Imaging molecolare di organoidi cerebrali umani mediante spettrometria di massa

Riepilogo

È stato sviluppato un metodo avanzato per l'imaging con spettrometria di massa (MSI) di organoidi cerebrali che consente di mappare le distribuzioni dei metaboliti all'interno di questi modelli. Questa tecnologia offre informazioni sulle vie metaboliche cerebrali e sulle firme dei metaboliti durante lo sviluppo precoce e nella malattia, promettendo una comprensione più profonda della funzione cerebrale umana.

Abstract

I modelli di organoidi cerebrali fungono da potente strumento per studiare lo sviluppo e la funzione del cervello umano. L'imaging con spettrometria di massa (MSI), una tecnologia all'avanguardia, ci consente di mappare la distribuzione spaziale di diverse molecole come lipidi, zuccheri, amminoacidi, farmaci e i loro metaboliti all'interno di questi organoidi, il tutto senza la necessità di sonde molecolari specifiche. I dati MSI di alta qualità dipendono da una meticolosa preparazione del campione. I fissativi svolgono un ruolo fondamentale, ma le opzioni convenzionali come la glutaraldeide, la paraformaldeide e la crioconservazione come il saccarosio possono inavvertitamente avere un impatto sui metaboliti dei tessuti. La fissazione ottimale comporta il congelamento rapido in azoto liquido. Tuttavia, per i piccoli organoidi, un approccio più adatto prevede la transizione degli organoidi direttamente dall'incubatore in una soluzione di inclusione riscaldata, seguita dal congelamento in etanolo raffreddato con ghiaccio secco. Un altro passaggio critico è l'inclusione prima della criosezione, che richiede anche materiali compatibili con MSI, poiché le opzioni tradizionali possono interferire con la deposizione e la ionizzazione della matrice. Qui viene presentato un protocollo ottimizzato per MALDI-MSI ad alta risoluzione di organoidi cerebrali umani, che comprende la preparazione del campione, il sezionamento e l'imaging utilizzando la spettrometria di massa. Questo metodo mostra la distribuzione molecolare di piccoli metaboliti, come gli amminoacidi, con elevata precisione e sensibilità di massa. In quanto tale, insieme a studi complementari sugli organoidi cerebrali, può aiutare a illuminare i processi complessi che governano lo sviluppo precoce del cervello, le traiettorie del destino delle cellule metaboliche e le firme distintive dei metaboliti. Inoltre, fornisce informazioni sulle posizioni precise delle molecole all'interno dell'organoide, arricchendo la nostra comprensione dell'organizzazione spaziale dei modelli 3D di organoidi cerebrali. Con il continuo progresso del campo, si prevede un numero crescente di studi che sfruttano l'MSI per approfondire gli organoidi cerebrali e i sistemi biologici complessi, approfondendo così la comprensione degli aspetti metabolici della funzione e dello sviluppo del cervello umano.

Introduzione

I modelli di organoidi, derivati da cellule staminali tissutali primarie, cellule staminali embrionali o cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)^1,2,3 hanno fatto progredire la ricerca sulla biologia umana offrendo modelli tridimensionali che imitano da vicino le funzioni organo-specifiche, aiutando nello studio dello sviluppo umano, dei meccanismi delle malattie e della scoperta di farmaci ^4,5. In questo contesto, svelare le complessità degli organoidi cerebrali è fondamentale per comprendere lo sviluppo cerebrale sia fisiologico che patologico ^6,7, richiedendo tecnologie come l'imaging con spettrometria di massa (MSI)^8,9. L'MSI, a differenza della tradizionale spettrometria di massa, consente la mappatura diretta e senza marcatura di centinaia di migliaia di biomolecole all'interno di una singola sezione di tessuto, fornendo informazioni dettagliate sulla distribuzione spaziale di molecole - come lipidi, peptidi, amminoacidi, farmaci e i loro metaboliti - senza la necessità di sonde molecolari specifiche^10,11. Inoltre, le immagini molecolari MSI possono essere co-registrate su sezioni istologiche e immunocolorate, fornendo una visione completa della morfologia dei tessuti, della specificità cellulare e del contenuto molecolare.

L'MSI è molto promettente per la ricerca sugli organoidi, offrendo approfondimenti sulle basi molecolari delle malattie, sulle relazioni genetico-fenotipo e sulle risposte agli stimoli ambientali 12,13,14,15. Nell'industria farmaceutica, l'MSI facilita l'analisi dell'assorbimento, della distribuzione, del metabolismo e dell'eliminazione dei farmaci in modelli preclinici^11,16. Inoltre, aiuta a risolvere i loro metaboliti biotrasformati, che possono essere farmacologicamente attivi¹⁷.

Tra i metodi MSI, predominano il desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI), la ionizzazione elettrospray a desorbimento (DESI) e la spettrometria di massa di ioni secondari (SIMS) 9,18,19,20,21. Di questi, MALDI-MSI si distingue per la sua versatilità, l'ampia gamma di massa, le capacità di analisi diretta e la compatibilità con vari composti chimici tessuto-specifici²². Tuttavia, nonostante il suo potenziale, l'applicazione di MALDI-MSI nella ricerca sugli organoidi cerebrali rimane poco esplorata. Per colmare questa lacuna, è stato introdotto un protocollo su misura per l'analisi MALDI-MSI (HR-MALDI-MSI) ad alta risoluzione degli organoidi cerebrali per ottimizzare la conservazione dei tessuti, la selezione della matrice e le condizioni di imaging, garantendo un'acquisizione affidabile di dati di alta qualità¹⁵. Questo protocollo dettagliato mostra le capacità di HR-MALDI-MSI di fornire ai ricercatori l'arsenale aggiuntivo per sfruttare la potenza di questa tecnologia per esplorare il panorama metabolico degli organoidi con un dettaglio senza precedenti.

Protocollo

L'overflow generale del protocollo è illustrato nella Figura 1. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione della sezione dell'organoide cerebrale

1. Preparare organoidi cerebrali (di dimensioni 2-3 mm quando raggiungono i 30-60 giorni in coltura) da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) seguendo i rapporti precedentemente pubblicati^23,24 e raccoglierli al momento desiderato utilizzando punte a foro largo.
   1. Lavare gli organoidi preparati tre volte con 1x soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) senza CaCl₂ e MgCl₂ a temperatura ambiente per risciacquare il terreno e poi molto rapidamente con acqua distillata a temperatura ambiente per risciacquare eventuali sali dal DPBS.
2. Preparare il 10% della soluzione di gelatina dalla pelle fredda del pesce mescolando e riscaldando la gelatina (10 mg in 100 ml di DPBS) a 70-80 °C per 2 ore, quindi spostare la soluzione nell'incubatore a 37 °C per 30 minuti per rimuovere le bolle e bilanciarla alla temperatura dell'incubatore in cui sono stati coltivati gli organoidi.
   NOTA: Si consiglia di preparare la gelatina fresca per ogni esperimento, ma può essere utilizzata per un massimo di 1 settimana (conservare a 4 °C) se necessario. La gelatina si solidifica a temperatura ambiente e deve essere riscaldata prima dell'uso come soluzione di inclusione per diventare liquida.
3. Fissare l'organoide al centro di uno stampo di plastica (25 mm x 20 mm x 5 mm) con la punta piccola della pipetta e versare delicatamente la soluzione di gelatina al 10% nello stampo fino a quando l'organoide non è completamente immerso (lo stampo deve essere riempito approssimativamente a metà).
   1. Mettere lo stampo in una capsula di Petri su ghiaccio secco contenente etanolo freddo al 100% per congelarlo rapidamente (1-2 min). Quando è completamente congelato, evidenziato dal cambiamento di colore in bianco solido, estrarre il blocco di organoide-gelatina dalla capsula di Petri, avvolgerlo in un foglio di alluminio o metterlo in una tazza di latta, sigillato per evitare la concentrazione di acqua, e conservarlo a -80°C fino al momento della criosezione.
4. Per la criosezione, posizionare i blocchi di plastica contenenti organoidi all'interno della criocamera a una temperatura compresa tra -20 °C e -25 °C per 10-15 minuti per equilibrarsi con la temperatura della camera. Sezionare gli organoidi in sezioni da 14 μm utilizzando criotomo e scongelamento su vetrini rivestiti di ossido di indio e stagno (vetrini ITO) per MSI.
5. Scansiona immediatamente le sezioni strutturalmente uniformi nello spettrometro di massa o sigillale nel contenitore e conservale a -80°C per studi successivi.

2. Preparazione della matrice e applicazione per MALDI-MSI

1. Per MALDI-MSI, spruzzare i vetrini e rivestire le sezioni di tessuto con la matrice, un composto organico che aiuta a ionizzare diversi metaboliti²⁵. Diverse matrici vengono utilizzate per l'imaging di diverse specie di molecole; Pertanto, in primo luogo, deve essere scelta la matrice più appropriata per lo studio.
   NOTA: Questo studio si è concentrato sulla localizzazione e la distribuzione di piccoli metaboliti e aminoacidi correlati alle vie metaboliche mitocondriali, e la matrice è stata scelta di conseguenza (per la mappatura dei lipidi, vedere Cappuccio et al.)¹⁵.
2. Per prima cosa, dopo aver tolto i vetrini ITO da -80 °C, mettere immediatamente il vetrino in un essiccatore per 20 minuti per ridurre al minimo la condensa dell'acqua atmosferica sulle superfici.
3. Preparare N-(1-naftil) etilendiammina dicloridrato (NEDC), che è una matrice adatta per piccoli metaboliti in quanto fornisce un forte segnale dell'analita di interesse senza interferire con i segnali di fondo sotto il m/z di 500 Da²⁶. Spruzzare 10 mg/mL di soluzione NEDC in metanolo al 70% sulle sezioni dell'organoide dopo l'essiccazione del vetrino utilizzando uno spruzzatore pneumatico riscaldato.
4. Impostare i parametri dello spruzzatore a matrice come segue: temperatura dell'ugello = 75 °C, velocità dell'ugello = 1.250 mm/min, portata della pompa = 100 μL/min, numero di passaggi = 8, distanza tra i binari = 2,5 mm, portata del gas 3L/min, tempo di asciugatura =10 s e pressione dell'azoto gassoso di 10 psi.

3. Strumentazione MALDI-MSI

1. Per ottenere una piattaforma MALDI-MSI ad alta risoluzione per la visualizzazione dei metaboliti degli organoidi cerebrali, è necessario montare una sorgente ionica MALDI con un'interfaccia a imbuto a doppio ione su uno spettrometro di massa.
2. Utilizzare un laser Nd Q-switched a triplica frequenza con una lunghezza d'onda di 349 nm, una frequenza di ripetizione di 1 kHz e un'energia dell'impulso di circa 1,3-1,4 μJ.
3. Per evitare il sovracampionamento, focalizzare il laser su una dimensione dello spot di ~15 μm di diametro.
4. Collegare il campione allo stadio dell'iniettore MALDI. Azionare e mantenere l'imbuto ionico ad alta pressione a 7,4-7,5 Torr e mantenere l'imbuto ionico a bassa pressione a 1,6-1,8 Torr.
5. Applicare tensioni di radiofrequenza di 604 kHz, 80 V0 di picco e 780 kHz, 191 V0 di picco rispettivamente agli imbuti ionici ad alta e bassa pressione.
6. Per migliorare la sensibilità per i piccoli metaboliti nell'intervallo di massa bassa, ridurre le ampiezze RF nell'imbuto a bassa e alta pressione della sorgente MALDI-MSI a circa il 20% e il 15%, rispettivamente.
7. Impostare la risoluzione di massa su 70.000. Selezionare l'area e la dimensione dei pixel (25 μm/pixel) da misurare nel software dell'iniettore MALDI.

4. Acquisizione e analisi dei dati MALDI-MSI

1. Acquisisci dati nell'intervallo m/z di 80-900 sia in modalità ioni negativi che positivi. Scansiona i campioni con una risoluzione laterale di 25 μm per pixel per sezioni di organoidi da 14 μm.
2. Impostare il tempo di iniezione ionica sullo spettrometro di massa a 250 ms e acquisire gli spettri di massa in trasformata di Fourier (FTMS) in modalità profilo mentre il controllo automatico del guadagno (AGC) è disattivato²⁶.
3. Utilizza i picchi della matrice NEDC come calibrazione di massa online interna, ottenendo una precisione di massa migliore di ±5 ppm.
4. Utilizzare un software compatibile per elaborare i dati. Importa i dati spettrali MSI direttamente nel software, quindi esegui la correzione della linea di base utilizzando un algoritmo di convoluzione e normalizza i dati utilizzando la conta ionica totale (TIC).
5. Genera l'elenco delle funzioni delle immagini ioniche dai file di dati grezzi utilizzando una larghezza del contenitore di Δm/z = 0,01 o ±5 ppm per distinguere le immagini m/z in base al difetto di massa e alla copertura dei pixel.
6. Genera immagini a falsi colori (Jet) o RGB (rosso-verde e blu) da singole specie di ioni metaboliti. Caricare l'elenco m/z dei file di dati grezzi ottenuti da MALDI-MSI nel database del metaboloma umano (HMDB) (tolleranza di massa <5 ppm rispetto al m/z teorico) per identificare i metaboliti.
   NOTA: La massa esatta e la formula e la struttura previste del metabolita ottenute dai dati LC-MS/MS vengono utilizzate anche per interrogare i database di metabolomica (ad esempio, HMDB, Metlin) per il confronto e l'identificazione dei metaboliti.

Risultati

Ecco un protocollo che ottimizza l'imaging molecolare (metabolico) utilizzando MSI (Figura 1, vedi anche Cappuccio et al.)¹⁵. I dati più affidabili e la conservazione della morfologia dei tessuti sono stati ottenuti con il 10% di gelatina proveniente da pelle di pesce fredda, come confermato dalla colorazione istologica delle sezioni seriali. Utilizzando l'incorporazione di gelatina di pesce di organoidi cerebrali umani per 60 giorni, i metaboliti correlati al ciclo di Krebs sono stati mappati utilizzando MSI, dimostrando la loro distribuzione spaziale (Figura 2).

Nel complesso, il protocollo ottimizzato ha costantemente fornito risultati robusti, con il 10% di gelatina proveniente dalla pelle fredda del pesce come materiale di inclusione preferito e le impostazioni di spruzzatura della matrice NEDC ottimizzate per migliorare la risoluzione dell'immagine. I piccoli metaboliti rilevati negli organoidi cerebrali forniscono preziose informazioni sulle complessità molecolari di questo tessuto.

Figura 1: Pipeline generale dello studio del metaboloma degli organoidi cerebrali umani. Gli organoidi derivati dai fibroblasti dell'individuo tramite cellule staminali pluripotenti indotte sono utilizzati per LC-MS e MSI per evidenziare la distribuzione spaziale dei metaboliti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Mappatura dei metaboliti correlati al ciclo di Krebs. Identificazione e distribuzione di metaboliti correlati al ciclo di Krebs utilizzando organoidi a 60 giorni derivati da controlli sani utilizzando MSI. Sono mostrate la colorazione con ematossilina ed eosina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il protocollo perfezionato per MALDI-MSI ad alta risoluzione di organoidi cerebrali umani affronta meticolosamente i passaggi fondamentali per garantire l'affidabilità dei risultati. La conservazione del campione risulta fondamentale e, per evitare fessurazioni e danni ai tessuti, viene proposto un metodo di congelamento alternativo che prevede una soluzione di inclusione riscaldata ed etanolo raffreddato con ghiaccio secco. Questo protocollo funziona meglio per tessuti di dimensioni minime, come gli organoidi cerebrali umani¹⁵. I materiali di inclusione come il composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) e l'inclusione di paraffina fissata in formalina (FFPE) sono sconsigliati a causa della loro interferenza con la deposizione e la ionizzazione della matrice. Invece, il 10% di gelatina proveniente dalla pelle fredda del pesce è evidenziato come la soluzione di inclusione ottimale, dimostrando la sua efficacia nel preservare l'integrità dei tessuti durante la criosezione¹⁵. Inoltre, la scelta della matrice e delle sue tecniche di deposizione, come l'irrorazione a secco, è indispensabile per ridurre al minimo la delocalizzazione dei piccoli metaboliti a basso m/z e migliorare la risoluzione dell'immagine.

La robustezza e l'affidabilità del protocollo sono confermate dal successo del rilevamento e della visualizzazione di un ampio spettro di molecole in organoidi cerebrali umani¹⁵, fornendo preziose informazioni sulla loro distribuzione spaziale e sul potenziale significato biologico. Questi risultati aumentano significativamente la comprensione dell'intricato panorama molecolare all'interno degli organoidi cerebrali, chiarendo le vie di segnalazione fondamentali e i processi metabolici alla base dello sviluppo e della funzione cerebrale.

Mentre i dati attuali forniscono nuove informazioni sulla localizzazione di diverse specie, la sorgente di imaging Spectroglyph MALDI utilizzata in questo studio deve ancora raggiungere la risoluzione a livello di singola cellula (attualmente a ~10-20 μm). Altre piattaforme, come il timsTOF di Bruker e l'MRT di Water, possono fornire una risoluzione a cella singola a 5 μm e, quindi, è importante tenere presente lo strumento da utilizzare per la sperimentazione.

Nonostante questi vincoli, l'HR-MALDI-MSI ad alta risoluzione degli organoidi cerebrali è molto promettente. La capacità di mappare le distribuzioni di metaboliti e lipidi all'interno degli organoidi offre un punto unico sulle traiettorie del destino cellulare metabolico, sui percorsi e sulle firme distinte cruciali per lo sviluppo e la maturazione degli organoidi. Questa metodologia funge da ponte tra l'istologia convenzionale e l'analisi molecolare, facilitando una comprensione più profonda delle interconnessioni tra genoma, fenomeno e risposte ambientali.

In sintesi, il protocollo ottimizzato per HR-MALDI-MSI di organoidi cerebrali umani costituisce una risorsa preziosa per i ricercatori che esplorano i modelli di organoidi. Questo metodo getta le basi per un'ulteriore delucidazione delle complessità molecolari alla base dello sviluppo e della funzione del cervello, affrontando meticolosamente i passaggi critici, la risoluzione dei problemi e riconoscendo i limiti. Man mano che la tecnologia MSI si evolve e diventa sempre più accessibile, è pronta a far progredire la nostra comprensione dello sviluppo umano precoce, della modellazione delle malattie e della scoperta di farmaci.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1S, 2S)-1,2-di-1-Naphthyl-ethylenediamine dihydrochloride	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	1052707-27-3	Matrix substance for MALDI-MS, ≥99.0% (HPLC)
1× Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Life Technologies, USA	14190-144	Without CaCl2 and MgCl2
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA	2069G	Reduce potential contamination
Cryomolds	Tissue-Tek	25608-916	Standard mold with flat-surface
Entellan	Fisher Scientific	M1079610500	Cover slips
Eosin Y	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	E511-25	Certified Biological Stain
Fish gelatin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	G7041	Powder form from cold water fish skin
Hematoxylin	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	517-28-2	Certified biological stain Elevated pressure imaging source with
HTX M5+ sprayer	HTX Technologies LLC, Carrboro, USA		Matrix sprayer
Indium tin	Hudson Surface Technology,	PL-IF-000010-P25	Provide a conductive surface for MALDI imaging
MALDI ion source	Spectroglyph LLC, USA		dual ion funnel interface
Methanol	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	67-56-1	HPLC grade
oxide (ITO) conductive–coated slides	New York, United States
Porcine gelatin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	G1890	Powder form from porcine skin
Q-Exactive mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA		High resolution mass spectrometry
SCiLS Lab software	version 2024a Pro		for processing the data
Water	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	W6500	HPLC grade
	(Waltham, MA, USA)