Misurazione dell'attività enzimatica degli enzimi deubiquitilanti associati a disturbi dello sviluppo neurologico tramite un saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina

Riepilogo

Questo protocollo spiega come misurare l'effetto della variazione genetica associata ai disturbi dello sviluppo neurologico sull'attività dell'enzima deubiquitilante combinando la purificazione di proteine ricombinanti con saggi di scissione della catena dell'ubiquitina.

Abstract

I disturbi del neurosviluppo (NDD) sono associati a menomazioni della funzione del sistema nervoso, ma spesso rimangono poco compresi a livello molecolare. I disturbi discreti causati da singoli geni forniscono modelli per studiare i meccanismi che guidano lo sviluppo neurologico atipico. Varianti di geni che codificano per proteine della famiglia degli enzimi deubiquitilanti (DUB) sono associate a diverse NDD, ma è necessario determinare i meccanismi patogenetici dei disturbi guidati da queste varianti geniche. L'impatto delle varianti geniche sull'attività del DUB può essere determinato sperimentalmente utilizzando un saggio di scissione dell'ubiquitina in vitro indipendente dal substrato. Questo test non richiede la conoscenza dei substrati a valle per misurare direttamente l'attività catalitica. Qui, il protocollo per determinare l'impatto delle varianti geniche sull'attività enzimatica è modellato utilizzando la proteasi specifica per l'ubiquitina DUB 27, legata all'X (USP27X), che è mutata nella disabilità intellettiva legata all'X 105 (XLID105). Questa pipeline sperimentale può essere utilizzata per chiarire i meccanismi alla base dei disturbi dello sviluppo neurologico guidati da varianti nei geni DUB.

Introduzione

I disturbi del neurosviluppo (NDD) derivano da diverse eziologie con determinanti ambientali o genetici che guidano lo sviluppo atipico^del sistema nervoso 1. I test genetici di sequenziamento di nuova generazione hanno collegato un numero crescente di varianti nei geni correlati al sistema dell'ubiquitina con le NDD genetiche². Il sistema dell'ubiquitina catalizza la legatura del piccolo modificatore proteico ubiquitina principalmente ai residui di lisina nei substrati proteici per guidare i cambiamenti nel comportamento cellulare, tra cui la localizzazione, la stabilità, le interazioni proteina-proteina o l'attività³. L'ubiquitinazione è mediata dagli enzimi E1 attivante, E2 coniugato e E3 ligasi⁴ ed è reversibile dall'attività degli enzimi deubiquitilanti (DUB) che catalizzano la scissione e la rimozione dell'ubiquitina dai substrati proteici⁵. L'ubiquitina può essere legata al substrato come monomero (monoubiquitinazione) o catene polimeriche (poliubiquitinazione) che si formano su uno qualsiasi dei sette residui di lisina (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) o il residuo M1 dell'ubiquitina. Queste diverse topologie di catena dell'ubiquitina e le loro combinazioni creano un codice cellulare che è la chiave per la trasduzione del segnale⁶.

DUB come USP27X, USP7, USP9X, USP48, STAMBP, OTUD4, OTUD6B e OTUD5 sono stati associati a NDD 2,7,8,9,10,11. Per la maggior parte delle NDD, i meccanismi molecolari che guidano la patogenesi rimangono sperimentalmente indefiniti. Alcuni dei DUB che guidano i disturbi descritti di recente sono scarsamente conosciuti e mancano di letture cellulari note che possono essere utilizzate per valutare l'impatto della variazione genetica sulla funzione delle proteine. In vitro, i saggi di scissione della catena dell'ubiquitina superano questa limitazione in quanto l'attività DUB indipendente dal substrato può misurare l'impatto delle varianti geniche sull'attività enzimatica¹².

I saggi in vitro per la scissione dell'ubiquitina sono stati utilizzati dagli anni '80. Questi saggi con substrati radiomarcati hanno permesso la scoperta dei primi DUB, tra cui l'isopeptidasi, identificata per la sua capacità di deubiquitilare l'istone H2A¹³, e l'ubiquitina carbossil-terminale idrolasi (UCH), identificata per la sua capacità di idrolizzare l'ubiquitina da una varietà di coniugati chimici 14,15,16. Inoltre, sono state utilizzate proteine o peptidi poliubiquitilati radiomarcati a lunghezza intera per identificare l'isopeptidasi T e diverse UCH e proteasi specifiche per l'ubiquitina (UBP) da eritrociti e muscolo scheletrico, rispettivamente 17,18,19,20. Le catene di ubiquitina di lunghezza e tipo di legame definite (tetra-ubiquitina legata a K48) sono state utilizzate per la prima volta per misurare l'attività DUB dell'isopeptidasi T²¹. Da allora, questo test è diventato il gold standard per misurare l'attività del DUB nelle analisi mutazionali^22,23. Il perfezionamento di questo test consente attualmente la visualizzazione della scissione dell'ubiquitina tramite elettroforesi e colorazioni di gel convenzionali come il blu Coomassie, l'arancione SYPRO, la colorazione di rubino e argento o la rilevazione fluorescente o basata sull'immunoblotting^12,24. Gli aspetti molecolari dell'attività del DUB, come la lunghezza minima della catena e la specificità del linkage 25,26,27,28, possono essere chiariti utilizzando catene di ubiquitina di diverse lunghezze (ad esempio, di-, tri-, tetra-ubiquitina) e linkage (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63, lineare) in saggi funzionali. Le varianti associate a NDD possono determinare difetti di attività DUB specifici del tipo di collegamento della catena dell'ubiquitina¹¹.

Un saggio di scissione della di-ubiquitina che utilizza proteine DUB ricombinanti purificate può misurare direttamente l'impatto delle varianti NDD sull'attività DUB. USP27X, che è mutato nel disturbo da disabilità intellettiva legato all'X NDD 105 (XLID105)^7,28, modella il processo qui presentato. Questo approccio consente di determinare come l'attività del DUB sia interrotta da varianti geniche in NDD associati a DUB esistenti e sconosciuti.

Protocollo

Il seguente protocollo può essere adattato per le proteine ricombinanti utilizzando vari tag di affinità espressi in diversi ceppi di cellule competenti. A seconda della proteina espressa, le condizioni di coltura e di espressione notturna possono richiedere l'ottimizzazione dell'OD₆₀₀ all'induzione dell'espressione, al tempo di espressione, alla temperatura di espressione e alla concentrazione di IPTG. Una panoramica del protocollo è illustrata nella Figura 1. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Trasformazione di cellule competenti di E. coli di Rosetta 2 con il plasmide ricombinante di espressione GST-USP27X

NOTA: Per mantenere la sterilità della coltura batterica, eseguire i passaggi in cui i contenitori dei terreni sono aperti sotto la fiamma di un bruciatore Bunsen. Per consentire un trasferimento ottimale dell'ossigeno, eseguire l'agitazione della coltura batterica in un agitatore da banco a temperatura controllata con un'orbita da 19 mm a 50 mm e una velocità di 200 giri/min²⁹.

1. Scongelare 20 μl di cellule di Rosetta 2 coli chimicamente competenti su ghiaccio immediatamente prima dell'uso. Aggiungere 1-10 ng del plasmide di espressione pGEX6P1-USP27X (codificante per USP27X marcato con glutatione-S-transferasi N-terminale (GST)³⁰ e contenente resistenza all'ampicillina) e incubare 5 minuti su ghiaccio.
2. Shock termico per 30 s a 42 °C in bagno asciutto. Incubare con ghiaccio per 2 min.
3. Aggiungere 80 μl di terreno SOC a temperatura ambiente (RT). Incubare per 60 minuti a 37 °C con rotazione di 200 giri/min in un agitatore da banco con orbita da 19 mm a temperatura controllata.
4. Piastra 50 μL di coltura su una piastra di agar LB integrata con 25 μg/L di cloramfenicolo e 50 μg/L di ampicillina. Incubare per 20 ore a 37 °C con il coperchio rivolto verso il basso in un incubatore a temperatura controllata.

2. Espressione batterica notturna di proteine ricombinanti da plasmidi di espressione

NOTE: Per mantenere la sterilità della coltura batterica, eseguire i passaggi in cui i contenitori dei terreni sono aperti sotto la fiamma di un bruciatore Bunsen. Per consentire un trasferimento ottimale dell'ossigeno, eseguire l'agitazione della coltura batterica in un agitatore da banco a temperatura controllata con un'orbita da 19 mm a 50 mm e una velocità di 200 giri/min²⁹. Misurare la coltura OD₆₀₀ utilizzando uno spettrofotometro.

1. Preparare 1 L di Terrific Broth (TB) aggiungendo 47,6 g di TB Powder a 1 L di acqua ultrapura con glicerolo allo 0,4% in un pallone di coltura da 2 L. Autoclavare a medio per 30 minuti e raffreddare a RT.
2. Prelevare una singola colonia di batteri trasformati e aggiungerla a 10 ml di terreno sterile LB integrato con 25 μg/L di cloramfenicolo e 50 μg/L di ampicillina. Incubare per 20 ore a 37 °C con rotazione di 200 giri/min in un agitatore da banco da 19 mm con orbita a temperatura controllata.
3. Aggiungere 10 ml di coltura notturna a 1 litro di terreno TB integrato con 25 μg/L di cloramfenicolo e 50 μg/L di ampicillina (rapporto 1:100 tra coltura di partenza e coltura di espressione). Incubare a 37 °C con rotazione di 200 giri/min in un agitatore da banco con orbita di 19 mm a temperatura controllata fino a quando la coltura OD₆₀₀ è compresa tra 0,5 e 0,6.
4. Aggiungere 50 μM di IPTG alla coltura per indurre l'espressione, raffreddare a 16 °C e incubare per 20 ore a 16 °C con una rotazione di 200 giri/min.
5. Cellule in pellet provenienti da coltura di espressione mediante centrifugazione per 20 minuti a ≥3.000 x g e 4 °C. Conservare il pellet a -80 °C per almeno 1 ora.
   NOTA: A questo punto, l'esperimento può essere messo in pausa e riavviato in un secondo momento (preferibilmente la stessa settimana). Il pellet può essere conservato a lungo termine a -80 °C.

3. Purificazione delle proteine mediante colonna di affinità gravità-flusso

NOTA: La resina, il legame, il lavaggio, l'eluizione e i tamponi di conservazione appropriati per ogni purificazione dipenderanno dalla proteina ricombinante da purificare. Raccogli campioni dal pellet cellulare, dal surnatante, dal flusso, dalle frazioni di lavaggio e dalle frazioni di eluizione nel tampone SDS-PAGE. Eseguire la colorazione SDS-PAGE e Coomassie per i campioni per valutare il successo della purificazione. Eseguire la purificazione a 4 °C e maneggiare le frazioni con ghiaccio. La scissione delle etichette proteiche può essere eseguita all'interno o all'esterno della colonna utilizzando la proteasi appropriata per colpire il sito di scissione specifico della proteasi pertinente.

1. Fissare la colonna di flusso a gravità vuota nel supporto della storta e riempirla con resina di glutatione agarosio. Utilizzare 2-3 mL di resina per purificare un pellet cellulare raccolto da 1 L di coltura di espressione.
2. Lavare la colonna con un volume di letto di resina al 20% di etanolo. Lavare la colonna 3 volte con un volume di letto di resina di tampone MS500 (20 mM di Tris pH 7,5, 500 mM di NaCl, 0,5 mM di TCEP). Arrestare la colonna in modo che la resina rimanga ricoperta di tampone per evitare che si secchi durante la preparazione del pellet della cella.
3. Scongelare il pellet della cella a 4 °C. Aggiungere 30 mL di tampone MS500 (20 mM di Tris pH 7,5, 500 mM di NaCl, 0,5 mM di TCEP, 60 mg di lisozima e una compressa di inibitore della proteasi) al pellet scongelato. Limare per 30 minuti a 4 °C con una leggera rotazione da un capo all'altro.
4. Sonicare le cellule lisate in una provetta da centrifuga da 50 mL o in un becher di metallo su ghiaccio fino a quando il lisato scorre liberamente quando viene erogato da un puntale di pipetta. Centrifugare per 30 minuti a 4 °C e ≥20.000 x g per eliminare il surnatante.
   NOTA: Determinare empiricamente le impostazioni del sonicatore. Impostare il sonicatore in modo tale che 120 s di tempo totale siano sufficienti per ridurre il lisato viscoso a un liquido libero e trasparente.
5. Decantare il surnatante in un becher e caricare il lisato chiarito sulla colonna. Far scorrere il lisato attraverso la colonna mediante il flusso per gravità mentre si raccoglie il flusso. Caricare la colonna con il flusso raccolto ed eseguirla attraverso la colonna.
6. Lavare la colonna con almeno due volumi di letto di resina di tampone di lavaggio MS500 (20 mM di Tris pH 7,5, 500 mM di NaCl, 0,5 mM di TCEP) 5 volte. Raccogliere il flusso di lavaggio in frazioni di 5 mL. Aggiungere 1 μl di ciascuna frazione a 100 μl di reagente Bradford per verificare visivamente la presenza di proteine. Lavare fino a quando le proteine non legate non sono più presenti nell'ultimo lavaggio, aggiungendo ulteriori fasi di lavaggio se necessario.
7. Recuperare la proteina eseguendo il tampone di eluizione MS500 (tampone MS500 integrato con 10 mM di glutatione e 10 mM di NaOH) attraverso la colonna, raccogliendo 5 mL di frazioni di eluizione. Verificare la presenza di proteine aggiungendo 1 μL di eluato a 100 μL di reagente Bradford. Interrompere la raccolta delle frazioni quando il reagente di Bradford non indica più la presenza di proteine.
8. Eseguire lo scambio del tampone mediante precipitazione e centrifugazione. Far precipitare le proteine aggiungendo 2 volumi di 4 M di solfato di ammonio all'eluato, invertendo delicatamente fino a quando non diventa torbido, quindi centrifugando per 30 minuti a 4 °C e ≥20.000 x g e di nuovo per altri 5 minuti. Rimuovere il surnatante dopo ogni centrifugazione senza disturbare il pellet proteico.
9. Risciogliere e conservare le proteine in MS500 integrato con glicerolo al 25%. Conservare i pellet proteici o le proteine in un tampone di stoccaggio a -80 °C.

4. Saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina

NOTA: Selezionare la lunghezza della catena dell'ubiquitina e i tipi di legame in base alla specificità del DUB descritta nei rapporti precedenti³¹ o determinata empiricamente. Se necessario, questo protocollo potrebbe essere utilizzato per testare l'attività del DUB wild-type di interesse su un pannello di catene di ubiquitina disponibili in commercio di lunghezza e tipo di legame definiti. Una quantità di catena di di-ubiquitina di 375-750 ng e una concentrazione di DUB di 1-2 μM possono essere utilizzati come punti di partenza per il test²⁷.

1. Preparare 10 tamponi di attivazione DUB (500 mM di Tris-HCl pH 7,5, 500 mM di NaCl e 100 mM di TCEP).
2. Per ogni punto temporale per ogni DUB, preparare 10 μL totali di 2 μM di GST-USP27X purificato in 1x tampone di attivazione DUB (miscela DUB). Prepara i master mix e dividili in punti temporali.
3. Incubare la miscela DUB per 10 minuti a RT.
4. Aggiungere 7 μL di tampone di caricamento SDS-PAGE al tempo 0 prima di aggiungere le catene di ubiquitina per evitare l'avvio della reazione di deubiquitinazione.
5. Per ogni punto temporale per ogni DUB, aggiungere 375 ng di catene di di-ubiquitina K-63 diluite in 10 μL di tampone di attivazione DUB 1x. Il volume totale è di 20 μl per reazione.
6. Incubare le provette a 30 °C, fermando ogni punto temporale con 7 μL di tampone di caricamento SDS-PAGE.
7. Eseguire SDS-PAGE con un gel gradiente al 4%-12% e immunoblot ^7,32 per ubiquitina e USP27X per analizzare la variazione della presenza di mono-ubiquitina in punti temporali selezionati.

Figura 1: Schema del disegno dello studio. (A) Trasformazione di cellule di E. coli competenti con plasmide di espressione proteica ricombinante. (B) Espressione batterica notturna della proteina deubiquitilasi ricombinante. (C) Purificazione proteica della deubiquitilasi ricombinante utilizzando una colonna di affinità a flusso gravitazionale. (D) Saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina per valutare l'attività deubiquitilante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Per determinare l'impatto delle varianti associate a XLID105 sull'attività catalitica di USP27X, le proteine USP27X wild-type marcate con GST e le varianti associate a XLID105 F313V, Y381H e S404N USP27X sono state purificate dai batteri. Queste varianti si trovano all'interno del dominio catalitico USP di USP27X (Figura 2A). Poiché in precedenza era stato riportato che USP27X scindeva le catene di ubiquitina K63³¹, le proteine USP2...

Discussione

Questo articolo presenta un protocollo per l'espressione e la purificazione di DUB USP27X ricombinanti e un saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina per confrontare l'attività deubiquitilante di USP27X wild-type e proteine varianti associate a NDD. Questo test ha determinato che le varianti associate a XLID105 interrompono l'attività catalitica di USP27X⁷. Questa intuizione meccanicistica ci ha aiutato a definire XLID105 come un disturb...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amersham Protran 0.45 NC 200 mm × 200 mm 25/PK	Cytiva	10600041
Ammonium sulfate	Fisher Scientific	AC205872500
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760 25
Anti- Ubiquitin (Mouse monoclonal)	Biolegend	Cat# 646302, RRID:AB_1659269	(WB: 1:1000)
Anti-GST (Sheep polyclonal)	MRC-PPU Reagents and Services	Cat# S902A Third bleed	(WB: 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
Baffled Culture Flasks 2 L	Fisher Scientific	10-042-5N
Bradford Reagent	Millipore Sigma	B6916-500ML
Chloramphenicol	Gold Biotechnology	C-105-25
Complete, Protease Inhibitor tablets	Millipore Sigma	5056489001
Econo-Column 1.5 × 5 cm	Bio-Rad	7371507
Eppendorf ThermoMixer F1.5	Eppendorf	5384000020
Excel	Microsoft		https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
Glycerol	Genesee Scientific	18-205
Illustrator	Adobe		https://www.adobe.com/products/illustrator.html
Image Studio	LI-COR Biosciences		https://www.licor.com/bio/image-studio/
Inkscape	Inkscape		https://inkscape.org/
Invitrogen 4-12% NuPAGE 1mm 12 well gel	Thermo Fisher Scientific	NP0322BOX
IPTG (Isopropyl-b-D-Thiogalactopyranoside)	Genesee Scientific	20-109
IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG Secondary Antibody	LI-COR Biosciences	Cat# 926-32214	(WB: 1:10000)
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR Biosciences	Cat# 926-32212	(WB: 1:10000)
Isotemp Digital Dry Bath	Fisher Scientific	88860022
K63 Di-Ubiquitin	South Bay Bio LLC	SBB-UP0072
LB Agar	Genesee Scientific	11-119
LB Broth	Genesee Scientific	11-118
Lysozyme	Gold Biotechnology	L-040-100
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker	Thermo Fisher Scientific	SHKE4000-7
MES-SDS Running Buffer	Boston Bioproducts Inc	BP-177
Mini Tube Rotator	Fisher Scientific	88-861-051
NuPage LDS Sample buffer 4x	Thermo Fisher Scientific	NP0007
Odyssey Fc Imager	LI-COR Biosciences	43214
PageRuler Plus Ladder	Thermo Fisher Scientific	26620
pGEX6P1 human USP27X	MRC-PPU Reagents and Services	DU21193	https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
pGEX6P1 human USP27X F313V	Addgene	225715	Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
pGEX6P1 human USP27X S404N	Addgene	225717	Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
pGEX6P1 human USP27X Y381H	Addgene	225716	Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
Pierce Glutathione Agarose	Thermo Fisher Scientific	16100
PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride)	Gold Biotechnology	P-470-10
Polysorbate 20 (Tween 20)	Fisher Scientific	AC233360010
Rosetta 2 Competent Cells	Millipore Sigma	71402-M
SimplyBlue SafeStain	Thermo Fisher Scientific	LC6060
SmartSpec 3000	Bio-Rad	170-2501
SOC medium	Thermo Fisher Scientific	15544034
Sodium chloride	Genesee Scientific	18-216
Sonifier 250	Branson	100-132-135
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	46910
TCEP (Tris-(carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Gold Biotechnology	TCEP10
Terrific Broth Powder	Genesee Scientific	18-225
Tris Base	Genesee Scientific	18-146
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module	Thermo Fisher Scientific	EI0002