Modello di co-coltura che utilizza due tipi di linee cellulari aderenti

Riepilogo

Il protocollo mostra un nuovo modello sperimentale in vitro in grado di ricapitolare la biologia di due tipi di linee cellulari aderenti con un'impalcatura tridimensionale (3D) stampata. Vengono descritte la costruzione di questo modello e le procedure operative, dalla preparazione e coltura cellulare all'analisi e valutazione.

Abstract

L'impianto dell'embrione è influenzato dalle interazioni tra i diversi tipi di cellule nell'interfaccia madre-embrione. Le comunicazioni dirette e indirette tra i vari tipi di cellule all'interno della decidua sono cruciali per regolare la ricettività endometriale; Tuttavia, i meccanismi molecolari che mediano questa interazione non sono ancora chiari. A questo proposito, è necessario un modello per studiare il processo di impianto per stabilire un modello in vitro completo in grado di ricapitolare la biologia dell'interazione tra epitelio endometriale e stroma. Questo modello è composto da normali piastre per colture cellulari e da un'impalcatura corrispondente, generata dalla stampa tridimensionale (3D) da materiali a basso costo. Qui, descriviamo in dettaglio una serie di protocolli per la costruzione del modello, la preparazione delle cellule, la semina delle cellule, la coltura cellulare, l'osservazione e la valutazione. Inoltre, abbiamo incluso risultati rappresentativi con cellule che mostrano buone condizioni di crescita al microscopio. Questo studio mirava a sviluppare modelli in vitro che imitassero l'interazione tra le cellule stromali endometriali e le cellule epiteliali, nonché tra le cellule del trofoblasto e le cellule endometriali.

Introduzione

Nonostante le ricerche approfondite sulla gravidanza umana, i meccanismi molecolari all'interfaccia materno-fetale durante l'impianto e l'inizio della gravidanza rimangono poco conosciuti¹. L'endometrio umano è composto principalmente da due tipi di cellule: cellule epiteliali endometriali (EEC) e cellule stromali endometriali (ESC). L'impianto progredisce attraverso tre fasi: apposizione, attaccamento e invasione, che portano allo sviluppo di un embrione competente e di un endometrio ricettivo². Considerando i vincoli etici degli studi in vivo su soggetti umani, nonché le difficoltà nel simulare completamente la condizione umana negli animali, la costruzione di modelli di coltura dell'endometrio umano in vitro è diventata un mezzo efficace per replicare i processi di impianto e di gravidanza precoce³. Questi modelli sono preziosi per studiare sia le gravidanze normali che quelle patologiche e forniscono una piattaforma fondamentale per la sperimentazione preliminare e la convalida degli interventi terapeutici nella medicina traslazionale.

Le camere commerciali sono state ampiamente utilizzate nella ricerca biologica cellulare. Queste camere offrono preziose informazioni sulla migrazione cellulare e sulla diafonia tra diversi tipi di cellule. Tuttavia, le camere commerciali sono in genere monouso e possono essere costose⁴.

Un gran numero di modelli di coltura umana in vitro costituiti da endometrio e blastocisti, o surrogati di blastocisti, sono stati sviluppati per comprendere meglio il processo dettagliato dell'impianto. Questi modelli, tuttavia, sono ancora nella loro fase iniziale di applicazione poiché la struttura 3D è una configurazione sperimentale molto complicata e alcuni mezzi di differenziazione specifici sono costosi ^5,6,7.

L'uso di hardware di stampa 3D a prezzi accessibili e un periodo di produzione relativamente breve consentono di adattare le strutture per diversi scopi sperimentali. Le tecniche di stampa 3D aiutano a ridurre i costi di tempo e consentono la creazione di strutture complesse e personalizzate. Questa tecnologia accelera in modo significativo la progettazione e l'iterazione del prototipo, rendendola uno strumento prezioso per i ricercatori in vari campi, consentendo loro di completare il loro lavoro in modo più efficiente ^8,9,10.

Qui, presentiamo un protocollo sperimentale fattibile ed economico per la costruzione della struttura 3D e il suo utilizzo come sistema di coltura cellulare, in grado di simulare l'interazione tra cellule stromali ed epiteliali endometriali per lo studio della ricettività endometriale durante l'impianto dell'embrione. Ciò fornisce un'alternativa personalizzabile e a basso costo per il materiale usa e getta commerciale.

Protocollo

NOTA: Tutti i reagenti utilizzati in questo protocollo sono disponibili nella Tabella dei materiali. Se non diversamente specificato, tutti i fluidi sono stati pre-bilanciati a 37 °C prima dell'uso.

1. 3D stampa del ponteggio e costruzione del modello

NOTA: I passaggi qui riportati sono stati eseguiti secondo il manuale della macchina da stampa 3D in metallo commerciale. I passaggi sono brevemente descritti di seguito (File supplementare 1).

1. Stampa il livellamento del piano
   1. Tocca l'icona Menu sulla dashboard e vai su Utilità. Selezionare Livello piano per avviare la routine di livellamento.
   2. Rimuovere il foglio di stampa dal piano di stampa e selezionare Fine. Il piano di stampa salirà alla sua altezza massima in preparazione per il livellamento. Una volta che la barra di avanzamento raggiunge il 100%, premi Start.
   3. Se la stampante Metal X non è stata livellata in precedenza, selezionare Ripristina. In caso affermativo, scegli Salta e procedi direttamente al passaggio 1.1.5 (la scansione a 16 punti).
   4. Utilizzare una chiave esagonale da 2,5 mm per ruotare tutte le viti di livellamento a tre letti in senso orario finché non sono serrate. Quindi, allentarli ruotandoli in senso antiorario di due rotazioni complete per impostarli a un'altezza del punto medio. Premere Fine per continuare.
   5. La stampante eseguirà la scansione del letto in 16 punti designati. Astenersi dal toccare il letto o il telaio durante questo processo. Una volta che l'avanzamento raggiunge il 100%, premi Avanti.
2. Applicazione del foglio di stampa
   1. Rimuovere eventuali residui di metallo o detriti di supporto. Sposta il cursore Vuoto su On.
   2. Lasciare che il letto si abbassi e si riscaldi, quindi premere Avanti. Posizionare il foglio di stampa sulla griglia del vuoto e premere Avanti.
   3. Posizionare la pressa per fogli sul foglio di stampa, allineandola con le guide Z sul retro della camera.
   4. Attendere che il vuoto si innesti e crei una tenuta stabile. Una volta che l'aspirapolvere è innestato, premere Fine.
3. Caricamento di filamenti metallici
   1. Posizionare manualmente la testina di stampa al centro dell'area di stampa. Rimuovere il coperchio della testina di stampa facendolo scorrere verso l'alto e sganciando le viti di montaggio.
   2. Tocca l'icona Menu nella scheda delle opzioni. Selezionare Materiali dalle opzioni.
   3. Scegliere Carica metallo per avviare la routine di caricamento. Scegli Caricamento rapido.
   4. Selezionare il tipo specifico di materiale metallico da caricare (ad esempio, Alluminio 6061-T6 | 3.3211 | 65028 | AlMg1SiCu).
   5. Posizionare la bobina sul supporto e premere Avanti. Chiudere lo sportello e lasciare che le bobine si riscaldino, quindi premere Avanti.
   6. Inserire il materiale nell'ingresso anteriore della testina di stampa (etichettato M) fino a quando l'estrusore inizia ad aspirarlo.
4. Stampa di parti metalliche
   1. Nel pannello Impostazioni di stampa, fare clic su Esporta Build. Salvare il file su un'unità USB formattata in FAT32 e inserirlo nella stampante.
   2. Seleziona l'icona Menu sulla lavagna. Passare a Archiviazione e selezionare Stampa da archiviazione. Scegliere il file di parte per avviare la stampa.
5. Rimozione di parti metalliche
   1. Far scorrere con cautela il foglio di stampa e le parti stampate dal piano di stampa. Staccare delicatamente le parti dal foglio di stampa. Il foglio flessibile dovrebbe staccarsi con facilità.

2. Preparazione per la co-coltura cellulare nel modello 3D

NOTA: Si raccomanda di utilizzare materiali resistenti alle alte temperature come materiali di consumo per la stampa 3D di supporti per impalcature di vetrini coprioggetti per celle per facilitare la sterilizzazione in autoclave prima di ogni utilizzo in esperimenti di coltura cellulare. In questo studio sono state utilizzate cellule stromali endometriali umane immortalizzate (HESC) e cellule epiteliali endometriali umane (Ishikawa). La caratterizzazione di queste linee cellulari è stata precedentemente riportata ^5,6.

1. Colture cellulari e passamento
   1. Preparare 50 ml di terreno complementare per hESC aggiungendo terreno DMEM/F12 + 2 mM di L-glutammina + 10% di siero fetale bovino (FBS) privato del carbone + 1% di soluzione di penicillina/streptomicina.
   2. Preparare 50 ml di terreno complementare per Ishikawa aggiungendo Dulbecco's Modified Eagle Medium + 10% FBS + 1% Penicillina/Streptomicina Solution.
   3. Scongelamento delle celle
      NOTA: La linea cellulare acquistata è stata spedita su ghiaccio secco allo stato congelato. Deve essere conservato in fase vapore di azoto liquido o a una temperatura inferiore a -130 °C.
      1. Preparare tutte le apparecchiature sterilizzate necessarie e l'enzima di dissociazione e riscaldare il terreno complementare a 37 °C.
      2. Scongelare rapidamente le cellule in un bagno d'acqua a 37 °C con occasionali lievi oscillazioni. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta contenente 5 mL di terreno di coltura basale e centrifugare a 200 x g per 5 minuti.
      3. Rimuovere con cautela il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di terreno di coltura completo preparato e dispensarlo in due matracci di coltura T25. Coltura delle cellule in un incubatore a 37 °C e 5% di CO₂.
2. Preparazione delle cellule con vetrino coprioggetti
   1. Utilizzare un vetrino coprioggetti quadrato da 18 mm come superficie della coltura cellulare; Assicurarsi che il vetrino coprioggetti sia pulito e sterile.
   2. Rivestire il vetrino coprioggetti sul fondo di una piastra a 12 pozzetti con 200 μL di matrice extracellulare (ECM) a una concentrazione di 200-300 μg/mL. Mantenere la piastra a 37 °C per 1 ora.
   3. Rimuovere l'ECM dalla piastra. Ispezionare le celle per verificarne la confluenza appropriata e assicurarsi che la densità di entrambe le linee cellulari sia di circa il 70%-80%
   4. Rimuovere il terreno esaurito e lavare le cellule con 3 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 2x.
   5. Aggiungere 2 mL di enzima di dissociazione e coltivare le cellule a 37 °C per 2 minuti per staccarle.
   6. Neutralizzare con terreno di coltura completo e creare una sospensione a cellula singola pipettando su e giù.
   7. Prelevare 100 μl della sospensione cellulare e mescolarla con il blu di tripano (fattore di diluizione =2).
   8. Far scorrere il vetrino coprioggetti sulla camera dell'emocitometro. Riempire entrambe le camere laterali con la sospensione cellulare contenente tripano blu.
   9. Conta il numero di cellule in quadrati su entrambi i lati con un microscopio 20x e calcola la densità delle cellule.
   10. Trasferire le cellule nella piastra preparata con terreno fresco e incubare a 37 °C con CO₂ al 5%. Seminare l'hESC nel pozzetto a 1 x 10⁵ cellule/mL per 24 ore.
   11. Per la linea cellulare di Ishikawa, seminare la cellula nel pozzetto senza vetrino coprioggetti il giorno successivo.

3. Assemblaggio del modello di co-cultura

1. Immergere accuratamente le impalcature con alcol etilico e acqua doppia distillata (ddw) per 2 giorni. Sterilizzare gli scaffold con un'autoclave a 121 °C e asciugarli.
2. Aggiungere circa 2 mL di terreno complementare per la linea cellulare Ishikawa al pozzo di coltura Ishikawa, assicurandosi che il livello del liquido copra il vetrino coprioggetti.
3. Trasferire il coprioggetto con hESC sull'impalcatura e tenere il lato con la cella rivolta verso il basso. Collega l'impalcatura al ben colto Ishikawa. Per il secondo set, invertire questa disposizione trasferendo il coprioggetto con Ishikawa sull'impalcatura e inserendo l'impalcatura nell'hESC ben coltivatore. Utilizzare le celle senza la configurazione dell'impalcatura per l'analisi della crescita cellulare in crescita indipendente.
4. Incubare il sistema di co-coltura a 37 °C, 5% CO₂. Il periodo di co-coltura può variare a seconda del disegno sperimentale, ma in genere varia da 24 a 72 ore.

4. Acquisizione delle immagini

1. Rimuovere con cautela il terreno di coltura e sciacquare delicatamente le cellule con soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) sterile.
2. Rimuovere i vetrini coprioggetti con le cellule attaccate dalle piastre di coltura utilizzando una pinza fine o una pinzetta. Facoltativamente, posizionare i vetrini coprioggetti in un nuovo piatto con PBS per evitare che si secchino durante il trasferimento.
3. Prendi un vetrino da microscopio pulito e posiziona una goccia di PBS. Trasferire delicatamente il vetrino coprioggetti contenente le cellule sulla goccia del terreno di montaggio, assicurandosi che le cellule siano rivolte verso il basso sul vetrino.
4. Posizionare il vetrino preparato sul tavolino del microscopio invertito. Selezionare l'obiettivo appropriato (ad es. 10x, 20x) e regolare la messa a fuoco utilizzando le manopole di messa a fuoco grossolana e fine.
5. Impostare i parametri del microscopio come l'intensità dell'illuminazione e le impostazioni della fotocamera. Utilizzando il software del microscopio, è possibile acquisire immagini delle cellule con gli ingrandimenti e i campi visivi desiderati. Regola il tempo di esposizione e altre impostazioni di imaging per ottimizzare la qualità dell'immagine.

5. Elaborazione delle immagini

1. Fare clic su Apri per aprire l'immagine, fare clic su Elabora > filtri > miglioramento per > scegliere l'equalizzazione locale e fare clic su Applica.
2. Fare clic su Modifica > Converti in > scala di grigi 8. Fai clic su Migliora, scegli Applica contrasto.
3. Fai clic su Conta e misura i soggetti. Fare clic su Manuale, selezionare un intervallo e regolare l'istogramma per assicurarsi che tutte le celle siano coperte.
4. Fare clic su Applica maschera, chiudere la finestra corrente, fare clic su Oggetti luminosi automatici > misurare, selezionare Misurazione e scegliere Aera, Dendric, Densità e Dimensioni.
5. Fai clic su "Oggetti luminosi automatici", quindi fai clic su Conteggio. Fare clic su Esporta dati per esportare i dati di misurazione in un foglio di calcolo.

6. Raccolta di cellule

1. Rimuovere i vetrini coprioggetti dal vetrino del microscopio e trasferirli in un pozzetto pulito e asciutto.
2. Raccogliere la cellula di Ishikawa con il reagente di isolamento dell'RNA per la trascrittomica o il reagente di lisi Ripa per la ricerca proteomica.
   NOTA: Per l'hESC, il metodo di coltura del vetrino coprioggetto è risultato più efficace per l'acquisizione delle immagini dopo la colorazione immunitaria. In alternativa, l'hESC può essere raccolta con il reagente di isolamento dell'RNA o con il reagente di lisi Ripa. Le linee cellulari coltivate sul vetrino coprioggetti o sulla superficie della piastra potrebbero essere scambiate; Tuttavia, si consiglia di seminare le cellule preparate per l'analisi di imaging sul vetrino coprioggetti.

Risultati

La Figura 1 mostra lo scaffold fatto in casa per i vetrini cellulari utilizzati in questo processo, che comprende un anello di supporto superiore su misura per il fissaggio a piastre di coltura cellulare standard a 12 pozzetti, completato da un supporto per vetrini di cellule basali con quattro strutture a forma di L a forma di bastoncino.

Secondo la Figura 2, la densità di entrambi i tipi cellulari ...

Discussione

Viene descritto un protocollo semplificato ed economico per la co-coltura indiretta di cellule endometriali, stromali ed epiteliali. Questo metodo utilizza un'impalcatura fatta in casa per vetrini cellulari, che comprende un anello di supporto superiore su misura per il fissaggio a piastre di coltura cellulare standard a 12 pozzetti, completato da un supporto per vetrini di cellule basali con quattro strutture a forma di bastoncino a forma di L. Questa configurazione facilita la separazi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Hanks′ Balanced Salt solution	Solarbio	H1046	1/10
12-well Clear TC-treated Plates	Corning	3513	-
25 cm² Cell Culture Flask	Corning	430639	-
Aluminum	Markforged	6061-T6	-
DMEM/F12	Sigma-aldrich	D2906	-
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
FBS	Gibco	10099141C	1/10
Fetal bovine serum	Gibco	10099141C
ITS Premix	Biocoat	354350	1/100
Matrigel Matrix	Corning	354248	ECM
Metal X	Markforged	M F-PR-5000	-
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1/100
Round Coverslip	Biosharp	BS-18-RC	-
TrypLE Select (10X)	Gibco	A1217701	dissociation enzyme