Isolamento e registrazione con patch-clamp a cellule intere della microglia ippocampale da topi adulti

Riepilogo

Il presente protocollo descrive come isolare e purificare la microglia ippocampale primaria da topi adulti, seguito da istruzioni per condurre registrazioni di patch-clamp su cellule intere su queste cellule isolate acutamente.

Abstract

Le microglia sono cellule immunitarie residenti nel cervello che interagiscono con i neuroni per mantenere l'omeostasi del sistema nervoso centrale (SNC). Gli studi dimostrano che la superficie microgliale esprime canali del potassio che regolano l'attivazione della microglia, mentre le anomalie in questi canali del potassio possono portare a malattie neurali. Attualmente, le registrazioni patch-clamp di cellule intere della microglia vengono eseguite principalmente su microglia primarie in coltura da topi fetali o neonati a causa delle difficoltà nel condurre valutazioni elettrofisiologiche su microglia isolate acutamente. Questo studio introduce un protocollo facile da seguire per isolare la microglia ippocampale da topi adulti ed eseguire registrazioni di patch-clamp su cellule intere sulle cellule isolate. In breve, il cervello è stato rimosso da un topo dopo la decapitazione, l'ippocampo è stato sezionato bilateralmente e le microglia sono state isolate utilizzando un kit di dissociazione cerebrale di topo adulto. Le microglia sono state quindi purificate utilizzando un metodo di smistamento cellulare attivato magneticamente (MACS) e seminate su vetrini. Il successo dell'isolamento microgliale è stato confermato dalla colorazione immunofluorescente con anticorpi anti-CD11 e anti-Iba1. Un vetrino coprioggetto è stato posto in una camera di registrazione e le correnti di potassio dell'intera cellula della microglia acutamente isolata sono state registrate in condizioni di voltage-clamp.

Introduzione

Le microglia, che derivano dai progenitori mieloidi nel sacco vitellino primitivo, sono residenti nel SNC e comprendono circa il 10-15% delle cellule nervose totali ^1,2. Funzionalmente, oltre a sorvegliare l'ambiente locale, svolgere funzioni di difesa immunitaria e fornire nutrimento e supporto ai neuroni ^3,4, la microglia può anche contattare direttamente i neuroni per regolare i recettori della superficie neuronale e il corrispondente legame del ligando e interagire indirettamente con i neuroni attraverso la secrezione di citochine⁵. Studi in vitro e in vivo hanno dimostrato che le microglia esprimono vari tipi di canali del potassio, che contribuiscono al mantenimento del potenziale di membrana negativo⁶ e regolano l'attivazione microgliale. Dato che i canali del potassio microgliali anomali sono stati osservati in varie malattie cerebrali⁷, è fondamentale per i ricercatori identificare potenziali farmaci che prendono di mira questi canali del potassio e sviluppare strategie per regolare la funzione microgliale.

I metodi tradizionali di digestione e purificazione delle microglia spesso utilizzano l'intero cervello, il che trascura l'eterogeneità delle microglia in diverse aree cerebrali⁸. La dissociazione in vitro e la coltura a lungo termine in terreni contenenti siero pongono le microglia in uno stato attivo⁹, che potrebbe non riflettere accuratamente le loro caratteristiche fisiologiche e il loro stato reale.

Inoltre, mentre le correnti di potassio raddrizzatore verso l'esterno sono state registrate nella microglia neonatale primaria in coltura e nelle linee cellulari¹⁰, i dati provenienti da colture a lungo termine di tessuto cerebrale fetale o neonato di topo possono differire da quelli della microglia matura. Il presente protocollo mira a isolare in modo acuto le microglia e ad eseguire immediatamente registrazioni di intere cellule di correnti di potassio microgliale utilizzando tessuto cerebrale di topo adulto.

Le proprietà biochimiche e dei canali del potassio sono state esaminate utilizzando un metodo adatto per l'isolamento e la purificazione di microglia da piccoli tessuti 11,12,13,14,15. Pertanto, questo protocollo fornisce una guida ai ricercatori per chiarire le proprietà biochimiche e funzionali della microglia in condizioni fisiologiche e patologiche. Sebbene questo protocollo utilizzi l'ippocampo e i canali del potassio come esempi, può essere applicato anche allo studio di altre aree cerebrali e delle proprietà elettrofisiologiche dei canali/cellule.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Life Science Animal Care and Use Committee della South China Normal University e sono stati mantenuti standard appropriati di benessere degli animali (approvazione etica: SCNU-SLS-2023-048). Per questo studio sono stati utilizzati topi C57BL/6J maschi o femmine di 3-5 mesi. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare 50 mL di soluzione intracellulare contenente 160 mM di KF, 10 mM di HEPES, 10 mM di EGTA e 2 mM di MgCl₂. Regolare il pH a 7,2 con 1 M di soluzione KOH e regolare la pressione osmotica a 300 mOsm con D-saccarosio^13,16. Conservare a -20 °C.
2. Preparare 50 mL di tampone MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting) contenente lo 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) e 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in PBS.
3. Preparare la poli-L-lisina (PLL) in acqua con diluizione 1:1000.
   NOTA: I vetrini coprioggetti devono essere rivestiti con PLL il giorno prima dell'esperimento. Incubare le barbottine rivestite a 37 °C per una notte. Riciclare il PLL il secondo giorno e asciugare le barbottine rivestite a 37 °C.

2. Preparazione di sospensioni unicellulari da tessuto cerebrale

1. Anestetizzare i topi con idrato di cloralio al 2,5% (0,15 ml/10 g, i.p.) (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). La scomparsa del riflesso corneale e del riflesso del dolore pizzicando le dita dei piedi o pizzicando la pelle nei topi conferma l'anestesia profonda. Posiziona gli animali supini su un tavolo da dissezione e appunta i loro arti.
   1. Esporre il torace e perfondere il cuore¹⁷ con PBS sterile ghiacciato per rimuovere le cellule del sangue circolanti intravascolari. Tieni la testa e taglia la pelle lungo la linea mediana del cervello con le forbici per esporre il cranio.
   2. Taglia la parte posteriore del cranio bilateralmente e tra le orbite con piccole forbici. Taglia il cranio lungo la sutura sagittale e rimuovi il cranio con una pinzetta. Estrarre rapidamente il tessuto cerebrale con una pinzetta¹⁷.
2. Posizionare il tessuto cerebrale in piastre di coltura di 10 cm contenenti PBS ghiacciato. Sezionare la corteccia cerebrale bilateralmente con una pinzetta, isolare il tessuto ippocampale e tagliarlo in pezzi più piccoli. Trasferire i pezzi in una provetta da centrifuga da 15 mL.
   NOTA: La dissezione bilaterale della corteccia cerebrale rivela la mezzaluna di tessuto ippocampale in entrambi gli emisferi del cervello.
3. Risospendere i piccoli pezzi di tessuto ippocampale in 2 ml di soluzione salina bilanciata di Hank ghiacciata (HBSS) e centrifugare a 300 × g per 3 minuti (a temperatura ambiente), quindi scartare l'HBSS.
4. Aggiungere 1950 μl di miscela enzimatica 1 alla provetta da centrifuga da 15 mL contenente i pezzi di tessuto ippocampale. Agitare continuamente la provetta da centrifuga a bagnomaria a 37 °C per 5 minuti.
   NOTA: La miscela enzimatica 1 è una combinazione di 50 μl di enzima P e 1900 μl di tampone Y, preriscaldato a 37 °C (presente come parte del kit disponibile in commercio, vedere la tabella dei materiali).
5. Rimuovere la provetta da centrifuga dal bagnomaria. Aggiungere 30 μl di miscela enzimatica 2 appena preparata nella provetta da centrifuga da 15 mL. Pipettare i frammenti di tessuto su e giù 20 volte con un puntale da 1 mL e incubare a bagnomaria per 5 minuti agitando continuamente a 37°C.
   NOTA: La miscela enzimatica 2 è una combinazione di 20 μl di tampone Y e 10 μl di enzima A. Le due fasi di digestione precedenti convertono il tessuto cerebrale in una sospensione cellulare. Il tempo di digestione totale non deve superare i 15 minuti.
6. Rimuovere la provetta da centrifuga e pipettare la sospensione su e giù più volte con una pipetta da 1 ml fino a quando non rimangono più pezzi di tessuto di grandi dimensioni.
7. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro di screening cellulare da 70 μm e raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga pulita da 50 mL.
   NOTA: Questo passaggio rimuove tutti i pezzi di tessuto non digerito di grandi dimensioni.
8. Trasferire il filtrato in una nuova provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a 4 °C, 300 × g per 10 minuti. Eliminare il surnatante con una pipetta da 1 mL.
9. Lavare la sospensione cellulare pipettandola su e giù 20 volte con 15 mL di HBSS e centrifugare a 4 °C, 300 × g per 10 minuti. Eliminare il surnatante e
   risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone MACS.
   NOTA: Questo passaggio fornisce la sospensione a cellula singola utilizzata negli esperimenti successivi.

3. Separazione acuta delle microglia

1. Trasferire 1 mL di sospensione monocellulare in una provetta da microcentrifuga da 2 mL e centrifugare a 4 °C, 300 × g per 3 min. Scartare il surnatante.
2. Risospendere il pellet a cella singola in 90 μl di tampone MACS. Aggiungere 10 μl di microsfere CD11b/c e incubare la sospensione a 4 °C per 15 minuti su un agitatore orizzontale.
3. Posizionare la colonna di smistamento nel campo magnetico di un separatore MACS adatto e inumidire la colonna due volte con 500 μL di tampone MACS.
4. Lavare la sospensione a cellula singola aggiungendo 1 mL di tampone MACS direttamente nella provetta e centrifugare a 4 °C, 300 × g per 3 minuti. Aspirare completamente il surnatante.
5. Risospendere il pellet della cella in 500 μL di tampone MACS.
6. Trasferire la sospensione di cellule risospese nella colonna di smistamento nel campo magnetico utilizzando una pipetta da 1 mL. Scartare il flusso. Lavare la colonna tre volte con 500 μL di tampone MACS mentre rimane nel campo magnetico.
   NOTA: Il flusso continuo contiene celle non etichettate. La colonna deve essere lavata senza rimuoverla dal campo magnetico.
7. Rimuovere la colonna di smistamento dal campo magnetico. Aggiungere 1 mL di tampone MACS alla colonna e spingerlo lentamente con il pistone. Raccogli il flusso.
   NOTA: Il flusso contiene le cellule marcate (cioè la microglia). Per migliorare la purezza della microglia, il processo può essere ripetuto con una nuova colonna di selezione (opzionale).
8. Seminare le cellule selezionate in una piastra a 24 pozzetti contenente un vetrino coprioggetti rivestito di PLL. Aggiungere 200 μl di terreno di coltura e incubare per 20 minuti in un incubatore a 37 °C con il 95% di O₂, il 5% di CO₂ e il 60%-80% di umidità. Questo passaggio consente alla microglia di attaccarsi al vetrino coprioggetti per successivi esperimenti di patch-clamp e immunofluorescenza su cellule intere.

4. Immunofluorescenza

1. Aspirare il terreno di coltura dai pozzetti della piastra e sciacquare le cellule tre volte con 0,1 M di PBS sull'agitatore.
2. Scartare il PBS e fissare la microglia sul vetrino coprioggetti con paraformaldeide al 4% (PFA) per 20 minuti a temperatura ambiente (RT).
3. Rimuovere il fissativo e sciacquare il vetrino coprioggetto tre volte con 0,1 M PBS.
4. Scartare il PBS e permeabilizzare le cellule con 200 μL di tampone bloccante contenente lo 0,2% di Triton X-100 e il 5% di BSA in PBS per 1 ora a RT sull'agitatore.
5. Incubare la microglia con tampone bloccante e anticorpi primari anti-Iba1 e anti-CD11b¹⁸ per una notte a 4 °C.
6. Il giorno successivo, rimuovere gli anticorpi primari e sciacquare il vetrino coprioggetti tre volte con PBS a RT sullo shaker.
7. Incubare la microglia con il tampone bloccante contenente anticorpi secondari accoppiati a fluorofori per 2 ore a RT. Aggiungere il colorante DAPI per gli ultimi 15 minuti di incubazione.
8. Rimuovere gli anticorpi secondari e sciacquare il vetrino coprioggetto tre volte con PBS. Montare i vetrini coprioggetto sui vetrini del microscopio per l'imaging.

5. Registrazione patch-clamp su cellule intere delle correnti di potassio nelle microglia

1. Scongelare la soluzione intracellulare e mantenerla in ghiaccio.
2. Estrarre le pipette patch (elettrodi) dai capillari in vetro borosilicato a parete sottile utilizzando un estrattore verticale¹⁷.
   NOTA: La resistenza dell'elettrodo deve essere inferiore a 10 MΩ.
3. Trasferire un vetrino coprioggetti nella camera di registrazione e aggiungere la soluzione extracellulare contenente 160 mM di NaCl, 4,5 mM di KCl, 2 mM di CaCl₂, 1 mM di MgCl₂ e 10 mM di HEPES. Regolare il pH a 7,2 con una soluzione di NaOH 1 M prima dell'uso^13,16 e regolare la pressione osmotica a 300 mOsm con D-saccarosio.
4. Localizzare la microglia sferica al microscopio ad acqua utilizzando l'obiettivo 40x.
5. Riempire l'elettrodo con la soluzione intracellulare, collegarlo allo stadio di testa dell'amplificatore della configurazione di elettrofisiologia e applicare una pressione positiva. Passa all'obiettivo 4x e individua l'elettrodo.
   1. Abbassare l'elettrodo nella soluzione del bagno e impostare l'amplificatore in modalità voltage-clamp per eseguire il test della membrana in modalità bagno . Torna all'obiettivo 40x e avvicina la punta dell'elettrodo alla microglia.
      NOTA: Quando la punta dell'elettrodo è molto vicina a una cellula microgliale, la resistenza dovrebbe aumentare leggermente.
   2. Applicare una piccola pressione negativa per trattenere la cella. Quando la resistenza raggiunge i 100 MΩ, passare dalla modalità bagno a quella patch nel test della membrana. Quando la resistenza raggiunge i 300 MΩ, rilasciare la pressione negativa.
   3. Quando la resistenza indica la formazione di un sigillo gigaohm (cioè >1 GΩ) tra l'elettrodo e la membrana microgliale, passare dalla modalità patch a quella cella nel test della membrana.
6. Applicare una piccola quantità di aspirazione e avviare una scossa elettrica per rompere la membrana. La comparsa di grandi transienti capacitivi indica la rottura riuscita della membrana.
7. Passare alla modalità voltage-clamp e aprire il programma di registrazione. Registra correnti di potassio per 200 ms. Per testare i potenziali, applicare incrementi di tensione con incrementi di 20 mV da -120 mV a +40 mV a 1 Hz.
8. Analizza i dati ottenuti offline utilizzando un software appropriato.

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Risultati

In breve, il processo prevede l'isolamento della microglia ippocampale dal cervello del topo adulto, seguita dalla registrazione di queste cellule con patch-clamp a cellula intera (Figura 1). La procedura inizia con la dissezione dell'ippocampo di topi adulti C57BL/6J di età compresa tra 3 e 5 mesi. In particolare, l'intero cervello viene rimosso dopo la perfusione e posto in una piastra di coltura contenente PBS ghiacciato (Figura 2A

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Discussione

Le microglia coltivate da topi fetali o neonati sono chiaramente inadatte per lo studio delle microglia adulte. Inoltre, data l'eterogeneità delle microglia in diverse aree cerebrali²¹, le microglia isolate dall'intero cervello potrebbero non rappresentare accuratamente le caratteristiche delle microglia in una specifica struttura cerebrale. Questo protocollo fornisce un metodo per isolare la microglia ippocampale in modo specifico per valutare le proprietà elet...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Corning	353003
15 mL Falcon tubes	BD	352096
24-well plates	BD	353047
35 mm Petri dish	Corning	353001	-
50 mL Falcon tubes	BD	352070
70 μm cell screening	Miltenyi	130-095-823	To remove cell clumps before cell sorting
Adult Mouse Brain Dissociation Kit	Miltenyi	130- 107-677
Anti-CD11b Antibody	Bio-Rad	MCA74	Goat Anti-mouse IgG also available. For blocking endogenous immunoglobulins.
Anti-Iba 1 Antibody	SYSY	234308	Goat Anti-guinea pig IgG) also available. For blocking endogenous immunoglobulins.
Axon Digidata 1440A	USA
Axon MultiClamp 700B Amplifier	USA
BSA Albumin Fraction V	BioFrox	4240GR500	Serum
C57BL/6 mice	Guangdong Medical Laboratory Animal Center
CD11 b/c MicroBeads	Miltenyi	130-105-634
Chloral hydrate	Absin	abs47051394	Widely used as anesthesia in mice
Clampfit 10.6	USA
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 800
Culture medium	Fisher Scientific	C11995500BT	-
DAPI dye	Beyotime	C1002
Electrode puller	Narishige	PC-10
HBSS	Servicebio	G4203
Horizontal shaker	SCILOGEX	SLK-O3000-S
Image analysis software	Fiji
MACS Columns	Miltenyi	130-042-201
MACS Separators	Miltenyi	130-042-102
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	T353-500	Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4.
Poly-L-lysine	Beyotime	C0313	Coverslip coating
Triton X-100	Sigma	X100