Controllo spazio-temporale dell'attività proteica attraverso la regolazione allosterica optogenetica

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'applicazione di un dominio di commutazione allosterica attivato dalla luce blu (LightR) ingegnerizzato per il controllo spaziotemporale reversibile dell'attività proteica. Utilizzando la tirosin-chinasi Src come modello, questo studio offre un protocollo elaborato per lo sviluppo e la caratterizzazione di Src regolata dalla luce (LightR-Src). Dimostra la versatilità di questo approccio in tutte le classi di enzimi.

Abstract

L'optogenetica offre il potenziale per imitare il complesso controllo spazio-temporale dell'attività enzimatica fino a una risoluzione subcellulare. Tuttavia, la maggior parte degli approcci optogenetici spesso affronta sfide significative nell'integrazione di più capacità in un unico strumento applicabile a un'ampia gamma di proteine bersaglio. Ottenere un controllo preciso sulla cinetica ON/OFF, garantire la minima perdita al buio e dimostrare prestazioni efficienti nelle cellule di mammifero con precisione subcellulare sono alcune delle sfide più comuni affrontate in questo campo. Una soluzione promettente risiede nell'applicazione di domini sensibili alla luce progettati razionalmente per controllare allostericamente l'attività proteica. Utilizzando questa strategia, abbiamo generato un metodo optogenetico che combina tutte le caratteristiche desiderate. L'approccio prevede l'incorporazione del modulo di commutazione allosterica regolato dalla luce (LightR) nella proteina bersaglio per regolare l'attività enzimatica utilizzando la luce blu (465 nm). Il dominio LightR viene generato collegando due domini fotorecettori Vivid (VVD), creando un morsetto sensibile alla luce che può essere incorporato in un piccolo anello flessibile all'interno del dominio catalitico di un enzima. Nel suo stato di oscurità, il morsetto LightR è aperto, distorcendo così il dominio catalitico dell'enzima e inattivandolo. Dopo l'esposizione alla luce blu, il dominio LightR si chiude e ripristina la struttura del dominio catalitico e l'attività enzimatica. In questo manoscritto, discutiamo le strategie di progettazione per generare una proteina chinasi regolata dalla luce e dimostriamo il suo controllo attraverso la luce blu, la reversibilità, la cinetica e la regolazione precisa a livello subcellulare, consentendo una stretta precisione spaziotemporale. Utilizzando la tirosina chinasi Src come modello, mostriamo un protocollo per regolare efficacemente l'attività chinasica LightR-Src. Dimostriamo anche l'applicabilità di LightR in diverse classi di enzimi, ampliando l'utilità del sistema di strumenti nell'affrontare questioni meccanicistiche delle vie di segnalazione in diverse malattie.

Introduzione

La capacità della cellula di interpretare i segnali esterni e convertirli in risposte specifiche in contesti fisiologici o patologici è diretta da gruppi dedicati di proteine. Il contributo di qualsiasi proteina a tali risposte complesse è spesso definito dalla sua posizione subcellulare, dal livello di espressione e dalla tempistica dell'attivazione transitoria, sostenuta o oscillatoria. L'analisi del ruolo di questi singoli parametri nella regolazione del segnale richiede metodi in grado di replicare l'intricato controllo spazio-temporale dell'attività proteica a livello subcellulare. Le tecniche tradizionali come la manipolazione genetica e gli inibitori di piccole molecole non sono all'altezza in questo senso. Al contrario, le tecniche optogenetiche promettono il potenziale per la dissezione dei processi biologici manipolando o imitando i processi fisiologici e patologici. Tuttavia, gli strumenti attuali spesso mancano di un'ampia applicabilità o di un controllo subcellulare. Diverse strategie esistenti raggiungono una stretta regolazione della localizzazione e delle interazioni proteiche; ma mancano di controllo diretto sull'attività enzimatica 1,2,3,4. Altri consentono la regolazione dell'attività enzimatica, ma possono mancare di controllo subcellulare o avere un'applicabilità limitata in diverse classi di enzimi 5,6,7,8,9. In questo documento protocollare, descriviamo un nuovo metodo di ingegneria proteica che combina i vantaggi dell'optogenetica in un unico strumento: stretta regolazione temporale, cinetica regolabile, controllo subcellulare e ampia applicabilità enzimatica¹⁰. Abbiamo ingegnerizzato un dominio regolato dalla luce (LightR) che funziona come un interruttore allosterico quando viene inserito nella proteina bersaglio di interesse. Questa strategia consente uno stretto controllo spazio-temporale dell'attivazione e della disattivazione di una proteina di interesse nelle cellule viventi.

In questo articolo, viene discussa la progettazione e la strategia di applicazione dello strumento optogenetico LightR in diverse classi di enzimi. Questo studio offre un protocollo passo-passo per lo sviluppo, la caratterizzazione e l'applicazione della tirosin-chinasi Src regolata dalla luce (LightR-Src). Lo studio dimostra ulteriormente la sintonizzabilità della cinetica di inattivazione dell'interruttore LightR. L'interruttore LightR a lenta inattivazione può mantenere l'attività enzimatica con una frequenza di illuminazione ridotta, mentre la versione a ciclo rapido, FastLightR, richiede un'illuminazione più frequente per l'attivazione, ma mostra un'inattivazione rapida quando l'illuminazione è spenta. L'attivazione/inattivazione di FastLightR-Src nelle cellule viventi induce cicli di diffusione e retrazione cellulare. La diffusione cellulare indotta da FastLightR-Src concorda con il ruolo fisiologico della chinasi^{Src 11,12}. A causa della rapida cinetica di inattivazione, FastLightR-Src può anche essere regolato a livello subcellulare, con conseguente stimolazione delle sporgenze locali e polarizzazione cellulare. Per dimostrare l'applicabilità dello strumento LightR ad altri tipi di enzimi, guidiamo brevemente i lettori attraverso un successo simile con la chinasi bRaf regolata dalla luce ingegnerizzata (LightR-bRaf, FastLightR-bRaf) e una DNA ricombinasi sito-specifica Cre (LightR-Cre). Nel complesso, questo approccio ha il potenziale per far progredire la nostra comprensione delle complesse vie di segnalazione che modellano la fisiopatologia di diverse malattie.

Protocollo

1. Progettazione e sviluppo di LightR ( Figura 1)

1. Pianificazione strategica
   NOTA: Il dominio LightR è composto da due domini fotorecettori Vivid (VVD) collegati in tandem da Neurospora crassa^13,14,15,16. I VVD omodimerizzano in presenza di luce, e tale dimerizzazione comporta un cambiamento conformazionale che porta l'N-terminale di un monomero VVD accanto al C-terminale di un altro monomero VVD (Figura 1A). Il collegamento di due domini VVD con un linker flessibile crea un dominio simile a un morsetto che verrà aperto al buio e chiuso all'illuminazione con luce blu. L'integrazione di questo morsetto nel dominio catalitico di un enzima consente la regolazione dell'attività mediata dalla luce. Nell'oscurità, il morsetto aperto distorce il dominio, disattivando l'enzima; L'illuminazione con la luce blu provoca la chiusura del morsetto, ripristinando l'attività dell'enzima (Figura 1B). Questo concetto può essere applicato a enzimi di varie famiglie, tra cui le protein chinasi e le DNA ricombinasi¹⁰ (Figura 1C).
   1. Progettazione di LightR
      1. Per collegare due molecole di VVD, utilizzare un linker flessibile di 22 aminoacidi (GGS)4G(GGS)3 tra ciascun monomero.
         NOTA: Il linker offre una flessibilità e una lunghezza sufficienti per adattarsi all'associazione e alla dissociazione dei monomeri VVD.
      2. Aggiungere i linker GPGGSGG e GSGGPG rispettivamente ai termini N e C del dominio LightR.
         NOTA: Potrebbe essere necessario regolare la lunghezza e la composizione dei linker per una proteina specifica. I linker GSG più corti e Gly singoli vengono utilizzati abitualmente quando è necessaria una regolazione più rigorosa. Anche le dimensioni dell'ansa di inserzione e la sua vicinanza ai residui catalitici influenzeranno l'intervallo dinamico di regolazione. È più probabile che anelli più corti forniscano una regolazione più stretta dell'attività catalitica, ma possono comportare una minore attività dopo l'illuminazione. La sequenza del dominio LightR è fornita nella Tabella supplementare 1.
   2. Inserimento di LightR
      NOTA: Un sito di inserzione LightR adatto consentirà una stretta regolazione della funzione del dominio bersaglio senza bloccare stericamente le sue interazioni o causare cambiamenti strutturali irreversibili che influenzeranno il suo ruolo biologico. Una struttura cristallina della proteina bersaglio è una guida ideale nell'identificazione di tali regioni flessibili dell'ansa per l'inserimento di LightR. Se necessario, la struttura cristallina di un omologo stretto può essere sufficiente. Di seguito vengono forniti alcuni criteri generali da considerare.
      1. Assicurarsi che l'anello di inserzione sia strutturalmente accoppiato agli elementi catalitici critici dell'enzima. Assicurarsi che l'anello di inserzione selezionato non sia un sito di legame esistente per la proteina e che l'inserimento di LightR non interrompa potenzialmente alcuna interazione funzionale a causa di effetti sterici.
      2. Come strategia iniziale, sostituire un amminoacido nell'ansa di inserzione quando si inserisce LightR. Colpire il centro dell'ansa di inserzione contenente un amminoacido polare o piccolo (ad es. Glu, Arg, Lys, Gly) esposto al solvente e non coinvolto in interazioni intramolecolari.
         NOTA: Quando la sostituzione di un amminoacido non si traduce in una proteina funzionale, l'ottimizzazione del costrutto LightR richiederà la sostituzione di più amminoacidi o dell'intero ciclo di inserzione. Valutare la funzionalità di più siti di inserimento per LightR all'interno del ciclo definito.
      3. Assicurarsi che l'enzima bersaglio funzioni indipendentemente dalla regolazione endogena. Per ottenere questo risultato, utilizzare una versione mutante costitutivamente attiva dell'enzima per il modello di inserimento.
         NOTA: Gli enzimi wild-type possono anche essere utilizzati per generare costrutti LightR, ma ciò può portare a un sistema AND-dipendente che sarà regolato da meccanismi endogeni e luce.
      4. I controlli positivi e negativi sono fondamentali per l'analisi dell'attività dell'enzima LightR. Utilizzare mutanti costitutivamente attivi di proteine endogene come controlli positivi e versioni mutanti cataliticamente inattive dell'enzima LightR mirato come controlli negativi.
         NOTA: Quando si selezionano le mutazioni inattivanti, è fondamentale assicurarsi che la mutazione sia sufficientemente distanziata dal sito di inserzione di LightR per evitare di interrompere l'irreversibilità del ripiegamento dell'enzima LightR. Sulla base dei criteri di cui sopra, il sito di inserzione di LightR nella chinasi Src viene selezionato in una regione ad anello flessibile che è strutturalmente accoppiata al motivo GXGXXG altamente conservato nella regione ad anello G che lega l'ATP/ad anello ricco di glicina tramite un filamento beta. È importante sottolineare che è posizionato lontano dalla tasca di legame dell'ATP e dalla regione di legame del substrato^10,17 (Figura 1C (i)).
         NOTA: A causa dell'omologia strutturale tra le chinasi, il sito di inserzione di LightR in bRaf viene selezionato nello stesso loop strutturale del sito di inserzione in Src (Figura 1C (ii)).
         NOTA: Sulla base dei principi enunciati nella Sezione 1.1.2., il sito di inserzione di LightR nella Cre ricombinasi, una non-chinasi, viene individuato in uno degli anelli flessibili distanti dal nucleo catalitico, cioè il sito di legame del DNA. Tuttavia, l'anello di inserzione è ancora strutturalmente accoppiato a residui catalitici critici all'interno del dominio di legame del DNA attraverso una α-elica per garantire il successo della funzionalità LightR-Cre (Figura 1C (iii)). Tutti i siti di inserzione con controlli positivi e negativi per i diversi enzimi descritti nell'attuale protocollo sono dettagliati nella Tabella 2 supplementare.
   3. Sviluppo di FastLightR.
      NOTA: L'introduzione della mutazione I85V in entrambi i VVD in LightR consente una dinamica di attivazione-inattivazione più rapida, attribuita alla rapida conversione del mutante nello stato oscuro^18,19. La generazione di FastLightR-Src e FastLightR-bRaf con cinetica di inattivazione rapida consente uno stretto controllo temporale dell'attivazione e dell'inattivazione. Consente di ottenere la regolazione subcellulare di LightR-Src nelle cellule viventi.
      NOTA: L'attività della ricombinasi Cre provoca una ricombinazione irreversibile del DNA; pertanto, le proprietà di reversibilità di LightR non sono applicabili.
      NOTA: Per semplificare il rilevamento del costrutto LightR, una proteina fluorescente o qualsiasi altro tag adatto può essere attaccato all'estremità N o C della proteina bersaglio. Questo studio ha utilizzato mCherry-myc per LightR-Src, Venus per LightR-bRaf e miRFP670 per LightR-Cre ricombinasi.
2. Strategia di clonazione
   NOTA: L'approccio di clonazione, a differenza degli approcci tradizionali, si basa sulla mutagenesi sito-diretta che non si basa su specifici siti di restrizione^10,20.
   1. Generazione di un "Megaprimer"
      1. Ottimizzazione dei codoni dei geni LightR per garantire un'espressione stabile delle due sequenze di DNA VVD tandem di origine fungina nelle cellule di mammifero e per rendere le sequenze il più diverse possibile per un clonaggio senza errori mediante PCR. Per eseguire l'ottimizzazione del codone, seguire i passaggi 1.2.1.2-1.2.1.3.
      2. Allinea la sequenza di amminoacidi dei VVD e i linker selezionati fianco a fianco per creare la mappa di sequenza teorica di LightR.
      3. Incolla la sequenza in qualsiasi piattaforma di ottimizzazione del codone online che utilizza un algoritmo avanzato per l'ottimizzazione del codone per determinare la migliore opzione di sequenza con una complessità minima. Assicurarsi che l'organismo target sia selezionato, che il frame di lettura sia mantenuto e che le sequenze VVD siano selezionate per l'ottimizzazione.
      4. Ottenere il DNA di LightR come frammento sintetizzato su misura (vedere la tabella supplementare 1) o da un costrutto LightR¹⁰ pubblicato in precedenza.
      5. Amplificare il gene LightR per generare "Megaprimer" utilizzando la strategia²⁰ precedentemente descritta nella Figura 1D. Sintetizzare il "Megaprimer" di LightR mediante PCR seguendo le raccomandazioni del produttore per la specifica DNA polimerasi e utilizzando la seguente miscela di reazioni PCR:
         5x tampone compatibile con DNA polimerasi: 10 μl
         Megaprimer diretto da 100 μM: 0,5 μl
         Megaprimer inverso da 100 μM: 0,5 μl
         Miscela dNTP da 10 nM: 2 μl
         DNA polimerasi (2000 unità/mL): 1 μl (0,02 U/μL)
         50 ng DNA modello: 1 μL
         Acqua di grado PCR: 35 μL
         NOTA: Qui viene utilizzata la DNA polimerasi ad alta fedeltà, con avviamento a caldo con temperature di ricottura del primer universali.
      6. Separare il megaprimer risultante mediante elettroforesi su gel di agarosio. Il prodotto avrà una lunghezza di circa 1000 nucleotidi. Estrarre il megaprimer dal gel di agarosio e purificare utilizzando un kit di estrazione del gel, seguendo le raccomandazioni del produttore o utilizzando una tecnica analoga.
   2. Inserimento del gene LightR mediante mutagenesi sito-specifica: inserire il LightR, sostituendo un amminoacido desiderato o una lunghezza di amminoacidi. Il plasmide stampo sarà quello in cui è inserito il dominio LightR. Eseguire la reazione PCR come descritto in precedenza²⁰ utilizzando la seguente miscela.
      5x tampone compatibile con DNA polimerasi: 5 μl
      Miscela dNTP da 10 nM: 1 μL
      DNA polimerasi (2000 unità/mL): 1 μL (0,02 U/μL)
      50 ng di DNA modello target: 1 μl
      Megaprimer estratto (massa calcolata): 10 μl
      DMSO: 2,5 μl
      Acqua per PCR: 2,5 μl
      NOTA: Massa del megaprimer (ng) = rapporto molare inserto/vettore desiderato x massa del vettore x rapporto tra inserto e lunghezze del vettore. Il rapporto molare inserto/vettore desiderato è 3/1.
   3. Dopo il completamento della reazione PCR, aggiungere 1 μL di enzima DpnI (2000 unità/mL) per digerire selettivamente solo il DNA in eccesso e metilato e incubare la miscela a 37 °C per 1-1,5 ore. Ciò aumenterà significativamente la resa del costrutto modificato.
   4. Trasformare 1-2 μL della reazione PCR in cellule competenti DH5α seguendo i protocolli del produttore.
   5. Piastra di batteri trasformati su piastra di brodo Luria (LB)-agar con antibiotico appropriato per la selezione. Incubare la piastra a 37 °C per una notte o a temperatura ambiente (RT; 25-30 °C) per 72 ore.
      NOTA: Le piastre LB con colonie coltivate su di esse possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 1 mese e il protocollo può essere messo in pausa.
   6. Screening PCR per colonie
      1. Per lo screening delle colonie basato sulla PCR, progettare primer che ricozzano l'inserto LightR e il DNA bersaglio per generare circa 400-700 frammenti di bp.
      2. Aggiungere una piccola quantità di una colonia dalla piastra LB alla miscela PCR fornita di seguito e procedere al termociclo seguendo le raccomandazioni del produttore per la DNA polimerasi specifica.
         2x Taq RED Master Mix: 5 μl
         Acqua di grado PCR: 5 μl
         100 μM Primer in avanti : 0,5 μl
         100 μM Innesco inverso: 0,5 μl
      3. Verificare la presenza di colonie positive mediante elettroforesi su gel di agarosio.
      4. Scegliere le colonie che hanno generato la dimensione desiderata del prodotto PCR e inocularle singolarmente in 3 ml di brodo LB con l'antibiotico, abbinando la resistenza agli antibiotici nella spina dorsale del plasmide. Quindi, incubare e agitare a 37 °C per una notte.
      5. Estrarre il DNA plasmidico dalla coltura liquida seguendo le istruzioni del produttore del kit di purificazione plasmidico per l'estrazione del DNA plasmidico e verificare la presenza dell'inserto mediante sequenziamento.
         NOTA: I primer di clonazione sono riassunti nella Tabella supplementare 3.

2. Placcatura cellulare e analisi biochimica dell'attività dell'enzima LightR (Figura 2A)

1. Per l'analisi biochimica delle LightR-chinasi (LightR Src, FastLightR Src, LightR bRaf), piastra 1 x 10 6 cellule LinXE per piastra di coltura cellulare da 3,5 cm per ciascun gruppo sperimentale. Vedere la Tabella supplementare 4.
2. Incubare le cellule a 37 °C e 5 % di CO₂ per 16-18 ore.
3. Il giorno seguente, trasfettare le cellule con il costrutto di DNA selezionato, utilizzando un reagente di trasfezione adatto seguendo le raccomandazioni del produttore (Tabella supplementare 4).
   NOTA: Il reagente di trasfezione ottimale dipenderà dal costrutto, dal vettore e dal tipo di cellule utilizzate. Questo studio ha utilizzato 2 μg di DNA in un piatto di 3,5 cm utilizzando un reagente di trasfezione. Dovrebbero essere eseguiti test empirici per determinare il reagente di trasfezione ottimale. Poiché i costrutti trasfettati esprimeranno proteine regolate dalla luce blu, tutti i passaggi successivi che gestiscono le cellule trasfettate devono essere eseguiti sotto luce rossa. Avvolgere le piastre con celle trasfettate con un foglio di alluminio prima di metterle nell'incubatrice per evitare accensioni accidentali.
4. Dopo 16-18 ore di trasfezione esporre le cellule alla luce blu¹⁰. A tale scopo, posizionare un sistema di lampade a pannello a diodi a emissione luminosa (LED) da 465 nm nell'incubatore per colture tissutali. Posizionare un pannello di plexiglass perforato a 10 cm sopra la lampada per ottenere l'illuminazione desiderata di 3 mW/cm² (File supplementare 1). È necessario un pannello perforato per mantenere la circolazione ininterrotta dell'aria nell'incubatrice. Illuminare le celle per il periodo desiderato.
5. Per l'attivazione di LightR-Src e LightR-bRaf, utilizzare l'illuminazione continua. Per un'illuminazione continua, accendere e spegnere manualmente il pannello LED.
6. Per mantenere il ciclo di attivazione/disattivazione di FastLightR Src, utilizzare cicli ON/OFF controllati manualmente o da un microcontrollore.
   NOTA: è possibile utilizzare diversi toolkit software che forniscono un ambiente di sviluppo integrato (IDE) per la scrittura e il caricamento del codice richiesto. Questi toolkit supportano la programmazione C/C++ e offrono l'accesso GPIO (General Purpose Input/Output), essenziale per il controllo dell'illuminazione pulsata. Una descrizione dettagliata dei protocolli e del codice utilizzati per questi scopi è descritta nel File supplementare 1.
7. Al termine dei rispettivi punti temporali dell'esperimento (Tabella supplementare 4), raccogliere le cellule sotto luci rosse di sicurezza. Aspirare il terreno e lavare le celle con PBS freddo.
8. Per isolare le proteine, lisare le cellule con 500 μL di tampone campione 2x Laemmli integrato con il 5% v/v di 2-Mercaptoetanolo. Incubare il lisato a 100 °C per 5 minuti. Analizzare i lisati cellulari mediante elettroforesi su gel proteico e Western blotting²¹.
   NOTA: La composizione di 2x tampone Laemmli è la seguente: Per 500 mL: 5,18 g di Tris-HCL, 131,5 mL di glicerolo, 52,5 mL di SDS al 20%, 0,5 g di blu di bromofenolo, pH finale 6,8.
9. Valutare l'attività di LightR-Src valutando il livello di fosforilazione di p130cas endogeno su Tyr249 e paxillina su TyrY118^22,23 (Figura 2). Valutare l'attività di LightR-bRaf valutando il livello di fosforilazione di MEK1 su Ser217/221 e ERK1/2 su TyrY202/204^24,25.

3. Analisi funzionale dell'attività di LightR-Cre

1. Per l'analisi funzionale dell'attività di LightR-Cre, piastra 1 x 10⁶ cellule LinXE per piastra di coltura cellulare da 3,5 cm. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO₂ per 16-18 ore.
2. Trasfettare le cellule seguendo il protocollo descritto nella sezione 2, Figura 2A e nella Tabella supplementare 5. Co-trasfettare un totale di 2 μg di DNA, con un rapporto 1:9 di LightR-Cre-iRFP670 e un plasmide reporter Floxed-STOP-mCherry².
3. Dopo 16-18 ore dalla trasfezione, illuminare le cellule. Un'attivazione efficiente di LightR-Cre necessita di un'illuminazione prolungata. Pertanto, per evitare la fototossicità, utilizzare l'illuminazione pulsata per 8 ore con cicli di 2 s ON e 20 s OFF utilizzando un pannello LED da 465 nm lamp sistema controllato da un microcontrollore come descritto nella sezione 2 e nel file supplementare 1.
4. Eseguire l'imaging utilizzando la microscopia a epifluorescenza con un obiettivo ad aria 20x. Per la visualizzazione di LightR-Cre-iRFP670, utilizzare il set di filtri Cy5 e per la visualizzazione di mCherry dall'espressione Floxed-mCherry, utilizzare il set di filtri RFP.
   NOTA: Per l'imaging viene utilizzato un microscopio a epifluorescenza dotato di cubi luminosi Cy5/RFP.

4. Preparazione di campioni per l'imaging di cellule vive

1. Piastra 2 x 10⁵ cellule HeLa per piastra di coltura tissutale da 35 mm in terreno di coltura cellulare e incubare per 2 ore a 37 °C e 5% di CO₂.
2. Una volta che le cellule si sono attaccate e la confluenza è di circa il 60%-70%, co-trasfettare le cellule HeLa con una delle seguenti miscele: (i) 0,85 μg di FastLightR-Src-mCherry-myc/0,15 μg di Stargazin-iRFP, o (ii) 0,75 μg di FastLightR-bRaf-Venus/0,25 μg di mCherry-ERK2
   NOTA: Negli esperimenti FastLightR-Src, lo Stargazin-iRFP viene utilizzato per marcare la membrana plasmatica per l'analisi della diffusione cellulare. Se si desidera un'espressione FastLightR-Src più elevata, stargazin-iRFP può essere omesso e al suo posto può essere utilizzato 1 μg di FastLightR-Src. In questi casi, è necessario utilizzare un colorante a membrana per visualizzare le cellule. Le colorazioni della membrana plasmatica sono abitualmente utilizzate per etichettare le membrane cellulari.
3. Coprire la capsula con un foglio di alluminio per evitare l'accensione accidentale delle celle e incubare per 16-18 ore a 37 °C e 5% di CO₂.
4. Completa tutti i seguenti passaggi sotto l'illuminazione a luce rossa per evitare l'attivazione involontaria dei costrutti. L'esposizione alla luce bianca indurrà l'attivazione delle LightR-chinasi e potrebbe influenzare i risultati successivi.
5. Lo stesso giorno, rivestire 3 vetrini coprioggetti rotondi (25 mm di diametro, 0,17 mm di spessore) per una notte con 5 mg/L di fibronectina in PBS a 37 °C.
6. Sciacquare i vetrini coprioggetti con PBS 16-18 ore dopo la trasfezione e lastra ~1 x 10⁵ cellule HeLa trasfettate su ciascun vetrino coprioggetti. Incubare in terreno di coltura cellulare per 2 ore a 37 °C e 5% di CO₂.
   NOTA: La bassa densità di semina è necessaria per garantire che le celle nel campo visivo non si tocchino l'una con l'altra.
7. Preparare i mezzi di imaging aggiungendo FBS ai mezzi di imaging L-15 di Levobitz fino a una concentrazione finale del 5%. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm e riscaldarla a 37 °C.
8. Preriscaldare l'olio minerale a 37 °C.
9. Lavare due volte i vetrini coprioggetti contenenti le cellule con PBS. Se si utilizza un colorante a membrana, colorare le cellule seguendo le istruzioni del produttore prima di lavare i vetrini.
10. Posizionare con cautela il vetrino coprioggetti in una camera di imaging di cellule vive. Aggiungere 1 mL di terreno di imaging L-15 alla camera.
11. Aggiungere 1 mL di olio minerale sopra il terreno per evitare l'evaporazione durante il processo di imaging.
12. Mantenere la camera protetta dalla luce a 37 °C fino a quando non è pronta per l'immagine.

5. Attivazione globale e imaging di FastLightR-Src (Figura 3)

1. Collegare una luce anulare per microscopia a LED blu al condensatore del microscopio, posizionandola a circa 1,5 cm sopra il supporto del campione. Collegare il relè di controllo AC/DC per la luce anulare al computer del microscopio.
   NOTA: Per gli esperimenti di questo studio, l'illuminazione è stata controllata attraverso un'interfaccia Transistor-Transistor Logic (TTL) tramite il software di imaging. L'illuminazione epifluorescente può anche essere utilizzata per attivare globalmente i costrutti LightR se non è disponibile una fonte di illuminazione esterna. Le lunghezze d'onda di eccitazione GFP, come il filtro di eccitazione 490/20 nm, sono efficaci nell'attivazione di LightR.
2. Posizionare la camera su un tavolino da microscopio preriscaldato a 37 °C e selezionare le cellule che esprimono FastLightR-Src-mCherry e Stargazin-iRFP (Figura 3B) o FastLightR-bRaf-Venus e mCherry ERK-2 (Figura 5B).
3. Per lo studio dell'illuminazione globale e degli esperimenti di imaging, utilizzare obiettivi ad alte prestazioni compatibili con il microscopio (40x) con correzione apocromatica, correzione del campo piatto e apertura numerica elevata.
   1. Per gli studi basati sull'illuminazione globale della chinasi Src, utilizzare filtri di eccitazione a 561/10 nm e filtri di emissione a 595/40 nm per visualizzare FastLightR-Src-mCherry e utilizzare l'eccitazione a 640/20 nm e il filtro di emissione 655LP per visualizzare stargazin-iRFP.
   2. Per gli studi basati sull'illuminazione globale della chinasi bRaf, utilizzare filtri di eccitazione a 514/10 nm e filtri di emissione a 540/21 nm per visualizzare FastLightR-bRaf-Venus e utilizzare filtri di eccitazione a 561/10 nm e filtri di emissione a 595/40 nm per visualizzare mCherry-ERK-2.
   3. Utilizzare uno specchio policroico multibanda in tutti i canali di imaging fluorescenti.
4. A seconda delle condizioni sperimentali, prendere in considerazione le seguenti raccomandazioni.
   1. Visualizzare le cellule per almeno 10 minuti prima dell'illuminazione per stabilire un'attività di base delle cellule.
      NOTA: Questa linea di base è necessaria per determinare se l'attivazione della chinasi FastLightR mediante illuminazione induce cambiamenti nel comportamento cellulare o nella localizzazione delle proteine. È inoltre possibile eseguire periodi più lunghi di imaging basale per fornire una maggiore significatività statistica.
   2. A causa della rapida cinetica di inattivazione dei FastLightR, l'inclusione di molte celle per l'imaging può causare la disattivazione di Src/bRaf tra le posizioni dello stadio e può attenuarne la risposta. Per evitare tale errore, eseguire l'imaging di 4 cellule/min durante l'analisi dell'attività della FastLightR-chinasi nel protocollo descritto e di ogni cellula selezionata ogni minuto per un totale di 110 minuti (File supplementare 2).
   3. Utilizzare l'illuminazione pulsata rispetto all'illuminazione continua per ridurre i potenziali effetti fototossici della luce blu. L'illuminazione per 12 s per ciascuna delle 4 celle/min è efficace (File supplementare 2, Figura 3A).
      NOTA: I cicli di illuminazione devono essere determinati empiricamente per diversi costrutti e tipi di sorgenti di illuminazione.
   4. Disattivare l'illuminazione durante l'imaging cellulare per evitare sbavature nei canali fluorescenti.
      NOTA: L'imaging di troppe cellule contemporaneamente ridurrà il tempo di illuminazione totale disponibile per il campione, portando a una risposta attenuata da un'attivazione insufficiente.
5. Dopo l'imaging, salvare i filmati come file . Formato di file stack TIF per l'analisi.
   NOTA: A causa dell'illuminazione meno uniforme con l'epifluorescenza GFP rispetto alla luce anulare, gli esperimenti che utilizzano l'epifluorescenza GFP richiederanno un'illuminazione più frequente. Ciò si traduce in un minor numero di cellule sottoposte a imaging per esperimento.

6. Attivazione subcellulare e imaging di FastLightR-Src (Figura 4)

1. Posizionare la camera su un tavolino da microscopio preriscaldato a 37 °C e selezionare una singola cellula che esprime sia FastLightR-Src-mCherry che Stargazin-iRFP.
2. Seleziona le regioni specifiche (ROI) all'interno della cella da illuminare. Questo studio sceglie una piccola area alla periferia della cellula selezionata.
   NOTA: Per l'illuminazione locale, viene utilizzato un laser a 445 nm focalizzato da un modulo TIRF in modalità FRAP o un dispositivo a micro-specchio controllato tramite interfaccia TTL tramite il software di imaging. Qualsiasi sistema di illuminazione a motivi funzionerà per questi esperimenti. Se si utilizza un sistema basato sulla scansione, determinare l'intensità e l'omogeneità del laser per un'attivazione sufficiente senza danneggiare la cella.
3. Visualizzare la cella selezionata ogni minuto per 20 minuti nello stato basale prima dell'illuminazione, 50 minuti durante l'illuminazione locale, quindi 20 minuti dopo l'attivazione per un totale di 90 minuti (File supplementare 2).
4. Per l'attivazione e la disattivazione, fornire un periodo di tempo adeguato alla proteina bersaglio per consentire la completa disattivazione della proteina LightR. Per FastLightR-Src, attendere almeno 10 minuti di disattivazione per l'ablazione dell'attività residua e consentire una disattivazione di 20 minuti nella configurazione sperimentale dimostrata per l'illuminazione locale.
5. Dopo l'imaging, salvate i filmati come . Formato di file stack TIF per l'analisi.

7. Analisi della diffusione cellulare

1. Preparare le immagini per l'elaborazione e l'analisi dei dati. Assicurarsi che le immagini siano in formato . Formato stack TIF. Salvali direttamente dal software di imaging o convertili utilizzando un programma open source.
2. Scaricare il pacchetto di script CellGeo dai file compressi dei dati supplementari²⁶.
   NOTA: Il pacchetto CellGeo contiene diversi script. Scegliere il pacchetto desiderato dall'elenco in base al tipo di analisi, come descritto nelle sezioni 7-9 del protocollo.
3. Apri ed esegui lo script intitolato MovThresh per creare una maschera della cella.
   1. Selezionare File > Importa (.tif) e selezionare le immagini Stargazin-iRFP delle celle.
   2. Scansiona i fotogrammi utilizzando la barra di scorrimento nell'angolo in basso a sinistra. Se la soglia suggerita è appropriata, andare al passaggio 7.4.
   3. Se la soglia suggerita non è in linea con il comportamento della cella, scegliete curve smussate o personalizzate sotto Selezione curva. Crea la curva personalizzata scorrendo i fotogrammi e quindi regolando la soglia sul lato destro della finestra.
   4. Fare clic su Ri-soglia.
   5. Fare clic su File > maschera Salva con nome, Cambia il nome del file e salvarlo utilizzando l'opzione Salva con nome .
4. Aprire il file stack appena creato in un programma di analisi delle immagini open source.
5. Selezionare Immagine > regolare > soglia > applicare.
6. Selezionare Analizza > Analizza particelle > Controlla visualizza risultati -> OK.
7. Calcola la variazione di area per ogni cella dividendo l'area in un dato momento per l'area media della stessa cella prima dell'irradiazione della luce blu.
8. Traccia la modifica dell'area come grafico a linee o a barre.
9. Calcola il valore medio e gli intervalli di confidenza al 90% per ogni punto temporale di tutte le cellule trattate nelle stesse condizioni.

8. Analisi della dinamica dei bordi delle celle

1. Preparare i file dello stack utilizzando i passaggi descritti nella sezione 7 del protocollo.
2. Aprire ed eseguire lo script denominato ProActive.
   1. Selezionate File > Importa > maschere (.tif) e selezionate la maschera creata tramite lo script MovThresh .
   2. Selezionare l'attività di interesse per l'analisi nell'angolo in basso a destra (Protrusiva, Retrattiva o Totale).
   3. Selezionare il tipo di normalizzazione. In genere, per queste analisi viene utilizzata la normalizzazione dell'area.
   4. Seleziona il fotogramma di riferimento iniziale utilizzando il cursore a sinistra. Il cursore del ritardo a destra determinerà il ritardo tra due punti temporali utilizzati per misurare l'area guadagnata e persa dalla cella.
   5. Se il numero di fotogrammi e ritardo selezionati è additivamente maggiore del numero di fotogrammi nel filmato, l'immagine di anteprima non verrà visualizzata. Reimpostare questi valori in modo che siano inferiori al numero totale di fotogrammi.
3. Modificate la soglia per la protrusione o la retrazione selezionando la casella Curva arrotondata (Smooth Curve ) nella sezione Risultati (Results ). In questo modo si calcola la media delle soglie in una finestra specifica, che può risolvere i problemi in cui vengono rilevate fluttuazioni minori come attività.
4. Selezionare Esegui intervallo per calcolare l'attività nel tempo specificato dai dispositivi di scorrimento dei fotogrammi e del ritardo.
5. Salvare i dati numerici selezionando File > Salva con nome > risultati (.mat) e utilizzarli per determinare l'attività protrusiva o retrattiva media.
6. Determinare gli intervalli di confidenza del 90% per ogni punto temporale.
   NOTA: In questo modo verrà salvato un array di diversi valori. Il file di testo "Come utilizzare ProActive" incluso nello script fornisce una descrizione dettagliata di ciò che ogni valore rappresenta e di come sono stati determinati²⁶.
7. Salvare la rappresentazione visiva dell'attività selezionando File > Salva come immagini > (.tif).

9. Analisi dello spostamento del baricentro

1. Per l'analisi dello spostamento del baricentro, utilizzare qualsiasi software in grado di determinare le coordinate del centroide.
2. Nel software di analisi, aprire la pila di immagini mascherate della cella di interesse come descritto nella sezione 7 del protocollo.
3. Selezionare Misura > Analisi morfometrica integrata, quindi fare clic su Preferenze > Disegna segno centroide > controllo, quindi selezionare Misura.
   1. Registra le coordinate del baricentro prima del movimento (A).
   2. Registra le coordinate del centroide alla fine dell'esperimento (B).
   3. Registrare le coordinate per il centro del modello di illuminazione (C).
4. Ora che i tre punti sono stati raccolti, determinare l'angolo BAC⁸. θ₁ corrisponde all'angolo ABC e θ₂ corrisponde all'angolo CBA (Figura 4Cii). Fallo usando la seguente equazione:
   cosθ = cos(θ₁ - θ₂) = cosθ₁cosθ₂ + sinθ₁sinθ₂
   NOTA: Una calcolatrice può essere utilizzata per determinare gli angoli e le distanze direttamente dalle coordinate per facilità d'uso.
5. Determinare lo spostamento del baricentro moltiplicando la distanza percorsa dal centroide della cella in pixel per il fattore di conversione dove 1 pixel è uguale a 0,4 μm. La conversione specifica dei pixel in distanza dipenderà dall'ingrandimento e dalla configurazione della fotocamera sul sistema.
6. Una volta determinato l'angolo di spostamento del baricentro e la distanza, aprire un software grafico in grado di produrre immagini di coordinate polari.
7. Inserire l'angolo di spostamento del baricentro come misura θ e la distanza percorsa come raggio. Utilizza ANOVA per verificare gli intervalli di confidenza del 95%.
8. Traccia i risultati e salva l'immagine.

Risultati

Il LightR-Src è progettato e generato seguendo la strategia descritta in Figura 1A, B. L'analisi biochimica di LightR-Src accede alla fosforilazione di substrati endogeni noti di Src, p130Cas (Y249)²² e paxillina (Y118)²³ in risposta alla luce blu a 60 minuti di illuminazione continua (Figura 2B). In particolare, non si osserva alcuna attivazione di fondo della ch...

Discussione

Il nostro studio presenta un approccio optogenetico per lo studio di diverse vie di segnalazione e dimostra la sua ampia applicabilità nell'affrontare diverse questioni biologiche. Il sistema di strumenti LightR offre diversi vantaggi essenziali: (1) Regolazione allosterica dell'attività proteica, (2) Stretto controllo temporale dell'attività che può essere regolato per ottenere diverse cinetiche di attivazione e inattivazione, (3) Risoluzione spaziale dell'attività a livello subcel...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g of  Tris-HCL, 131.5 mL of glycerol, 52.5 mL of 20% SDS, 0.5 g of bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
60 LED Microscope Ring Light	Boli Optics	ML46241324	Blue LED, 60 mm diameter, 5 W
Agarose	GoldBiotech	A-201
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-MEK	Cell Signaling	9122
Anti-p130Cas	BD Biosciences	610271
Anti-paxillin	Cell Signaling	2542
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-pY249 p130Cas	Cell Signaling	4014
Anti-phospho-Y118 Paxillin	Cell Signaling	2541
Anto-phospho-S217/221 MEK	Cell Signaling	9121
Arduino Compatable Power Supply	Corporate Computer	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎A000066
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
bRaf-V600E-Venus			Gift from Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA	GoldBiotech	A-420
Carbenicillin (Disodium)	Gold Biotechnology	C-103-25
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Dpn1 Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	Transfection reagent
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
GeneJET Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	Gel Extraction Kit
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Iot Relay	Digital Loggers	DLI 705020645490	AC/DC control relay for illumination
Kanamycin Monosulfate	Gold Biotechnology	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
LED Grow Light System	HQRP	884667106091218	LED panel lamp system
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	Software for running CellGEO Scripts
Metamorph	Molecular Devices		Imaging Analysis Software
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	89903BS	Chroma
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			Gift from Dr. Channing Der's Lab, UNC
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
Polygon 400 Patterned Illuminator	Mightex	DSI-G-00C
Primers	IDT
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
T0.25% Trypsin, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	For electrophoresis
UPlanSApo 40x Microscope Objective	Olympus	1-U2B828
USB TTL Box	National Instruments	6501	For TTL interface
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100