglia di etanolo (~40% v/v).
   NOTA: Assicurati che siano autorizzati ad annusare o inalare l'etanolo acquoso fornito solo su base ad libitum mentre il consumo è limitato.
4. Condurre esperimenti comportamentali utilizzando il modello murino di 9-10 settimane e la gabbia trasparente del cubicolo raffigurata nella Figura 1A.
5. Smontare tutte le lastre acriliche e le lastre di acrilonitrile-butadiene-stirene e pulirle accuratamente. Iniziate sciacquandoli con acqua ultrapura almeno 3 volte e poi asciugateli con carta assorbente. Quindi, spruzzali con etanolo al 75%, quindi puliscili con carta per lenti. Infine, lasciateli asciugare all'aria per almeno 15 minuti.
6. Pesare i topi e registrare il loro peso corporeo prima di ogni replica dell'esperimento comportamentale.
7. Preparare al momento una miscela di wasabi e burro di arachidi pesando 1 g di wasabi commerciale e 4,5 g di burro di arachidi. Mescolateli in un sacchetto di plastica con cerniera.
   NOTA: A causa della volatilità degli isotiocianati nel wasabi, è importante conservare il wasabi commerciale in un congelatore a -20 °C.
8. Pesare e fornire due paste da 0,5 g di burro di arachidi o una miscela di wasabi e burro di arachidi sulla piastra di introduzione del cibo, come illustrato nella Figura 1B, C.
9. Posizionare la piastra di introduzione del chow preparata nella camera dei chow, come illustrato nella Figura 1B, C, per consentire ai 2 topi di avere accesso ad libitum al cibo durante ogni sessione di registrazione video.
10. Riempire il solco sottostante con 30 ml di liquido, acqua pura o liquore (~42% v/v etanolo), per facilitare l'inalazione concomitante, come indicato nella Figura 1B, C.
11. Inizia a registrare utilizzando le fotocamere di 2 smartphone posizionate sui supporti del telefono di ciascun terminale.
    NOTA: Le specifiche dei video sono le seguenti: larghezza del fotogramma, 1920; altezza del telaio, 1080; velocità di trasmissione dati, 20745 kbps; Frequenza fotogrammi, 30,00 fotogrammi al secondo (fps).
12. Posizionare con cura i 2 compagni di cucciolata addestrati di topi nella piattaforma di studio comportamentale animale progettata dall'alto e fissare prontamente la gabbia con la piastra superiore.
    NOTA: Assicurarsi che questo passaggio sia completato entro 15 s.
13. Registra ogni video per 2-3 minuti.
    NOTA: Assicurati che l'intera durata dell'esperimento, dalla preparazione della miscela di burro di arachidi e wasabi al completamento della registrazione video, sia limitata a 5 minuti.
14. Ripeti l'intero esperimento 3 volte.
    NOTA: Assicurarsi che ogni replica dell'esperimento sia separata per almeno 6 ore.
15. Simula diversi scenari.
    NOTA: Ad esempio, in questo lavoro, una coppia di topi è stata utilizzata in 4 gruppi con 4 diversi scenari che sono stati imitati utilizzando l'impostazione sperimentale descritta sopra. Questi scenari includono lo scenario A per lo studio di base, lo scenario B per lo studio di controllo positivo, lo scenario C per lo studio di interazione gusto-odore wasabi-alcol e lo scenario D per lo studio di controllo negativo. La tabella 1 fornisce un riepilogo di questi scenari.

3. Riconoscimento delle immagini

Simile a molti studi sull'elaborazione delle immagini 23,24,25, un modello di classificazione è stato raggiunto addestrando una CNN. Lo script per le operazioni DL è stato scritto in Python v.3.10 su Jupyter Notebook (anaconda3). È disponibile nel seguente repository GitHub: git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git. Per costruire e addestrare la CNN, sono state utilizzate librerie open source, tra cui numpy v.1.21.5, seaborn v.0.11.2, matplotlib v.3.5.2, cv2 v.4.6.0, sklearn v.1.0.2, tensorflow v.2.11.0 e keras v.2.11.0. Queste librerie fornivano gli strumenti e le funzionalità necessarie per sviluppare e addestrare la CNN per il riconoscimento delle immagini.

1. Esportare una serie di immagini di fotogrammi video dai clip video raccolti per generare un set di dati per l'addestramento del modello utilizzando il notebook Jupyter fornito, denominato Step1_ExtractingAndSavingVideoFrameImages.ipynb.
2. Seleziona solo le immagini con almeno 1 mouse consumando la pasta fornita. Esempi delle immagini selezionate sono forniti nella Figura 1 supplementare, nella Figura 2 supplementare, nella Figura 3 supplementare, nella Figura 4 supplementare, nella Figura 5 supplementare, nella Figura 6 supplementare e nella Figura 7 supplementare.
3. Eseguire l'aumento dei dati capovolgendo orizzontalmente le immagini generate implementando lo script fornito nel Jupyter Notebook, denominato Step2_DataAugmentation.ipynb.
4. Riserva i dati dell'immagine da ogni seconda replica per la convalida del modello CNN indipendente esterno. Usare le immagini di ogni prima e terza replica per il training e il test del modello interno.
5. Pre-elaborare i dati dell'immagine usati nella modellazione CNN eseguendo lo script nel Jupyter Notebook, denominato Step3_CNNmodeling_TrainTest.ipynb, incluso il ridimensionamento dell'immagine, la conversione del colore nero e la normalizzazione del segnale dell'immagine.
6. Suddividi i materiali di formazione in set di dati interni di formazione e test in modo 8:2 in modo casuale.
7. Inizializzare l'architettura per CNN. Progetta il numero di output della CNN in base al numero di scenari da esaminare.
   NOTA: Ad esempio, in questo studio, la rete neurale è stata designata per classificare 3 classi. Assicurarsi che lo script per la gestione dello squilibrio dei dati sul peso della classe sia compilato.
8. Trova la combinazione di iperparametri che produce una perdita minima sui campioni di test interni per la costruzione di CNN.
9. Adotta la combinazione ottimale di iperparametri per la costruzione dell'architettura CNN.
10. Aprire i notebook Jupyter forniti Step4_CNNmodel_ExternalValOriginal.ipynb e Step5_CNNmodel_ExternalValFlipped.ipynb. Convalidare il modello raggiunto utilizzando le immagini indipendenti (originali e capovolte) della seconda replica dell'esperimento comportamentale animale.
11. Implementa il modello raggiunto e convalidato per classificare le immagini dei fotogrammi video generate dal gruppo sperimentale utilizzando Jupyter Notebook Step6_CNNmodel_Application.ipynb.
    NOTA: Ad esempio, è lo scenario C in questo lavoro.

4. Punteggio manuale della scala della smorfia del mouse

NOTA: Per convalidare le intuizioni fornite dalla previsione del modello CNN, è stato applicato un altro metodo precedentemente sviluppato e convalidato da Langford et al.¹⁶. Questo metodo prevede il punteggio dell'MGS in base alle 5 unità di azione facciale (AU) specifiche del topo: restringimento orbitale, rigonfiamento del naso, rigonfiamento delle guance, orecchie che si stringono verso l'esterno e cambio dei baffi. A ciascuna UA viene assegnato un punteggio di 0, 1 o 2, che indica rispettivamente l'assenza, la presenza moderata o la presenza evidente dell'UA. Questo sistema di punteggio consente la quantificazione e il ridimensionamento di ciascuna AU per valutare il livello di nocicezione o disagio sperimentato dai topi.

1. Cattura 3 immagini di fotogrammi video dei compagni di cucciolata che ingeriscono la pasta per ogni clip video. Assicurati che ogni fotogramma sia separato da almeno 3 secondi.
2. Codifica in modo cieco e riordina in modo casuale le immagini da diverse classi di scenari in sequenza utilizzando il file modello fornito denominato "shuffleSlides.pptm" (File supplementare 1) ed eseguendo il codice macro incorporato.
3. Invita almeno 10 relatori a valutare le immagini di esempio.
4. Addestra i panelisti a valutare i campioni di immagini utilizzando l'MGS. Fornire ai relatori materiali di formazione che includano l'articolo originale riguardante MGS e il suo manuale^15,16.
5. Calcola il punteggio MGS di ciascun soggetto animale in un fotogramma catturato facendo la media di tutti i punti di punteggio delle corrispondenti 5 AU facciali. Presentare il punteggio MGS come media ± errore di misura standard (SEM).
6. Determinare se esistono differenze statisticamente significative tra diverse classi di scenari mediante l'analisi della varianza a una via (ANOVA) con il test post-hoc di confronto multiplo di Bonferroni.
   NOTA: Un valore di P < 0,05 è considerato statisticamente significativo.

Risultati

L'obiettivo principale di questo studio è quello di stabilire un solido quadro per studiare l'interazione gusto-odore nei topi. Questo framework incorpora l'uso dell'intelligenza artificiale e della QBA per sviluppare un modello di classificazione predittiva. Inoltre, le informazioni ottenute dal DL sono convalidate in modo incrociato con una valutazione quantitativa MGS per un'analisi interna indipendente. L'applicazione principale di questa metodologia è quella di esaminare l'entità della soppressione della nocicezi...

Discussione

Il metodo proposto per studiare l'interazione gusto-olfatto in questo lavoro si basa sul metodo originale di codifica comportamentale per l'espressione facciale del dolore nei topi, che è stato sviluppato da Langford et ^al.16. Diversi articoli pubblicati di recente hanno introdotto la CNN per il tracciamento automatico del volto del mouse e il successivo punteggio MGS 21,26,27,28.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol (EtOH)	VWR Chemicals BDH	CAS# 64-17-5
Acrylonitrile butadiene styrene bricks	Jiahuifeng Flagship Store	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Acrylonitrile butadiene styrene plates	Jiahuifeng Flagship Store	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Allyl isothiocyanate (AITC)	Sigma-Aldrich	CAS# 57-06-7
Anhydrous dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	CAS# 67-68-5
Chinese spirit	Yanghe Qingci	https://www.chinayanghe.com/article/45551.html
Commercial wasabi	S&B FOODS INC.	https://www.sbfoods-worldwide.com
Formic acid (FA)	VWR Chemicals BDH	CAS# 64-18-6
GraphPad Prism 5	GraphPad	https://www.graphpad.com
HPLC-grade acetonitrile (ACN)	VWR Chemicals BDH	CAS# 75-05-8
HPLC-grade methanol (MeOH)	VWR Chemicals BDH	CAS# 67-56-1
Microsoft Excel 2016	Microsoft	https://www.microsoft.com
Microsoft PowerPoint 2016	Microsoft	https://www.microsoft.com
Milli-Q water system	Millipore	https://www.merckmillipore.com
Mouse: ICR	Laboratory Animal Services Centre (The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, China)	N/A
Peanut butter	Skippy	https://www.peanutbutter.com/peanut-butter/creamy
Python v.3.10	Python Software Foundation	https://www.python.org
Transparent acrylic plates	Taobao Store	https://item.taobao.com/item.htm?_u=32l3b7k63381&id=60996545797 0&spm=a1z09.2.0.0.77572e8dFPM EHU