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Method Article
Questo protocollo spiega come misurare l'effetto della variazione genetica associata ai disturbi dello sviluppo neurologico sull'attività dell'enzima deubiquitilante combinando la purificazione di proteine ricombinanti con saggi di scissione della catena dell'ubiquitina.
I disturbi del neurosviluppo (NDD) sono associati a menomazioni della funzione del sistema nervoso, ma spesso rimangono poco compresi a livello molecolare. I disturbi discreti causati da singoli geni forniscono modelli per studiare i meccanismi che guidano lo sviluppo neurologico atipico. Varianti di geni che codificano per proteine della famiglia degli enzimi deubiquitilanti (DUB) sono associate a diverse NDD, ma è necessario determinare i meccanismi patogenetici dei disturbi guidati da queste varianti geniche. L'impatto delle varianti geniche sull'attività del DUB può essere determinato sperimentalmente utilizzando un saggio di scissione dell'ubiquitina in vitro indipendente dal substrato. Questo test non richiede la conoscenza dei substrati a valle per misurare direttamente l'attività catalitica. Qui, il protocollo per determinare l'impatto delle varianti geniche sull'attività enzimatica è modellato utilizzando la proteasi specifica per l'ubiquitina DUB 27, legata all'X (USP27X), che è mutata nella disabilità intellettiva legata all'X 105 (XLID105). Questa pipeline sperimentale può essere utilizzata per chiarire i meccanismi alla base dei disturbi dello sviluppo neurologico guidati da varianti nei geni DUB.
I disturbi del neurosviluppo (NDD) derivano da diverse eziologie con determinanti ambientali o genetici che guidano lo sviluppo atipicodel sistema nervoso 1. I test genetici di sequenziamento di nuova generazione hanno collegato un numero crescente di varianti nei geni correlati al sistema dell'ubiquitina con le NDD genetiche2. Il sistema dell'ubiquitina catalizza la legatura del piccolo modificatore proteico ubiquitina principalmente ai residui di lisina nei substrati proteici per guidare i cambiamenti nel comportamento cellulare, tra cui la localizzazione, la stabilità, le interazioni proteina-proteina o l'attività3. L'ubiquitinazione è mediata dagli enzimi E1 attivante, E2 coniugato e E3 ligasi4 ed è reversibile dall'attività degli enzimi deubiquitilanti (DUB) che catalizzano la scissione e la rimozione dell'ubiquitina dai substrati proteici5. L'ubiquitina può essere legata al substrato come monomero (monoubiquitinazione) o catene polimeriche (poliubiquitinazione) che si formano su uno qualsiasi dei sette residui di lisina (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) o il residuo M1 dell'ubiquitina. Queste diverse topologie di catena dell'ubiquitina e le loro combinazioni creano un codice cellulare che è la chiave per la trasduzione del segnale6.
DUB come USP27X, USP7, USP9X, USP48, STAMBP, OTUD4, OTUD6B e OTUD5 sono stati associati a NDD 2,7,8,9,10,11. Per la maggior parte delle NDD, i meccanismi molecolari che guidano la patogenesi rimangono sperimentalmente indefiniti. Alcuni dei DUB che guidano i disturbi descritti di recente sono scarsamente conosciuti e mancano di letture cellulari note che possono essere utilizzate per valutare l'impatto della variazione genetica sulla funzione delle proteine. In vitro, i saggi di scissione della catena dell'ubiquitina superano questa limitazione in quanto l'attività DUB indipendente dal substrato può misurare l'impatto delle varianti geniche sull'attività enzimatica12.
I saggi in vitro per la scissione dell'ubiquitina sono stati utilizzati dagli anni '80. Questi saggi con substrati radiomarcati hanno permesso la scoperta dei primi DUB, tra cui l'isopeptidasi, identificata per la sua capacità di deubiquitilare l'istone H2A13, e l'ubiquitina carbossil-terminale idrolasi (UCH), identificata per la sua capacità di idrolizzare l'ubiquitina da una varietà di coniugati chimici 14,15,16. Inoltre, sono state utilizzate proteine o peptidi poliubiquitilati radiomarcati a lunghezza intera per identificare l'isopeptidasi T e diverse UCH e proteasi specifiche per l'ubiquitina (UBP) da eritrociti e muscolo scheletrico, rispettivamente 17,18,19,20. Le catene di ubiquitina di lunghezza e tipo di legame definite (tetra-ubiquitina legata a K48) sono state utilizzate per la prima volta per misurare l'attività DUB dell'isopeptidasi T21. Da allora, questo test è diventato il gold standard per misurare l'attività del DUB nelle analisi mutazionali22,23. Il perfezionamento di questo test consente attualmente la visualizzazione della scissione dell'ubiquitina tramite elettroforesi e colorazioni di gel convenzionali come il blu Coomassie, l'arancione SYPRO, la colorazione di rubino e argento o la rilevazione fluorescente o basata sull'immunoblotting12,24. Gli aspetti molecolari dell'attività del DUB, come la lunghezza minima della catena e la specificità del linkage 25,26,27,28, possono essere chiariti utilizzando catene di ubiquitina di diverse lunghezze (ad esempio, di-, tri-, tetra-ubiquitina) e linkage (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63, lineare) in saggi funzionali. Le varianti associate a NDD possono determinare difetti di attività DUB specifici del tipo di collegamento della catena dell'ubiquitina11.
Un saggio di scissione della di-ubiquitina che utilizza proteine DUB ricombinanti purificate può misurare direttamente l'impatto delle varianti NDD sull'attività DUB. USP27X, che è mutato nel disturbo da disabilità intellettiva legato all'X NDD 105 (XLID105)7,28, modella il processo qui presentato. Questo approccio consente di determinare come l'attività del DUB sia interrotta da varianti geniche in NDD associati a DUB esistenti e sconosciuti.
Il seguente protocollo può essere adattato per le proteine ricombinanti utilizzando vari tag di affinità espressi in diversi ceppi di cellule competenti. A seconda della proteina espressa, le condizioni di coltura e di espressione notturna possono richiedere l'ottimizzazione dell'OD600 all'induzione dell'espressione, al tempo di espressione, alla temperatura di espressione e alla concentrazione di IPTG. Una panoramica del protocollo è illustrata nella Figura 1. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Trasformazione di cellule competenti di E. coli di Rosetta 2 con il plasmide ricombinante di espressione GST-USP27X
NOTA: Per mantenere la sterilità della coltura batterica, eseguire i passaggi in cui i contenitori dei terreni sono aperti sotto la fiamma di un bruciatore Bunsen. Per consentire un trasferimento ottimale dell'ossigeno, eseguire l'agitazione della coltura batterica in un agitatore da banco a temperatura controllata con un'orbita da 19 mm a 50 mm e una velocità di 200 giri/min29.
2. Espressione batterica notturna di proteine ricombinanti da plasmidi di espressione
NOTE: Per mantenere la sterilità della coltura batterica, eseguire i passaggi in cui i contenitori dei terreni sono aperti sotto la fiamma di un bruciatore Bunsen. Per consentire un trasferimento ottimale dell'ossigeno, eseguire l'agitazione della coltura batterica in un agitatore da banco a temperatura controllata con un'orbita da 19 mm a 50 mm e una velocità di 200 giri/min29. Misurare la coltura OD600 utilizzando uno spettrofotometro.
3. Purificazione delle proteine mediante colonna di affinità gravità-flusso
NOTA: La resina, il legame, il lavaggio, l'eluizione e i tamponi di conservazione appropriati per ogni purificazione dipenderanno dalla proteina ricombinante da purificare. Raccogli campioni dal pellet cellulare, dal surnatante, dal flusso, dalle frazioni di lavaggio e dalle frazioni di eluizione nel tampone SDS-PAGE. Eseguire la colorazione SDS-PAGE e Coomassie per i campioni per valutare il successo della purificazione. Eseguire la purificazione a 4 °C e maneggiare le frazioni con ghiaccio. La scissione delle etichette proteiche può essere eseguita all'interno o all'esterno della colonna utilizzando la proteasi appropriata per colpire il sito di scissione specifico della proteasi pertinente.
4. Saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina
NOTA: Selezionare la lunghezza della catena dell'ubiquitina e i tipi di legame in base alla specificità del DUB descritta nei rapporti precedenti31 o determinata empiricamente. Se necessario, questo protocollo potrebbe essere utilizzato per testare l'attività del DUB wild-type di interesse su un pannello di catene di ubiquitina disponibili in commercio di lunghezza e tipo di legame definiti. Una quantità di catena di di-ubiquitina di 375-750 ng e una concentrazione di DUB di 1-2 μM possono essere utilizzati come punti di partenza per il test27.
Figura 1: Schema del disegno dello studio. (A) Trasformazione di cellule di E. coli competenti con plasmide di espressione proteica ricombinante. (B) Espressione batterica notturna della proteina deubiquitilasi ricombinante. (C) Purificazione proteica della deubiquitilasi ricombinante utilizzando una colonna di affinità a flusso gravitazionale. (D) Saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina per valutare l'attività deubiquitilante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per determinare l'impatto delle varianti associate a XLID105 sull'attività catalitica di USP27X, le proteine USP27X wild-type marcate con GST e le varianti associate a XLID105 F313V, Y381H e S404N USP27X sono state purificate dai batteri. Queste varianti si trovano all'interno del dominio catalitico USP di USP27X (Figura 2A). Poiché in precedenza era stato riportato che USP27X scindeva le catene di ubiquitina K6331, le proteine USP2...
Questo articolo presenta un protocollo per l'espressione e la purificazione di DUB USP27X ricombinanti e un saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina per confrontare l'attività deubiquitilante di USP27X wild-type e proteine varianti associate a NDD. Questo test ha determinato che le varianti associate a XLID105 interrompono l'attività catalitica di USP27X7. Questa intuizione meccanicistica ci ha aiutato a definire XLID105 come un disturb...
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Questo lavoro è stato finanziato dai fondi di avvio di Sanford Research a FB e dalla sovvenzione NIH R01CA233700 a MJS. L'artwork è stato realizzato da Felipe G. Serrano (www.illustrative-science.com). Ringraziamo il Dr. Greg Findlay (Università di Dundee) per il plasmide GST-USP27X.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amersham Protran 0.45 NC 200 mm × 200 mm 25/PK | Cytiva | 10600041 | |
Ammonium sulfate | Fisher Scientific | AC205872500 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 25 | |
Anti- Ubiquitin (Mouse monoclonal) | Biolegend | Cat# 646302, RRID:AB_1659269 | (WB: 1:1000) |
Anti-GST (Sheep polyclonal) | MRC-PPU Reagents and Services | Cat# S902A Third bleed | (WB: 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/ |
Baffled Culture Flasks 2 L | Fisher Scientific | 10-042-5N | |
Bradford Reagent | Millipore Sigma | B6916-500ML | |
Chloramphenicol | Gold Biotechnology | C-105-25 | |
Complete, Protease Inhibitor tablets | Millipore Sigma | 5056489001 | |
Econo-Column 1.5 × 5 cm | Bio-Rad | 7371507 | |
Eppendorf ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
Excel | Microsoft | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
Glycerol | Genesee Scientific | 18-205 | |
Illustrator | Adobe | https://www.adobe.com/products/illustrator.html | |
Image Studio | LI-COR Biosciences | https://www.licor.com/bio/image-studio/ | |
Inkscape | Inkscape | https://inkscape.org/ | |
Invitrogen 4-12% NuPAGE 1mm 12 well gel | Thermo Fisher Scientific | NP0322BOX | |
IPTG (Isopropyl-b-D-Thiogalactopyranoside) | Genesee Scientific | 20-109 | |
IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG Secondary Antibody | LI-COR Biosciences | Cat# 926-32214 | (WB: 1:10000) |
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR Biosciences | Cat# 926-32212 | (WB: 1:10000) |
Isotemp Digital Dry Bath | Fisher Scientific | 88860022 | |
K63 Di-Ubiquitin | South Bay Bio LLC | SBB-UP0072 | |
LB Agar | Genesee Scientific | 11-119 | |
LB Broth | Genesee Scientific | 11-118 | |
Lysozyme | Gold Biotechnology | L-040-100 | |
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000-7 | |
MES-SDS Running Buffer | Boston Bioproducts Inc | BP-177 | |
Mini Tube Rotator | Fisher Scientific | 88-861-051 | |
NuPage LDS Sample buffer 4x | Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
Odyssey Fc Imager | LI-COR Biosciences | 43214 | |
PageRuler Plus Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26620 | |
pGEX6P1 human USP27X | MRC-PPU Reagents and Services | DU21193 | https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/ |
pGEX6P1 human USP27X F313V | Addgene | 225715 | Koch et at 2024 (PMID: 38182161) |
pGEX6P1 human USP27X S404N | Addgene | 225717 | Koch et at 2024 (PMID: 38182161) |
pGEX6P1 human USP27X Y381H | Addgene | 225716 | Koch et at 2024 (PMID: 38182161) |
Pierce Glutathione Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16100 | |
PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride) | Gold Biotechnology | P-470-10 | |
Polysorbate 20 (Tween 20) | Fisher Scientific | AC233360010 | |
Rosetta 2 Competent Cells | Millipore Sigma | 71402-M | |
SimplyBlue SafeStain | Thermo Fisher Scientific | LC6060 | |
SmartSpec 3000 | Bio-Rad | 170-2501 | |
SOC medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
Sodium chloride | Genesee Scientific | 18-216 | |
Sonifier 250 | Branson | 100-132-135 | |
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46910 | |
TCEP (Tris-(carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Gold Biotechnology | TCEP10 | |
Terrific Broth Powder | Genesee Scientific | 18-225 | |
Tris Base | Genesee Scientific | 18-146 | |
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module | Thermo Fisher Scientific | EI0002 |
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