Quantificazione dei fenotipi oculari di Drosophila melanogaster : un approccio computazionale che integra ilastik e Flynotyper

Riepilogo

Il sistema oculare Drosophila è uno strumento utile per studiare vari processi biologici, in particolare le malattie neurodegenerative umane. Tuttavia, la quantificazione manuale dei fenotipi dell'occhio ruvido può essere distorta e inaffidabile. Qui descriviamo un metodo con cui ilastik e Flynotyper vengono utilizzati per quantificare il fenotipo dell'occhio in modo imparziale.

Abstract

L'occhio composto di Drosophila melanogaster è una schiera ben strutturata e completa di circa 800 ommatidi, che presentano un andamento simmetrico ed esagonale. Questa regolarità e facilità di osservazione rendono il sistema oculare di Drosophila un potente strumento per modellare varie malattie neurodegenerative umane. Tuttavia, i modi per quantificare i fenotipi anormali, come la classificazione manuale dei punteggi di gravità degli occhi, hanno dei limiti, specialmente quando si classificano le alterazioni deboli nella morfologia dell'occhio. Per superare queste limitazioni, sono stati sviluppati approcci computazionali come Flynotyper. L'uso di una luce anulare consente di ottenere immagini di migliore qualità che accedono all'integrità dei singoli ommatidi. Tuttavia, queste immagini non possono essere analizzate direttamente da Flynotyper a causa delle ombre sugli ommatidi introdotte dalla luce anulare. Qui, descriviamo un modo imparziale per quantificare i fenotipi dell'occhio ruvido osservati nei modelli di malattia di Drosophila combinando due software, ilastik e Flynotyper. Pre-elaborando le immagini con ilastik, è possibile ottenere una quantificazione di successo del fenotipo dell'occhio ruvido con Flynotyper.

Introduzione

Il genoma di Drosophila melanogaster contiene ~75% di ortologhi genici umani correlati alla malattia. Inoltre, durante lo sviluppo dell'occhio di Drosophila, vengono espressi circa due terzi dei geni nel genoma, rendendo l'occhio di Drosophila un sistema genetico eccezionale per studiare varie funzioni molecolari e cellulari, lo sviluppo e i modelli di malattia ^1,2. Pertanto, il sistema oculare di Drosophila è un utile strumento sperimentale per studiare vari processi biologici.

L'occhio composto di Drosophila è una serie ben strutturata e completa di ~800 ommatidi che mostrano un modello simmetrico ed esagonale³. La regolarità di questo modello esagonale può essere utilizzata per stimare l'effetto dell'introduzione di mutazioni e cambiamenti nell'espressione genica nella morfologia dell'occhio⁴. Studi precedenti che richiedono la valutazione della morfologia oculare si sono basati in gran parte sulla classificazione manuale della gravità dei fenotipi oculari rilevati ad occhio nudo. Per classificare i fenotipi oculari, le immagini della morfologia esterna dell'occhio vengono scattate con uno stereomicroscopio ^5,6. Il fenotipo oculare di ciascun gruppo viene valutato suddividendo l'occhio esterno in quattro aree e calcolando la proporzione di degenerazione in ciascuna area ^5,6. Quindi, i valori vengono utilizzati per calcolare le medie che vengono confrontate con i valori ottenuti dai moscerini di controllo⁷. Il punteggio si basa sull'entità della fusione, sulla perdita di ommatidi e sull'organizzazione delle setole ^7,8. Le foto dell'occhio di mosca scattate con uno stereomicroscopio vengono acquisite da un ricercatore e l'analisi del fenotipo oculare viene eseguita da un altro ricercatore con set di tripla convalida ^7,8.

Quando si tratta di classificare deboli alterazioni nella morfologia dell'occhio ad occhio nudo, ci sono limitazioni⁴. Per superare questi limiti, sono stati sviluppati approcci computazionali come FLEYE e Flynotyper ^1,9. Flynotyper è un nuovo metodo computazionale per stimare quantitativamente i cambiamenti morfologici nel sistema oculare di Drosophila¹. Rileva automaticamente l'occhio di Drosophila e il singolo ommatidio, calcolando i punteggi fenotipici (P-Score) in base all'irregolaritàdell'occhio¹. Un P-Score più alto indica che l'occhio della mosca è più degenerato. Questo software è stato utilizzato con successo per quantificare l'anomalia degli occhi di Drosophila ¹⁰. Sebbene Flynotyper garantisca un processo automatizzato, non può ancora essere applicato con successo ad alcune immagini oculari acquisite con vari metodi di microscopia ottica.

Qualitativamente, preferiamo una sorgente luminosa ad anello rispetto a una sorgente luminosa a punto singolo, in quanto offre una rappresentazione più accurata di ciascun ommatidio. Tuttavia, quando si utilizza la luce anulare, si genera un'ombra a forma di anello nella parte superiore di ciascun ommatidio a causa della forma emisferica dell'ommatidio. Questa ombra a forma di anello inibisce il rilevamento accurato dell'ommatidia da parte di Flynotyper, portando a un calcolo errato dei P-Score.

Per superare questi problemi, abbiamo implementato ilastik, uno strumento basato sull'apprendimento automatico per varie analisi, per classificare gli ommatidi nelle immagini dell'occhio di mosca¹¹. Abbiamo quindi inserito le immagini generate da ilastik in Flynotyper per calcolare i P-Score. Questo ci permette di quantificare i difetti morfologici dell'occhio di Drosophila in modo imparziale¹.

Protocollo

1. Preparazione alla quantificazione

1. Scarica e installa ilastik¹¹, ImageJ e il plug-in ImageJ Flynotyper¹. Vedere la Tabella dei materiali per i collegamenti ai siti Web all'installazione. Scarica i pacchetti appropriati in base al sistema operativo del computer (Mac, Windows, Linux, ecc.). Seguire le istruzioni di installazione esattamente come indicato.
   NOTA: È indispensabile seguire le indicazioni esattamente come indicato nei link forniti. Il computer utilizzato necessita di un sistema operativo a 64 bit; In caso contrario, non ci sono altre specifiche richieste. Vedere la Tabella dei materiali per le specifiche del computer del sistema utilizzato per questo protocollo.
2. Usare un'immagine standard per eseguire il training del modello di Machine Learning. Scatta un'immagine di un occhio di mosca sano utilizzando un microscopio ottico con una luce anulare (come w1118 x GMR-GAL4), utilizzando il centro dell'occhio come punto focale. Analizza maschi e femmine separatamente; Pertanto, acquisisci un'immagine standard per maschi e femmine.
   NOTA: Le impostazioni variano notevolmente a seconda del microscopio e della fotocamera. Vedere il secondo paragrafo della discussione per informazioni più generali sulla preparazione della mosca e sull'acquisizione delle immagini.
3. Scatta immagini degli occhi di mosca sperimentali utilizzando le stesse impostazioni utilizzate per l'acquisizione di immagini standard.
   NOTA: Un buon orientamento è fondamentale per una quantificazione accurata. Vedere la Figura 4 come esempio per un corretto orientamento.

2. Utilizzo di ilastik per rilevare gli ommatidi dalle immagini dell'occhio di mosca

1. Prima di iniziare l'analisi, assicurarsi che tutti i gruppi sperimentali, indipendentemente dalla condizione sperimentale, si trovino nella stessa cartella di file per semplificare i processi successivi. Assicurati che i file siano denominati in modo appropriato per identificare i gruppi sperimentali e distinguere tra maschi e femmine.
   NOTA: Si consiglia di stampare il protocollo e di utilizzare il computer per ingrandire le figure, poiché questo protocollo è più facilmente seguibile visivamente.
2. Apri il software.
   NOTA: Si consiglia di non tenere aperte altre applicazioni durante l'esecuzione del software; In caso contrario, il computer potrebbe funzionare molto lentamente, in particolare nei sistemi più vecchi o meno robusti.
3. Clicca su Crea nuovo progetto | Altri flussi di lavoro, scegliere Conteggio densità celle e selezionare una posizione in cui salvare il file di progetto (Figura 1A).
4. Fare clic su 1. Dati di input | Aggiungi nuovo | Aggiungi immagini separate. Scegliere l'immagine standard (Figura 1B).
5. Fare clic su 2. Selezione delle funzioni e selezionare le funzioni da utilizzare. Selezionare le funzioni mostrate nella Figura 1C; Scegli più valori Sigma per aumentare la sensibilità (ad esempio, 10, 15, 20, ecc.).
   NOTA: Se vengono selezionate troppe caselle, il programma potrebbe funzionare per molto tempo.
6. Fare clic su 3. Conteggio e impostare il valore sigma in primo piano su 5.00. Contrassegnare 50 o più ommatidium individuali utilizzando lo strumento Primo piano sull'immagine standard.
   NOTA: cinquanta marcature sono in genere adeguate per l'analisi; tuttavia, più ommatidi sono marcati, più accurati saranno i risultati (Figura 1D).
7. Fare clic su 3. Conteggio e utilizzare lo strumento Sfondo per contrassegnare l'esterno degli ommatidi (Figura 1E). Disegna linee verdi a forma di reticolo attorno agli ommatidi.
   NOTA: Simile a più segni sugli ommatidi, più linee verdi vengono tracciate, più accurati saranno i risultati.
8. Fare clic su 4. Esportazione della densità | Scegliere Esporta impostazioni immagine per configurare le impostazioni dell'immagine (Figura 1F). Fare clic su Informazioni file di output | selezionare Formato e tif per ulteriori analisi in Flynotyper.
9. Fare clic su 5. Elaborazione batch | Selezionare File di dati grezzi e selezionare tutte le foto sperimentali di mosche da analizzare (Figura 1G). L'elenco delle immagini importate da analizzare è visualizzato in Seleziona file di dati grezzi (Figura 1H). Fai clic su Elabora tutti i file nella parte inferiore dei 5. Sezione Elaborazione batch .
   NOTA: Come promemoria, le analisi maschili e femminili devono essere eseguite separatamente. A seconda del computer utilizzato, questo passaggio può richiedere 10 minuti o più, soprattutto se sono presenti molte immagini importate.
10. Al termine del software, controllare la stessa cartella di file contenente le immagini sperimentali dell'occhio di mosca; ci saranno immagini nere denominate "YourSampleName_Probabilities" (Figura 1I).

3. Utilizzo di ImageJ per preparare le foto per Flynotyper

1. Apri il file .tif generato da ilastik (le caselle nere) in ImageJ.
   NOTA: Ogni file .tif generato da ilastik deve essere gestito separatamente.
2. Usa lo strumento Selezione rettangolo per creare un rettangolo attorno solo all'occhio. Dopo aver disegnato il rettangolo, ritagliare l'area scegliendo Ctrl + X o Ctrl + C (Figura 2A). Attendi che appaia una casella nera a forma di contorno del rettangolo.
   NOTA: Il sistema operativo del computer determinerà se utilizzare 'Ctrl + X' o 'Ctrl + C'. Di solito, "Ctrl + X" è per Windows e "Ctrl + C" è usato per Mac.
3. Apri l'occhio di mosca ora tagliato usando ImageJ; clicca su File | Nuovo | Appunti interni (Figura 2B).
4. Salva l'occhio di mosca tagliato come JPEG facendo clic su File | Salva con nome | Jpeg. Le immagini tagliate si trovano ora nella stessa cartella di file delle immagini sperimentali originali.
   NOTA: Per semplificare il passaggio successivo, si consiglia di creare una nuova cartella di file chiamata "taglia" e inserire tutte le immagini tagliate in quella cartella.

4. Utilizzo di Flynotyper per calcolare i punteggi fenotipici

1. Apri Flynotyper come plug-in ImageJ facendo clic su Plug-in | Flynotyper.
2. Seleziona Aggiungi genotipi e apri la cartella contenente le immagini dell'occhio di mosca tagliata (cartella dei file tagliati). Il nome della cartella apparirà in Genotipi (Figura 2C).
3. Selezionare le caselle Microscopio ottico e Verticalmente, ma regolare di conseguenza se necessario. Selezionare le caselle Stabilità e Distanza dal centro sotto Rango ommatidi di: (Figura 2C).
4. Per il numero di ommatidi classificati considerati, input 200.
   NOTA: In generale, 200 è un buon numero, ma regolate di conseguenza in base alle preferenze.
5. Fare clic su Esegui e attendere che vengano visualizzati i risultati dell'analisi (Figura 2D).
   NOTA: Questo passaggio può richiedere 5 minuti o più (o meno) a seconda della potenza di elaborazione del computer utilizzato.
6. Copia e incolla il file di esempio e il P-Score nel software statistico per ulteriori analisi.

Risultati

In uno studio precedente, abbiamo utilizzato questo protocollo per determinare i modificatori genetici della proteina VCP mutante legata alla sclerosi laterale amiotrofica con demenza frontotemporale (ALS-FTD)¹². Inoltre, questo metodo è stato utilizzato anche in un altro articolo per valutare la tossicità dell CHCHD10 ALS-FTD mediata da^S59L, anche quando si utilizza un vecchio stereomicroscopio¹³. Per convalidare ulteriormente...

Discussione

Gli ommatidi di Drosophila costituiscono un sistema utile per lo studio di varie funzioni biologiche e malattie genetiche. La regolarità degli ommatidi è una buona misura per esaminare l'effetto delle mutazioni genetiche⁴. Anche se esistono diversi metodi per calcolare la regolarità ommatidiale, come la classificazione manuale, questi metodi possono essere fortemente distorti. Per superare questo approccio distorto, sono stati sviluppati strumenti semi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer specifications			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Download software here: https://www.ilastik.org/download.html	Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system.
ImageJ		Download software here: https://imagej.net/ij/download.html	Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	System and software used for z-stack acquisition.
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived.