Procedure di addestramento comportamentale per la realtà virtuale con testa fissa nei topi

Riepilogo

L'articolo descrive le procedure sperimentali per il paradigma di realtà virtuale (VR) a binario lineare comunemente usato nei topi, oltre a determinare la fattibilità dell'esecuzione di attività VR complesse testando un compito di discriminazione del segnale a forma di Y.

Abstract

La realtà virtuale (VR) combinata con la fissazione della testa viene sempre più utilizzata negli studi di neuroscienze comportamentali in quanto consente di eseguire saggi comportamentali complessi in topi con testa fissata. Ciò consente registrazioni comportamentali precise incorporando varie tecniche neurofisiologiche che richiedono la fissazione della testa per ridurre al minimo il rumore del segnale correlato al movimento durante le registrazioni neurali. Tuttavia, nonostante il crescente utilizzo della realtà virtuale, ci sono pochi dati pubblicati sulla metodologia dettagliata su come implementarla. In questo studio, viene sviluppato un protocollo di allenamento in base al quale i topi C57B16/J maschi e femmine vengono addestrati a correre lungo un corridoio lineare virtuale, la cui lunghezza viene aumentata da 1 a 3 m in più sessioni di addestramento. Basandosi su queste basi, questo studio ha studiato la fattibilità dei topi che eseguono comportamenti complessi all'interno della realtà virtuale utilizzando un paradigma a labirinto a Y. Il compito richiedeva di navigare verso il braccio con pareti nere dal punto di scelta nel labirinto a Y. Dopo aver raggiunto un criterio di due giorni consecutivi uguale o superiore al 70% corretto, i topi sono passati a una discriminazione sensoriale sempre più difficile. I risultati forniscono importanti dettagli sulle metodologie utili per il successo dell'addestramento dei topi in VR e dimostrano che i topi mostrano capacità di apprendimento nella navigazione nel labirinto a Y. La metodologia presentata non solo offre approfondimenti sulla durata dell'addestramento nei saggi basati sulla realtà virtuale, ma sottolinea anche il potenziale per sondare comportamenti complessi nei topi, aprendo strade per indagini neuroscientifiche più complete.

Introduzione

Le attività di realtà virtuale sono emerse come un potente metodo di valutazione comportamentale nei topi a causa della fissazione della testa, che consente una stabilità meccanica che sarebbe compromessa nei topi che si comportano liberamente¹. Questo metodo consente di ridurre gli artefatti di movimento nelle registrazioni elettrofisiologiche ^2,3 e nell'imaging ottico ^4,5,6,7. Facilita inoltre comportamenti ripetibili⁸ e un eye-tracking preciso⁹. Nella configurazione sperimentale, il mouse è fissato in posizione e situato in cima a un tapis roulant sferico supportato ad aria. Questo apparato consente l'intricata esplorazione del comportamento guidato visivamente all'interno dell'ambiente VR. Mentre il mouse si muove sul tapis roulant, la sua locomozione si sincronizza perfettamente con la sua navigazione all'interno del paesaggio virtuale, che è visivamente rappresentato sullo schermo che circonda il mouse.

L'obiettivo di questo studio è duplice: affrontare le sfide chiave nell'ambito delle neuroscienze comportamentali sperimentali e contribuire all'avanzamento delle metodologie in questo campo. In primo luogo, nonostante l'aumento dell'uso della realtà virtuale nella ricerca accademica 10,11,12, rimane una notevole assenza di metodologie complete e protocolli di formazione, che ostacola l'adozione di questa tecnologia da parte di nuovi ricercatori. L'obiettivo principale era quello di colmare questa lacuna delineando un regime di allenamento dettagliato per il paradigma del binario lineare, come illustrato negli studi precedenti 13,14,15. Per descrivere queste procedure operative viene utilizzato un sistema disponibile in commercio. A titolo di esclusione di responsabilità, queste linee guida procedurali hanno componenti specifici per questo sistema; Tuttavia, per una discussione sulla generalizzabilità di questo protocollo, vedere la discussione. L'obiettivo era quello di delineare le procedure comportamentali, la tempistica tipica per l'esecuzione di queste procedure e il tasso di successo per l'addestramento dei topi a correre su un semplice binario lineare.

In secondo luogo, rimane una mancanza di documentazione sull'implementazione di compiti di labirinto complessi all'interno di questo paradigma nei topi. Saggi virtuali complessi sono stati sviluppati nei ratti¹¹. Tuttavia, i topi hanno un'acuità visiva ridotta rispetto a¹⁶ e spesso ottengono prestazioni peggiori in compiti complessi¹⁷. Mentre alcune ricerche si sono concentrate su compiti specifici come l'accumulo di prove o la novità spaziale¹⁸, l'obiettivo qui era chiarire le metodologie di addestramento necessarie ai topi per impegnarsi in paradigmi decisionali all'interno di ambienti VR. Per affrontare questa sfida, è stato ideato un compito di discriminazione del segnale in cui i topi hanno avuto il compito esclusivo di imparare ad associare il colore/luminanza (nero contro bianco) del braccio premiato con la ricompensa, ottenuta selezionando il braccio nero nel punto di scelta del labirinto a Y, con il braccio corretto randomizzato in ogni prova. Questo compito è stato progettato per richiedere l'interazione con i segnali virtuali e fornire informazioni sulle capacità di discriminazione percettiva dei topi.

In sintesi, questo studio affronta le lacune critiche nel campo delle neuroscienze comportamentali sperimentali, fornendo protocolli di formazione completi per l'utilizzo dei paradigmi VR nei topi e chiarendo le metodologie per compiti decisionali complessi all'interno di questo quadro. Sfruttando le intuizioni di ricerche precedenti e disegni sperimentali innovativi, questo studio mira a semplificare le pratiche di ricerca e far progredire la comprensione dei meccanismi neurali alla base del comportamento. Le sezioni seguenti approfondiranno le procedure sperimentali e i risultati e discuteranno i risultati.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state condotte nel rigoroso rispetto dei protocolli stabiliti dal Comitato per la cura e l'uso degli animali del NIEHS, garantendo il rispetto degli standard etici e delle linee guida sul benessere. Per lo studio sono stati utilizzati topi C57BL/6Tac, di circa 8 settimane.

1. Chirurgia per l'impianto della barra della testa

1. Preparazione all'intervento chirurgico
   1. Ottenere la quantità desiderata di topi per la propria coorte, alloggiandoli idealmente individualmente per ridurre al minimo l'interferenza con l'impianto della barra della testa, anche se questo è facoltativo¹⁹. Questo studio ha utilizzato un campione di tre topi maschi e tre femmine (inizialmente bilanciati, ma un maschio è stato escluso all'inizio dell'allenamento dopo aver fallito nel correre sulla palla)
   2. Acquisire i materiali specificati nella Tabella dei Materiali, regolandoli in base alle specifiche del disegno dello studio.
   3. Al momento dell'acquisizione dei topi, designare identificatori individuali e applicare tatuaggi sulla coda o punzoni per le orecchie per garantire un'identificazione inequivocabile. Stabilire un registro completo per registrare sistematicamente i loro pesi come richiesto per la procedura di restrizione dell'acqua.
2. Somministrazione di anestesia
   1. Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici siano prontamente disponibili, comprese le siringhe appropriate, un termofore, oggetti in metallo (come pinzette, micro forbici ed emostatici), soluzione di iodio, lubrificante oculare e bicchieri per soluzione salina e perossido di idrogeno. Per garantire condizioni sterili, sanificare tutte le apparecchiature chirurgiche e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici utilizzando un'autoclave.
   2. Prima di procedere con l'intervento chirurgico, eseguire misurazioni precise del peso dei topi e attivare il termoforo a 34 °C. Registrare tutte le informazioni necessarie nel quaderno di laboratorio/chirurgico del proprio istituto. Verificare l'adeguatezza dei livelli dei serbatoi di ossigeno e isoflurano e confermare la disponibilità di tutti i materiali essenziali per facilitare le procedure chirurgiche ininterrotte.
   3. Posiziona il topo e posizionalo in un cono attaccato a un vaporizzatore progettato per piccoli animali che riceve il 4% di isoflurano e una portata di ossigeno di 3 L/min per indurre l'anestesia. Utilizzare uno scavenger per catturare eventuali gas di scarico potenzialmente dannosi (consigliato).
   4. Somministrare l'unguento veterinario oftalmico al petrolio agli occhi del topo mentre è sotto l'ogiva per prevenire la secchezza oculare. Applicare inizialmente una singola goccia su ciascun occhio e riapplicare se necessario. Garantire una protezione costante degli occhi mantenendo sempre uno strato di questo lubrificante con controllo periodico.
   5. Preparare il sito chirurgico (Figura 1A) sulla testa del topo radendo l'area in cui il cranio verrà fissato alla barra della testa.
   6. Posizionare gli incisivi del topo all'interno dell'apparato stereotassico sotto l'ogiva, regolando la portata di ossigeno a 1 L/min e somministrando isoflurano all'1%-2% dal vaporizzatore. Garantire un flusso di anestesia adeguato regolando le valvole e passando di conseguenza dall'ogiva di induzione all'apparato stereotassico. Estendi la zampa posteriore del topo e applica una pressione decisa sulla punta. Se il piede non mostra una risposta di ritiro riflessiva, ciò indica che l'anestesia è efficace. Ripetere ogni 15 minuti, insieme a un controllo della respirazione.
   7. Fissare la testa del topo in posizione attaccando barre di stabilità chirurgica all'interno dei canali uditivi, riducendo al minimo qualsiasi potenziale movimento della testa durante l'intervento chirurgico.
   8. Prima di praticare incisioni o iniezioni, sterilizzare l'area chirurgica rasata sulla parte superiore della testa strofinandola con un tampone imbevuto di un antisettico allo iodio. Da questa fase in poi, utilizzare guanti sterili per mantenere le condizioni asettiche.
3. Somministrazione di iniezioni
   1. Iniettare per via sottocutanea 0,05 ml di bupivacaina (analgesia locale) con un ago da 25G nel sito dell'incisione chirurgica sul cuoio capelluto.
   2. Iniettare per via sottocutanea 1 mL di soluzione fisiologica (idratazione) con un ago da 25 G in un lato della regione interscapolare.
   3. Iniettare per via sottocutanea 0,05 ml di buprenorfina (analgesia di tutto il corpo) con un ago da 25G nel lato opposto della regione interscapolare.
4. Esposizione del teschio
   1. Utilizzare le micro forbici per creare un'incisione della pelle sopra le suture interfrontali e interne del cranio, partendo appena sopra la cresta sopraccigliare ed estendendosi fino a dietro la tacca occipitale (Figura 1A).
   2. Usa gli emostatici per tenere premuti i lembi sinistro e destro della pelle, esponendo il cranio.
   3. Utilizzare un batuffolo di cotone asciutto per rimuovere il tessuto connettivo dal cuoio capelluto tra le pieghe cutanee appuntate all'indietro.
   4. Utilizzare un batuffolo di cotone inumidito (ma non saturo) con acqua ossigenata per strofinare il cuoio capelluto, garantendo la visibilità delle suture e facendo attenzione a non far cadere il perossido di idrogeno sul tessuto circostante.
   5. Ripetere i passaggi 1.4.3 e 1.4.4, 2x-3x, fino a quando sia la bregma che la lambda sono distintamente visibili e il cuoio capelluto è accuratamente pulito.
5. Impianto chirurgico di viti
   1. Fissare due viti al cranio, posizionando una vite posteriormente alla bregma e l'altra anteriormente alla lambda (Figura 1B) per massimizzare la superficie dell'adesivo dentale e aumentare la stabilità della barra della testa. Posizionare la posizione delle viti in corrispondenza dei bersagli a una distanza specificata da Bregma. Assicurarsi che una vite sia posizionata a sinistra e l'altra a destra (ad esempio, antero-posteriore (AP) +1.00, mediale-laterale (ML) -1.00 e AP -3.00, ML +3.00), assicurandosi che ci sia uno spazio adeguato tra le viti per adattarsi al posizionamento della barra di testa e regolare le coordinate e le esigenze.
   2. Perforare le posizioni dei bersagli, assicurandosi che la perforazione sia limitata all'osso del cranio e non penetri nel tessuto cerebrale.
   3. Usando un cacciavite, avvitare circa metà della vite in posizione. Ripetere per la seconda vite.
6. Fissaggio dell'impianto della barra di testa
   1. Miscelare il cemento dentale e somministrarlo sul lato inferiore della testa, concentrandosi sulla superficie concava, e applicare lungo la sutura interfrontale del cranio.
   2. Posizionare la barra della testa sopra la sutura interfrontale per facilitare l'incollaggio tra il cemento dentale sulla barra della testa e quello sulla sutura. Tenerlo saldamente in posizione con la mano all'angolazione desiderata per circa 5 minuti fino a quando non si solidifica. Applicare altro cemento dentale secondo necessità. (Figura 1C-E)
7. Riattaccare la pelle sopra la barra della testa
   1. Rilascia gli emostatici e utilizza le pinzette per riunire i due lembi di pelle sopra la barra della testa fissata con cemento dentale essiccato. Utilizzare un adesivo tissutale topico per fissare delicatamente la pelle facendo aderire lentamente le parti sinistra e destra del cuoio capelluto sopra la barra della testa, partendo dal sito di incisione anteriore e terminando nel sito di incisione posteriore.
   2. Lasciare indurire l'adesivo tissutale topico per confermare che l'area chirurgica sia stata risigillata prima di rilasciare il mouse dalle barre di stabilità chirurgica e dall'ogiva.
   3. Trasferire il mouse in una gabbia alloggiata singolarmente e posizionarlo su un termoforo a 37,5 °C.
   4. Monitorare attentamente il topo per eventuali segni di disagio o irregolarità respiratorie fino a quando non ha ripreso conoscenza. Non lasciare il topo incustodito fino a quando non ha riacquistato la decubito sternale, mostra vigilanza ed è deambulante.
   5. Dopo le procedure chirurgiche, consentire ai topi di sottoporsi a un periodo di riposo di 1 settimana. Monitora i topi ogni giorno per rilevare e affrontare eventuali fluttuazioni di peso notevoli. Fornire poltiglia per i topi 3 giorni dopo l'intervento chirurgico per favorire il recupero. Per evitare interferenze con la barra della testa, alloggiare questi mouse singolarmente.

2. Restrizione dei liquidi

NOTA: La restrizione idrica induce uno stato di sete nei topi, aumentando la loro motivazione per le ricompense liquide. Tuttavia, è necessaria un'attuazione meticolosa per garantire la conservazione del benessere del topo²⁰.

1. A 1 settimana dal giorno dell'intervento, stabilire i pesi di base per i topi.
2. Fissare con nastro adesivo un segmento di una piccola piastra di Petri (60 mm x 15 mm) con il lato concavo rivolto verso il basso sul pavimento della gabbia, fissando con nastro adesivo una piastra di Petri più piccola (35 mm x 10 mm) concava fino al centro della superficie piana della piastra di Petri fissata con nastro adesivo al pavimento, con un'altra piccola piastra di Petri (60 mm x 15 mm) concava con nastro adesivo sopra la superficie piana della piastra centrale per fungere da serbatoio d'acqua (Figura 2).
3. Assicurarsi che l'altezza del piatto superiore impedisca la contaminazione dal materiale della lettiera, consentendo al contempo ai topi un facile accesso all'acqua. Aggiungere il volume d'acqua giornaliero al serbatoio utilizzando una pipetta.
4. Il giorno 1, somministrare ai topi una dose di 15 ml di acqua per 100 g di massa corporea.
5. Il giorno 2, somministrare ai topi una dose di 10 ml di acqua per 100 g di massa corporea.
6. Il giorno 3, somministrare ai topi una dose di 5 ml di acqua per 100 g di massa corporea. I topi dovrebbero ricevere un'assunzione minima di 1 ml di acqua al giorno per tutta la durata dello studio, indipendentemente dal peso corporeo.
   NOTA: I ricercatori possono scegliere di somministrare il volume minimo in modo uniforme in tutti i soggetti, anche se tali aggiustamenti dovrebbero essere effettuati con un'attenta considerazione.
7. Mantenere un dosaggio costante per tutta la durata dello studio di assegnazione dell'acqua a 5 ml per 100 g di peso corporeo (o un'assegnazione uniforme di acqua da 1 ml, se si preferisce)
   NOTA: Ai topi dovrebbe essere fornito l'accesso ad libitum all'acqua per 1-2 giorni alla settimana quando i topi non eseguono un esperimento VR (cioè durante il fine settimana). Ciò faciliterà il ripristino dei loro naturali livelli di idratazione. Nei casi in cui i topi scendono al di sotto del 90% del loro peso basale registrato, dovrebbero essere trasferiti all'accesso all'acqua ad libitum fino a raggiungere il 90% del loro peso basale. I topi che scendono al di sotto dell'80% del loro peso basale registrato dovrebbero essere soppressi eticamente.
8. Ritardare la somministrazione della dose giornaliera di acqua di almeno 30 minuti dopo la valutazione comportamentale per mitigare la potenziale interferenza con i loro comportamenti naturali di sete, essenziali per condurre l'esperimento in modo accurato.
   NOTA: Fornire ricompense liquide subito dopo una prova può influenzare inavvertitamente le prestazioni dei topi, in quanto potrebbero anticipare di ricevere una ricompensa immediata, compromettendo potenzialmente l'impegno nel compito. Pertanto, ritardare l'accesso all'acqua dopo la sperimentazione impedisce l'assuefazione alla consegna immediata della ricompensa e preserva l'integrità della configurazione sperimentale.

3. Configurazione del sistema

1. Familiarizzazione con le apparecchiature: per i componenti hardware e altre considerazioni sui sistemi comportamentali VR, vedere i passaggi seguenti.
   Vedere la sezione di discussione per un esame della generalizzabilità del protocollo a configurazioni di sistema comparabili.
   1. Display virtuale o cupola completamente immersiva: questo display virtuale offre un'immersione completa per un animale all'interno di un ambiente virtuale personalizzabile. Il movimento all'interno dell'ambiente virtuale è sincronizzato con il movimento sul tapis roulant sferico.
   2. Sistema di ricompensa liquido: il sistema di ricompensa liquido funziona attraverso l'erogazione di rinforzo liquido (acqua o acqua zuccherata) utilizzando una pompa peristaltica, che dirige la soluzione di ricompensa attraverso un tubo metallico rivestito di plastica che si estende al mouse quando un'attività viene eseguita con successo. Contiene sensori che monitorano la quantità di ricompense ottenute da un mouse durante una prova.
      1. Pulisci il tubo della ricompensa settimanalmente usando alcol etilico o un detergente alternativo. Per fare ciò, sciacquare 2-5 ml di detergente attraverso il tubo, in modo simile all'erogazione della ricompensa liquida, seguito da un risciacquo comparabile con un volume d'acqua uguale.
      2. All'inizio dell'esperimento, determinare la velocità di erogazione della ricompensa liquida dal tubo di ricompensa attivandolo per una durata specificata e misurando il volume del liquido erogato. Questa procedura consente di determinare la portata del liquido della pompa peristaltica. In questa indagine, è stata utilizzata una velocità di dispensazione di circa 0,0083 mL/s.
         NOTA: La maggior parte dei sistemi offre impostazioni programmabili per la durata tra l'esecuzione del comportamento e il rilascio della ricompensa, consentendo una pianificazione precisa del protocollo di studio in base al volume di ricompensa previsto per prova. La quantità utilizzata è stata ritenuta sufficiente in quanto ha permesso al topo di consumare la ricompensa e il suo volume sembrava essere motivante.
      3. Alcuni protocolli possono richiedere al mouse di leccare il beccuccio della ricompensa per avviare l'erogazione della ricompensa. Per il tipo di compiti impiegati qui, questa funzionalità non è stata impiegata, fornire ricompense condizionate esclusivamente all'esecuzione riuscita del comportamento desiderato (ad esempio, la scelta del braccio corretto nel labirinto a y). Questo aiuta a evitare fallimenti all'inizio dell'allenamento in cui la tendenza a leccare non è stata sufficientemente stabilita ed è meno probabile che si verifichi la leccata iniziale. Può anche consentire la misurazione dell'aspettativa di ricompensa, che è dissociabile dalle prestazioni di navigazione in alcune condizioni¹¹.
      4. Mentre alcuni esperimenti che utilizzano la restrizione dei liquidi optano per l'uso di acqua standard attraverso il tubo di ricompensa, qui usano l'acqua zuccherata (10% di saccarosio v/v) come stimolo motivazionale aggiuntivo all'interno del paradigma operante. In particolare, è stato osservato un miglioramento delle prestazioni in più coorti sperimentali con l'introduzione di acqua zuccherata.
   3. Palla di polistirolo: questa palla funge da tapis roulant sferico. Quando sono ammortizzati con l'aria dal basso, addestra i topi a correre o camminare comodamente sulla palla. Posizionalo sopra un portapalline dotato di sensori di rilevamento del movimento che raccolgono dati su distanza e velocità.
   4. Supporto per la testa: posizionare l'apparecchio posteriormente al mouse, assicurando l'allineamento visivo con il display VR al momento del fissaggio della barra per la testa al supporto. Questo apparato è fondamentale per mantenere il mouse in una posizione fissa con la testa, mitigando così gli artefatti di movimento, in particolare quando il sistema viene utilizzato insieme all'imaging ottico o alle tecniche elettrofisiologiche.
   5. Hardware per il flusso d'aria: configura il flusso d'aria da una fonte di aria compressa alla palla per la creazione di un ambiente senza peso favorevole ai topi che corrono sulla palla. Questa configurazione richiede un regolatore di flusso per garantire un controllo preciso della pressione dell'aria applicata alla palla. La sfera funziona in modo efficiente all'interno dell'ambiente senza peso con un'alimentazione d'aria minima. Pertanto, durante la configurazione del sistema, accertare la quantità minima di aria necessaria per facilitare il movimento fluido e senza ostacoli della sfera all'interno del supporto. Si consiglia un flusso compreso tra 10 e 20 L/min.
2. Configurazione del software: Per dettagli specifici sul funzionamento del sistema, vedere di seguito.
   NOTA: Proprio come il design dei videogiochi²¹, l'architettura dei mondi virtuali integra elementi chiave come un controller esterno, un ambiente navigabile programmabile e un file di pianificazione contenente un diagramma di stato che delinea le funzioni dinamiche. Questi componenti convergono sinergicamente per creare un'esperienza interattiva coesa per i soggetti impegnati negli studi di ricerca. L'efficacia operativa del software dipende da una precisa organizzazione dei file all'interno di cartelle designate. Questa spiegazione illustrerà i passaggi principali necessari per popolare i modelli predefiniti, consentendo facili regolazioni ai file esistenti e salvandoli come nuove versioni. Queste nuove versioni costituiranno poi la base dello studio.
   1. Utilizzare i tre file seguenti insieme per configurare un panorama virtuale operativo.
      1. File XML: questo formato di file offre agli utenti la possibilità di manipolare la texture fotografica di vari elementi come il cielo, il pavimento e le pareti. Posiziona i file utilizzati per le immagini nella sottocartella Dati della cartella VR. Usando questi, specifica le dimensioni del labirinto e determina la posizione iniziale del mouse all'interno del labirinto. Definisci gli oggetti 3D (segnali visivi) in determinati nodi all'interno del labirinto utilizzando questi file. Modifica questi file utilizzando un editor di testo.
      2. File XLSX: funzionano come file di comando che configurano tutti e tre i tipi di file (XML, XLSX e XAML) insieme per formare una presentazione virtuale coesa e interattiva. Utilizza questi file per definire le routine sperimentali che eseguono la realtà virtuale e i relativi accessori, ad esempio la sensibilità al guadagno, i dati estratti e i file raggruppati per un esperimento.
      3. File XAML: L'applicazione software fornisce un'interfaccia grafica per la creazione di schedulazioni sperimentali attraverso l'utilizzo di diagrammi di flusso. Facilita la definizione dei parametri temporali per la prova, i controlli per il teletrasporto dopo che la prova è stata completata e i tempi di attivazione per le uscite digitali all'interno del quadro di prova.
   2. Utilizzare le seguenti applicazioni per l'acquisizione dei dati e il controllo da parte dell'utente del sistema mentre è in funzione.
      1. [applicazione] VR: Associato al file .XML che mostra il paesaggio rappresentativo, aprire il file per visualizzare in anteprima il paesaggio virtuale sui monitor in modalità statica. Per l'interazione dinamica, aprire la configurazione associata. XLSX nell'applicazione di controllo.
      2. Controllo [applicazione]: Associato al file .XSLX, aprire questa applicazione per vedere i dispositivi accessori associati al sistema. Da qui è possibile estendere e ritrarre manualmente il tubo di ricompensa, erogare la ricompensa liquida e visualizzare l'acquisizione dei dati in tempo reale.
      3. Progettazione pianificazione [applicazione]: questa applicazione offre la possibilità di modificare i file XAML per stabilire una pianificazione per l'attivazione degli eventi all'interno dell'esperimento. Ad esempio, è possibile progettare un trigger personalizzabile per determinare la durata dell'erogazione delle ricompense e definire la durata delle pause tra le prove per i topi.
3. Esempio di avvio: inizia decidendo come apparirà il protocollo di studio in base ai componenti regolabili dai passaggi 3.2.1.1-3.2.1.3. Dopo aver definito chiaramente un protocollo operativo, aprire uno degli esperimenti modello preimpostati con il sistema VR seguendo i passaggi seguenti.
   1. Aprire l'applicazione VR, che si apre nella sottocartella Dati. Salvare il paesaggio virtuale creato come file XML. Apri questo file e il paesaggio virtuale dovrebbe apparire sui monitor VR.
   2. Apri l'applicazione Controllo e vai all'icona Apri cartella in alto a destra dello schermo. Fare clic sull'icona, che dovrebbe far apparire la cartella Configs, in cui il file . La configurazione sperimentale XLSX si trova. Apri il file . XLSX con lo stesso nome del file .XML aperto nell'applicazione VR. Gli accessori di sistema definiti, come la pompa e il motore per il dispositivo di ricompensa estensibile, sono ora visibili sotto la scheda di controllo all'interno dell'applicazione.
   3. Avviare la prova sperimentale, poiché il coordinamento tra queste due applicazioni consente la creazione di un paesaggio virtuale interattivo. In definitiva, questa integrazione facilita il monitoraggio dei dati essenziali, tra cui la distanza nell'aereo XY e la raccolta di ricompense con timestamp.
4. Acquisizione dei dati: estrai i dati comportamentali più preziosi dal sistema, che sono dati posizionali con timestamp e ricompense. Questi dati vengono salvati separatamente come file di registro.
   1. Dati di posizione: per acquisirli, seguire i passaggi descritti di seguito.
      1. Per acquisire i dati posizionali XY con timestamp dei topi, aprire prima il file del foglio di calcolo del labirinto di acquisizione dati desiderato. Nella tabella 1, inserire il comando WriteVRAndCamInfoToFile in una delle celle sotto le altre nella colonna A. Ora, i dati posizionali verranno salvati automaticamente come file CSV datato (denominato Log files-MM.DD.YYYY_VRandPathPos.csv) nella cartella configs dopo un periodo di prova.
      2. Per esportare i dati della posizione dopo una prova, chiudere l'applicazione di controllo e i dati verranno salvati in un file CSV datato. Questo file conterrà tutti i dati specifici per un determinato giorno, quindi fai attenzione a annotare manualmente quando ogni soggetto è stato posizionato e tolto dalla palla. Apri il file e importalo utilizzando il set di caratteri Unicode UTF-8. La colonna A è etichettata DateTime, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla scheda A e fare clic su Formato celle. Vai all'ora e fai clic sull'opzione MM/GG/AAAA HH:MM: SS . Ora, ogni evento del sistema verrà catalogato cronologicamente per ulteriori analisi dei dati.
   2. Dati di ricompensa: per acquisirli, segui i passaggi descritti di seguito.
      1. I dati sull'attivazione della pompa (erogazione della ricompensa) vengono salvati automaticamente come file di log datati nel sistema, quindi non è necessario inserire un comando come si farebbe per i dati di posizione. Per accedervi, vai alla sottocartella File di registro della cartella configs.
      2. Ripeti il passaggio 3.4.1 per i dati di posizione per i dati della ricompensa per esportare i dati come file di foglio di calcolo. Apri la cartella configs e seleziona il file di ricompensa datato (denominato Corridor- MM.DD.YYYY o Corridor_Linear_Run- MM.DD.YYYY) quando visualizzato nella cartella. Questo fornirà la data e l'ora in cui i topi hanno acquisito le ricompense, e si può utilizzare questo in ulteriori analisi dei dati a seconda del paradigma che hanno impiegato.

4. Compiti comportamentali

NOTA: In conformità con le metodologie consolidate nelle neuroscienze comportamentali, i compiti formulati impiegano una tecnica di apprendimento associativo basata sulla ricompensa. Impiegando ricompense immediate per rafforzare comportamenti specifici, gli animali vengono addestrati in modo efficace per eseguire compiti ripetitivi, facilitati dalla capacità di teletrasporto della realtà virtuale. All'interno di un quadro comportamentale virtuale, la funzionalità di teletrasporto offre ai topi la capacità di impegnarsi in attività senza lo stress associato alla manipolazione fisica, riducendo contemporaneamente la durata della configurazione necessaria per attività analoghe nel mondo reale. Durante le sessioni di formazione, utilizzare un'illuminazione dall'alto rossa fioca all'interno dell'ambiente sperimentale. Questa precauzione è raccomandata a causa della ridotta sensibilità percettiva visiva nei topi alla luce rossa, che mitiga la potenziale interferenza con la loro percezione degli schermi di realtà virtuale (VR), al contrario dell'uso della luce bianca²².

1. Assuefazione
   1. Iniziare l'abitudine al tapis roulant sferico contemporaneamente alla loro abitudine alla regolazione dei fluidi per associare il tubo da leccare alla ricompensa utilizzando la motivazione fisiologica correttamente sincronizzata. Si consiglia un periodo di assuefazione di tre giorni prima di iniziare l'allenamento su pista lineare.
   2. Il 1^{° giorno,} maneggiare i topi per 5 minuti dopo la pesatura. Durante questa interazione, si consiglia di afferrare delicatamente l'impianto della barra per la testa mentre i topi sono nella loro gabbia, creando familiarità con tale manipolazione. Introducili all'area in cui è ospitata la realtà virtuale in questo giorno per consentire loro di anticipare l'ambiente spaziale in cui si svolgeranno le prove sperimentali. Questo giorno iniziale di assuefazione coincide con l'inizio della regolazione dei liquidi di 15 ml per 100 mg di massa corporea.
   3. Il 2^{° giorno,} che si allinea con la transizione alla fase di regolazione dei liquidi di 10 ml per 100 mg di massa corporea, maneggiare nuovamente i topi per 5 minuti. Continuare a afferrare delicatamente la barra della testa mentre si è nella gabbia. Fissare la barra della testa al supporto consentendo ai mouse di familiarizzare con il tapis roulant sferico per 5-20 minuti, su una pista che si ripete all'infinito o senza il programma software attivato. Ciò facilita il loro adattamento alla condizione di testa fissa. Va previsto che i topi possono espellere rifiuti durante questo periodo, che in genere diminuiscono nelle sessioni successive.
   4. Il 3^{° giorno,} che corrisponde all'ultimo giorno del paradigma di regolazione dei liquidi (5 ml per 100 mg di massa corporea), maneggiare i topi per 5 minuti. Quindi, fissali saldamente al tapis roulant sferico con cuscinetto d'aria e introducili alle ricompense liquide attraverso il tubo della ricompensa.
      1. Introdurre il beccuccio leccare ai topi ingenui li confonderà all'inizio, quindi assicurati che il topo sia consapevole che dovrebbero bere dal tubo.
   5. Senza essere troppo energico, applica le linee guida per il posizionamento del mouse di seguito e personalizza il posizionamento del mouse sulla palla rispetto al tubo in modo da consegnare loro la ricompensa in modo confortevole. All'inizio, assicurati che i topi stiano bevendo dal tubo; Ciò si verificherà nella maggior parte dei topi naturalmente in condizioni di restrizione idrica quando viene presentato un liquido da bere.
2. Posizionamento dei mouse
   1. Pre-posizionamento: prima di posizionare il mouse sulla palla, estendere il tubo di ricompensa centrato con una piccola goccia di ricompensa sulla punta. Estendi il tubo della ricompensa prima di posizionare il mouse sulla palla per evitare potenziali lesioni derivanti dall'estensione involontaria del tubo troppo in avanti una volta che il mouse è fissato alla testa. Sollevare il tubo di ricompensa di 5-15 mm sopra il tapis roulant sferico in modo tale che leccare il beccuccio richieda una postura naturale della testa rivolta in avanti.
   2. Fissaggio della testa: per fissare la testa del mouse, posizionare il mouse sul lato dominante del tapis roulant sferico del conduttore. Quindi, usando la mano dominante del conduttore, tirare il mouse per la sua barra verso la piattaforma di fissaggio della testa. Posizionare la barra della testa nella fessura destinata al fissaggio, dopodiché utilizzando la mano non dominante del conduttore, fare clic sulla barra della testa in posizione.
   3. Posizione sulla palla: personalizza il posizionamento sul tapis roulant sferico per ogni topo, ma assicurati che soddisfino i seguenti requisiti per garantire la motivazione per assaggiare la ricompensa e ridurre al minimo i livelli complessivi di stress.
      1. Allineare il piano sagittale medio del mouse con il centro del tapis roulant sferico. Nei casi in cui la barra della testa non è diritta, assicurarsi che il piano sagittale medio del mouse, piuttosto che la barra della testa, sia in linea con il centro del posizionamento. Per una maggiore chiarezza, vedere la Figura 3C.
      2. Assicurarsi che le zampe posteriori del mouse non siano a più di 11 cm dall'apice del tapis roulant sferico e che la testa sia dietro l'apice. Assicurarsi che tutte e quattro le zampe tocchino il tapis roulant e che l'addome possa toccare il tapis roulant quando il mouse è a riposo; Ciò supporterà un'andatura corretta e la stabilità sulla palla per la corsa.
      3. Quando i topi non corrono, questo si chiama rifiuto della palla. Se i topi continuano a bloccarsi e non tentano di correre, è probabile che stiano sperimentando un'ansia eccessiva e che l'investigatore scelga di escluderli dall'esperimento. In questo studio, è stata utilizzata una soglia quantitativa di 5 giorni di rifiuto della palla per determinare l'esclusione dai dati.
   4. Bias laterale: quando i topi iniziano ad abituarsi alla routine di allenamento, favoriranno un lato rispetto all'altro. Questo può interferire con l'esecuzione del compito, quindi fai attenzione a garantire che qualsiasi preferenza laterale non sia dovuta all'asimmetria nel modo in cui l'animale è montato sulla palla. Il compito del labirinto a Y impiegato qui richiede specificamente che l'animale faccia scelte sia a destra che a sinistra per ottimizzare la consegna della ricompensa, il che facilita il superamento delle preferenze laterali.
   5. Beccuccio della ricompensa: Questo approccio prevede una manovra delicata denominata metodo del bacio, in cui il topo viene guidato verso il tubo da leccare esteso fino a quando la sua bocca non tocca quasi la punta del beccuccio, garantendo così un'erogazione accurata della ricompensa. Imposta la durata del tubo di ricompensa esteso a 1 s quando i topi ricevono le ricompense, consentendo al topo un tempo adeguato per consumare completamente la gocciolina. Personalizzare il posizionamento del beccuccio per ciascun mouse, poiché le dimensioni e il posizionamento preferito per ogni singolo mouse possono differire. Assicurarsi che il tubo di ricompensa rimanga centrato durante tutte le prove per la standardizzazione del licking; Il topo dovrebbe sempre aspettarsi di ricevere la ricompensa nella stessa posizione fisica, indipendentemente dal design del labirinto virtuale.
      NOTA: Sebbene la determinazione di questa durata sia a discrezione dello sperimentatore, questi risultati indicano che questo lasso di tempo è stato efficace nel facilitare l'assunzione completa della ricompensa da parte del topo prima della retrazione del tubo. La Figura 3B mostra un esempio di posizionamento preferibile per il posizionamento.
   6. Percorso lineare: coerentemente con studi precedenti che impiegano metodologie simili, utilizzare un compito di percorso lineare per indagare due indagini chiave: il tempo necessario per addestrare i topi ad attraversare un corridoio rettilineo e il tasso di successo previsto dell'acquisizione della ricompensa da parte dei topi.
      1. Assicurarsi che i topi si siano acclimatati sia al paradigma di restrizione dei fluidi che all'hardware sperimentale.
      2. Esegui una sessione giornaliera di 30 minuti per muoverti lungo un corridoio virtuale lineare a partire da una lunghezza di 1 m. Dopo aver raggiunto la fine del corridoio e aver ricevuto la ricompensa della goccia di zucchero, teletrasporta i topi al punto di partenza.
      3. Determinare un avanzamento basato su criteri verso labirinti più lunghi (ad esempio, 1 m, 2 m, 3 m). Fai avanzare i topi alla lunghezza del labirinto successiva dopo aver ricevuto una media di 2 ricompense al minuto per 2 giorni consecutivi (Figura 4A).
      4. Documentare le registrazioni giornaliere dei dati con data e ora riguardanti il recupero delle ricompense e la distanza percorsa dai topi sul tapis roulant sferico per ulteriori analisi (Figura 4B-D).
      5. Per i topi che ricevono una media di 2 ricompense al minuto sui binari lineari di 3 m, contrassegnarli come esperti nel paradigma del binario lineare. Si raccomanda che i topi raggiungano questa fase prima di passare a compiti comportamentali più complessi che richiedono un processo decisionale.
   7. Compiti comportamentali complessi che richiedono un processo decisionale (Y-Maze): questa fase esplora la fattibilità del passaggio da un compito comportamentale semplice a uno più complesso che richiede un processo decisionale. Per fare ciò, crea un'attività Y-Maze di discriminazione del segnale ideata.
      1. In questo paradigma del labirinto a Y^23,24, assicurati che i topi navighino verso un punto di scelta in cui due braccia si estendono di 45° in entrambe le direzioni come la forma di una Y. Disattiva la rotazione dal punto iniziale del labirinto fino a raggiungere il punto di scelta, due braccia di colore variabile, quindi attivala all'interno della zona decisionale per consentire al mouse di ruotare verso la direzione desiderata.
      2. All'ingresso nel braccio che porta alla zona di ricompensa, disattiva nuovamente la rotazione. Un braccio nero rappresenta il percorso corretto, mentre un braccio bianco rappresenta il percorso errato. Usa il braccio nero e il braccio bianco come segnali per adattarsi a potenziali limitazioni nell'acuità visiva del mouse in quanto sono facilmente distinguibili, facilitando un esame del loro utilizzo delle informazioni visive nella loro forma più semplice.
      3. Addestra i topi a navigare verso il braccio nero per ottenere una ricompensa di zucchero, con ogni prova che si conclude con il teletrasporto dei topi alla posizione di partenza. Incorporare nel disegno sperimentale un rimescolamento casuale della posizione della ricompensa tra i lati sinistro e destro, assicurandosi che i topi associno la ricompensa ai segnali visivi piuttosto che al lato specifico.
      4. Utilizzare gli stessi passaggi per impostare il labirinto a Y come corridoio lineare. Rispecchia i criteri per la progressione nel paradigma del labirinto a Y con quelli del corridoio lineare: ogni prova dura 30 minuti e i topi devono raggiungere una soglia di ricompensa predeterminata per 2 giorni consecutivi. Si raccomanda una soglia del 70% di ricompense acquisite correttamente in base alle prestazioni medie delle precedenti coorti di piloti nel labirinto a Y; è superiore alla soglia di probabilità (50%) e rappresenta una percentuale ragionevolmente raggiungibile indicativa del fatto che i topi comprendano il compito (Figura 5A).
      5. Una volta raggiunto il punto di scelta, assicurarsi che il mouse selezioni uno dei bracci corretti o errati. Alla fine del braccio, teletrasportalo al punto di partenza per ripetere il labirinto entro un tempo di 30 minuti.
      6. Questo approccio ha impiegato un approccio ispirato alla psicofisica visiva in cui i labirinti sono diventati progressivamente più difficili da distinguere. Segui la descrizione qui sotto per la progressione nel paradigma del labirinto a Y.
         1. Nel labirinto a Y iniziale, presenta braccia bianche e nere solide nel punto di scelta del labirinto. Se il mouse ha scelto correttamente il braccio nero per il 70% delle prove per 2 giorni consecutivi, progredisci a un livello successivo con compiti di discriminazione sempre più impegnativi. Per raggiungere questo obiettivo, introdurre gradualmente un ulteriore 10% di colore contrastante su ciascun braccio ad ogni livello di progressione. Ad esempio, il passaggio del braccio bianco ad essere composto per il 90% da bianco e per il 10% da nero, e viceversa, rendendo la discriminazione più impegnativa ad ogni avanzamento.
            NOTA: L'idea per l'aumento è che se si può raggiungere un 50% di bianco/nero, sarebbe un controllo efficace in quanto le braccia sarebbero indistinguibili. Tuttavia, il massimo che i topi sono stati in grado di discriminare visivamente è stato dell'80%:20% (Figura 5B).

Risultati

Questo studio pilota mirava a delineare metodologie per l'addestramento efficiente dei topi in due compiti distinti: un semplice corridoio e un compito decisionale complesso (il compito di discriminazione visiva del labirinto a Y). Questi dati sono serviti come base per stabilire linee guida temporali per l'allenamento comportamentale in VR.

Le fasi procedurali iniziano delineando l'impianto chirurgico della barra per la testa nella Figura 1. Questo impianto serve a stabilizzare il cranio del topo durante le valutazioni comportamentali, migliorando così la precisione delle registrazioni neurali, in particolare se impiegato in combinazione con tecniche di elettrofisiologia o di imaging.

La Figura 2 e la Figura 3 illustrano i componenti hardware e la configurazione del sistema sperimentale. La Figura 2 descrive in dettaglio il sistema di erogazione dell'acqua, che utilizzava un metodo di fontana a piastre di Petri. Ciò ha comportato l'applicazione di una piastra di Petri di 60 mm x 15 mm con il lato concavo rivolto verso il basso sul pavimento della gabbia, il fissaggio di una piastra di Petri più piccola di 35 mm x 10 mm con il lato concavo rivolto verso il basso al centro della piastra più grande e il posizionamento di un'altra piastra di Petri di 60 mm x 15 mm con il lato concavo rivolto verso l'alto sopra la piastra più piccola per fungere da serbatoio d'acqua. L'altezza del piatto superiore è stata accuratamente regolata per prevenire la contaminazione da parte del materiale della lettiera, garantendo al contempo che i topi avessero un facile accesso all'acqua.

La Figura 3 presenta le linee guida per l'hardware del sistema e il posizionamento del mouse. La Figura 3A illustra la configurazione VR, che presentava una serie di sei schermi con un tapis roulant sferico posizionato centralmente. La Figura 3B mostra il posizionamento ottimale del mouse sul tapis roulant, con la testa allineata in posizione naturale e tutte e quattro le zampe a contatto con la superficie. La Figura 3C confronta il posizionamento corretto ed errato del mouse rispetto alla barra della testa, sottolineando che il piano sagittale medio del mouse dovrebbe essere centrato, piuttosto che allinearsi con la barra della testa stessa.

La Figura 4 presenta le curve di acquisizione della ricompensa su un grafico a linee, illustrando i periodi di apprendimento previsti per corridoi stretti di 1 m, 2 m e 3 m in VR in base a parametri predefiniti per la progressione. Descrive le velocità medie dei topi attraverso le rispettive lunghezze delle tracce, dimostrando un graduale aumento della velocità come prova dell'apprendimento e del miglioramento dei compiti commisurato all'aumento della difficoltà. Viene anche mostrato un grafico a barre che illustra il numero medio di giorni necessari ai topi per raggiungere il criterio per le tracce lineari, nonché un grafico a barre che mostra le velocità medie per ogni lunghezza della traccia. Successivamente, vengono illustrate anche le fasi progressive del compito di traccia lineare apprese dai topi. Questi compiti sono stati progettati per replicare le metodologie stabilite nella letteratura accademica, garantendo al contempo una curva di apprendimento fattibile per i topi, facilitando il loro avanzamento attraverso i livelli.

Infine, la Figura 5 fornisce i dati relativi all'attività Y-Maze. La figura illustra la natura progressiva del compito, a partire da una semplice discriminazione tra braccia bianche e nere solide. Questa fase iniziale funge da passaggio fondamentale, stabilendo la capacità dei topi di distinguere tra segnali visivi contrastanti. I livelli successivi del compito introducono una complessità crescente incorporando percentuali aggiuntive del colore contrastante in ciascun braccio, sfidando così ulteriormente le capacità di discriminazione dei topi. L'aumento graduale della difficoltà del compito è esemplificato dal passaggio da braccia solide in bianco e nero a braccia composte per il 90% da un colore e per il 10% dall'altro. In particolare, i dati presentati nella Figura 5 indicano che, mentre l'accuratezza della discriminazione migliora ad ogni livello di progressione, alcuni topi dimostrano costantemente una soglia di capacità di discriminazione visiva, raggiungendo un massimo dell'80%/20% di discriminazione bianco/nero. Questa osservazione sottolinea i limiti inerenti alle capacità di discriminazione visiva dei topi nel contesto del compito Y-Maze, fornendo preziose informazioni sulla fattibilità del compito e sulle capacità cognitive dei soggetti. Successivamente, vengono dettagliate le fasi progressive del compito del percorso del labirinto a Y, che sono state progettate per allinearsi con le metodologie stabilite in letteratura. Queste fasi hanno assicurato una curva di apprendimento fattibile per i topi, supportando il loro graduale avanzamento attraverso i livelli.

Figura 1: Istruzioni chirurgiche per l'impianto della barra della testa. (A) Il sito di incisione è segnato sul cranio del topo. (B) Le viti devono essere impiantate 1 mm a sinistra della sutura interfrontale leggermente al di sotto della bregma e 3 mm a destra della sutura interfrontale leggermente sopra la lambda. (C) La barra per la testa deve essere posizionata lungo la sutura interfrontale. (D) Applicare il cemento dentale sull'impianto della barra di testa. (E) Visualizzazione effettiva della barra di testa dopo l'applicazione del cemento dentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Sistema di erogazione dell'acqua con il metodo della fontana a piastre di Petri. Una piastra di Petri di 60 mm x 15 mm è stata fissata con il lato concavo rivolto verso il basso sul pavimento della gabbia. Una piastra di Petri più piccola di 35 mm x 10 mm era centrata sulla piastra più grande, con un'altra piastra di Petri di 60 mm x 15 mm posizionata con il lato concavo rivolto verso l'alto per fungere da serbatoio. Questa configurazione assicurava che l'acqua rimanesse incontaminata dalla lettiera e accessibile ai topi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Linee guida per l'hardware del sistema e il posizionamento del mouse. (A) Mostra la configurazione VR utilizzata. È stata utilizzata una configurazione a sei schermi, con il tapis roulant sferico posizionato al centro. (B) Vista laterale del posizionamento ottimale del mouse sul tapis roulant sferico. La testa del topo è in una posizione naturale, mentre tutte e quattro le zampe sono sul tapis roulant sferico. (C) Vista dall'alto del posizionamento corretto o errato del mouse rispetto alla barra della testa. Per un corretto posizionamento, il piano sagittale medio del mouse deve essere centrato piuttosto che la barra della testa stessa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Dati del percorso lineare. (A) I dati presentati illustrano le ricompense giornaliere raccolte durante ogni periodo di prova di 30 minuti. I topi sono passati a tracce più lunghe una volta raggiunta una media di 2 ricompense al minuto per 2 giorni consecutivi, per un totale di 60 ricompense (soglia). (B) Man mano che i topi acquisivano competenza nel compito, le loro velocità mostravano un aumento graduale, indicativo dell'efficacia del rinforzo della ricompensa. Il grafico illustra la velocità media giornaliera di ciascun topo sulla pista in cm/s, rappresentando una progressione lineare nel comportamento appreso. (C) Questo grafico a barre illustra il tempo impiegato da ciascun mouse per acquisire competenza sulle singole lunghezze delle tracce, con le rispettive medie e l'errore standard rappresentati per ciascuna lunghezza delle tracce. (D) Questo grafico a barre mostra la media e l'errore standard delle velocità medie giornaliere raggiunte da ciascun mouse su varie lunghezze di traccia. La progressione quasi lineare suggerisce un miglioramento appreso nella velocità di corsa. (E) Questo illustra la progressione dell'attività del percorso lineare, che richiede 2 giorni di prova consecutivi di 60 ricompense prima di passare a una versione più lunga del labirinto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Dati Y-Maze. (A) Mostra la distribuzione delle ricompense acquisite nelle diverse fasi della progressione del labirinto a Y. Questa analisi si è concentrata esclusivamente su un sottogruppo di quattro topi che hanno completato tutte le fasi del percorso lineare, garantendo così un'equa rappresentanza di partecipanti sia maschi che femmine. (B) Questa rappresentazione visiva illustra le fasi del compito Y-Maze, in cui i topi avanzano dopo aver raggiunto due giorni consecutivi di scelte corrette del 70%. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo studio ha impiegato un approccio completo per studiare le risposte comportamentali dei topi in ambienti VR, concentrandosi sull'implementazione di procedure chirurgiche, protocolli di restrizione dei fluidi, configurazione del sistema e compiti comportamentali. Questi risultati contribuiscono al campo fornendo dettagli procedurali, tempi per la formazione e tassi di successo. Ciò consentirà un'adozione più efficace delle procedure VR nei topi e faciliterà la pianificazione e l'implementazione per i laboratori interessati a utilizzare questa procedura nella loro ricerca.

L'impianto chirurgico di head-bar è stato essenziale per facilitare gli esperimenti comportamentali con head-fixed in ambienti VR. Seguendo attentamente i protocolli stabiliti e fornendo un'adeguata assistenza post-operatoria, è stata garantita la riuscita integrazione delle barre per la testa, riducendo al minimo gli effetti negativi sulla salute e sul comportamento degli animali. Inoltre, sono stati implementati protocolli di restrizione dei liquidi per regolare l'assunzione di acqua e mantenere i livelli di idratazione e sete tra i topi. Il graduale processo di acclimatazione e l'accesso periodico all'acqua sono stati fondamentali per garantire il benessere degli animali e facilitare l'esecuzione dei compiti comportamentali.

La configurazione del sistema comportamentale VR ha comportato l'integrazione di componenti hardware e software per creare ambienti virtuali immersivi per i topi. L'utilizzo di display virtuali completamente immersivi, sistemi di ricompensa liquidi, palle di polistirolo come tapis roulant sferici e supporti per la testa ha consentito un controllo preciso sulle condizioni sperimentali e sull'acquisizione dei dati. I compiti comportamentali, tra cui la traccia lineare e i paradigmi del labirinto a Y, sono stati attentamente progettati per indagare gli aspetti chiave del comportamento del topo, come la locomozione, il processo decisionale e l'elaborazione della ricompensa.

Nonostante i migliori sforzi per ottimizzare le procedure sperimentali, durante lo studio sono state incontrate diverse sfide. La variabilità delle risposte dei singoli mouse e i problemi tecnici relativi all'integrazione di hardware e software hanno posto sfide alla raccolta e all'analisi dei dati. Inoltre, la dipendenza dai protocolli di restrizione dei liquidi ha richiesto un attento monitoraggio dello stato di idratazione dell'animale e l'adeguamento delle procedure sperimentali di conseguenza. A volte, i topi faticavano quando venivano posizionati sulla palla, non bevevano dal beccuccio della ricompensa o si bloccavano e non riuscivano a correre sulla palla. Sebbene alcune di queste sfide possano essere temporanee, è fondamentale monitorare i topi per assicurarsi che non incontrino ostacoli nei loro progressi. I topi che non riescono a mostrare progressi rispetto ai loro coetanei dovrebbero essere ritirati dallo studio. Un esperimento simile ha fatto rimuovere 4 topi su 55 a causa della loro incapacità di apprendere il paradigma²⁵. I topi che mostravano un'immobilità costante sulla palla per 5 giorni consecutivi sono stati esclusi dallo studio a seguito di valutazioni approfondite del loro peso, della capacità di accedere al beccuccio della ricompensa per bere e del posizionamento sulla palla per garantire che non fossero presenti problemi di fondo. In questi casi, è a discrezione del ricercatore decidere quale strategia adottare per riprendere lo studio in modo efficiente.

Questi protocolli di allenamento sono stati progettati per sfidare progressivamente i topi, garantendo al contempo la loro competenza nell'esecuzione di compiti comportamentali. I criteri per la progressione dal percorso lineare al paradigma del labirinto a Y si basavano sulla capacità dei topi di soddisfare soglie di prestazione predeterminate, come il raggiungimento di giorni consecutivi di prove di successo e l'acquisizione di ricompense. L'implementazione di rigorosi protocolli di addestramento ci ha permesso di valutare le capacità comportamentali e l'adattabilità dei topi a compiti sempre più complessi. Questi protocolli accuratamente strutturati forniscono un quadro solido per i ricercatori nel campo delle neuroscienze comportamentali, offrendo un approccio sistematico alla valutazione e all'addestramento degli animali per diversi paradigmi sperimentali. Delineando criteri chiari per la progressione, i ricercatori possono valutare in modo efficiente la curva di apprendimento dei soggetti sperimentali e curare i paradigmi di formazione di conseguenza. Inoltre, questo approccio metodologico favorisce la riproducibilità e la standardizzazione tra gli esperimenti, facilitando le analisi comparative e facendo progredire la comprensione dei processi cognitivi e dei meccanismi di apprendimento nei modelli animali.

Quando si progetta un paradigma VR per i topi, è fondamentale riconoscere la gamma di approcci disponibili per quanto riguarda la complessità del compito e la progressione dell'allenamento. Questo protocollo offre un ampio quadro per la costruzione di un disegno sperimentale, ma spetta allo sperimentatore personalizzare aspetti specifici come l'erogazione della ricompensa, il controllo dei bias, il tipo di stimolo, la progressione del compito e i parametri del sistema in base alle esigenze dello studio. Ad esempio, alcuni studi optano per un approccio più snello, concentrandosi sull'impegno immediato delle attività. Un esempio è Krumin et al. che ha implementato un singolo compito coerente del labirinto a T piuttosto che impiegare un regime di apprendimento progressivo tra diversi compiti. Al contrario, altri studi offrono diverse componenti di progettazione dello studio, come le strategie di rinforzo dello stimolo e i segnali uditivi. Lo studio ha utilizzato il feedback uditivo come punizione per le prove errate e ha fornito solo acqua come ricompensa per le prove corrette²⁶. Al contrario, Zhao et al. hanno impiegato una soluzione di saccarosio al 10% come ricompensa per le prove corrette e non hanno incorporato alcuna forma di punizione per le prove errate²⁷. Invece, si sono concentrati sulla mitigazione delle risposte errate attraverso metodi come l'addestramento anti-pregiudizio, che ha comportato l'aumento della probabilità di cambiare la direzione del segnale dalla scelta precedente dell'animale e la regolazione della razione giornaliera di acqua per migliorare la motivazione. Le differenze nel disegno sperimentale, come la presenza di segnali spaziali durante il compito, possono portare a diverse interpretazioni della codifica neurale, come evidenziato da Zhao et al. che hanno trovato la selettività delle cellule della corteccia parietale posteriore spiegata da traiettorie e preferenze spaziali, in contrasto con le sequenze di attivazione dipendenti dalla scelta osservate da Harvey et al.^27,28. È importante notare che l'hardware specifico utilizzato includeva sei monitor LCD, un beccuccio da leccare estensibile e un tapis roulant a sfera in polistirolo con cuscinetto d'aria. Esistono diverse differenze tra i sistemi di realtà virtuale dei laboratori, tra cui l'uso di proiettori²⁹ rispetto ai monitor dei computer, tapis roulant non sferici³⁰ e beccucci fissi¹⁰ rispetto a quelli estensibili.

In conclusione, questo studio fornisce preziose informazioni sulle risposte comportamentali dei topi in ambienti VR e dimostra la fattibilità dell'impiego della tecnologia immersiva per studiare comportamenti complessi. Gli sforzi di ricerca futuri potrebbero concentrarsi sul perfezionamento dei protocolli sperimentali, sull'esplorazione dei meccanismi neurali alla base dei processi decisionali e sulla traduzione dei risultati in applicazioni cliniche. Continuando a far progredire la comprensione del comportamento dei topi, gli scienziati possono chiarire ulteriormente i circuiti neurali e i processi cognitivi alla base di comportamenti complessi sia in salute che in malattia.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.4 mm Screws (00-96 X 3/32)	Protech International	8L0X3905202F	For Added Headbar Stability
Bupivocaine	Hospira	NDC:0409-1162-19	Local Anesthetic
Buprenorphine	Wedgewood Pharmaceuticals	SKU: BUPREN-INJ010VC	Analgesia
Buzzers	Wahl	1565q	For Shaving Surgical Region
Drill and microinjection robot	Neurostar	17129-IDA	Stereotaxis
GLUture	Zoetis	32046	Surgical Adhesive
Head-bar Implant	Luigs-Neumann	130060	Mouse Head Implant
Heating Pad (Lectro-Kennel)	K&H Manufacturing	100212933	Post-operative
Hemostats	World Precision Instruments	501291	Surgical Tool
Hydrogen Peroxide	Swam	L0003648FB	Cleaning Agent
Isoflurane	Dechra	B230008	Surgical Inhalation Anesthetic
Isoflurane/O2 Delivery device w Nosecomb attachments	Eagle Eye Anesthesia Inc.	Model 50 Anesthesia	Surgical Device
Metabond	Parkell	CB-S380	Adhesive Cement
Microscissors	Fine Science Tools	15000-08	Surgical Tool
Oxygen	Praxair	UN1072	Surgical Oxygen
Povidone-Iodine Swabstick	Dynarex	g172095-05	Surgical Tool
Saline	Hospira	NDC:0409-1966-02	Hydration Agent
Sterile Cotton Tipped Applicator (Q-tips)	Puritan	25-806 2WC	Surgical Tool
Sucrose	Fisher Chemical	CAS 57-50-1	Primary Reinforcer/Motivator/Reward
Tweezers	World Precision Instruments	504505	Surgical Tool
Virtual Reality System	PhenoSys	JetBall-TFT	The JetBall, an air cushioned spherical treadmill allows an animal to navigate effortlessly in a virtual world projected on 6 surrounding monitors.
White petrolatum lubricant eye ointment ointment	AACE Pharmaceuticals	NDC:71406-124-35	Eyelube