Sfruttare il potere dei carichi di microRNA in piccole vescicole extracellulari rilasciate da sezioni di cervello umano appena congelate

Riepilogo

Qui, stabiliamo un protocollo che utilizza quantità minime di sezioni di tessuto cerebrale fresco congelate e un metodo di centrifugazione ad alta velocità accessibile accoppiato con la cromatografia ad esclusione dimensionale per ottenere piccole vescicole extracellulari come fonti di biomarcatori di microRNA (miRNA) per disturbi neurologici.

Abstract

Le piccole vescicole extracellulari (sEV) sono mediatori cruciali della comunicazione cellula-cellula, trasportando carichi diversi come proteine, lipidi e acidi nucleici (microRNA, mRNA, DNA). Il carico di microRNA sEV ha una potenziale utilità come potente biomarcatore di malattia non invasivo grazie alla capacità di sEV di attraversare le barriere biologiche (ad esempio, la barriera emato-encefalica) e diventare accessibile attraverso vari fluidi corporei. Nonostante i numerosi studi sui biomarcatori delle sEV nei fluidi corporei, l'identificazione di sottopopolazioni di sEV specifiche per i tessuti o le cellule rimane impegnativa, in particolare dal cervello. Il nostro studio affronta questa sfida adattando i metodi esistenti per isolare le sEV da quantità minime di sezioni di cervello umano congelate utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC).

Dopo l'approvazione etica, circa 250 μg di tessuto cerebrale umano fresco congelato (ottenuto dalla Manchester Brain Bank [UK]) sono stati tagliati dai 3 tessuti donatori e incubati in soluzione di collagenasi di tipo 3/Hibernate-E, con agitazione intermedia, seguita da fasi seriali di centrifugazione e filtrazione. Quindi, le sEV sono state isolate utilizzando il metodo SEC e caratterizzate seguendo le linee guida MISEV. Prima di isolare l'RNA dall'interno di queste sEV, la soluzione è stata trattata con proteinasi-K e RNasi-A per rimuovere qualsiasi RNA extracellulare non sEV. La quantità e la qualità dell'RNA sono state controllate ed elaborate ulteriormente per esperimenti di qPCR e sequenziamento di piccoli RNA.

La presenza di sEV è stata confermata attraverso l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle di fluorescenza (fNTA) e il western blot per i marcatori di superficie (CD9, CD63, CD81). La distribuzione dimensionale (50-200 nm) è stata confermata dalla NTA e dalla microscopia elettronica. La concentrazione totale di RNA all'interno delle sEV lisate variava da 3 a 9 ng/μL ed è stata utilizzata per una quantificazione di successo mediante qPCR per microRNA candidati selezionati. Il sequenziamento di piccoli RNA su MiSeq ha fornito dati di alta qualità (Q >32) con 1,4-5 milioni di letture per campione.

Questo metodo consente l'isolamento e la caratterizzazione efficiente delle sEV da volumi minimi di tessuto cerebrale, facilitando la ricerca non invasiva sui biomarcatori ed è promettente per studi equi sui biomarcatori di malattia, offrendo approfondimenti sulle malattie neurodegenerative e potenzialmente su altri disturbi.

Introduzione

Le vescicole extracellulari (EV) sono uno dei principali attori della comunicazione intercellulare in tutti gli organismi multicellulari¹. Le EV sono particelle di membrana a doppio strato lipidico derivate da cellule che possono facilitare il trasferimento di una varietà di carichi di carico, come proteine, lipidi e acidi nucleici, alle cellule riceventi. Le vescicole extracellulari possono avere un ampio intervallo di dimensioni che vanno da 30 nm fino a 1 μM. Le vescicole extracellulari piccole (sEV), definite come vescicole legate ai lipidi con un diametro medio di <200 nm, hanno la capacità di attraversare la barriera emato-encefalica; pertanto, sono stati implicati nella diffusione e nell'esacerbazione di malattie neurodegenerative simili ai prioni e di altre condizioni come il morbo di Alzheimer (AD), la demenza frontotemporale (FTD), il morbo di Parkinson (PD) e i tumori ^2,3. Inoltre, poiché le sEV possono essere trovate in una serie di biofluidi come il sangue, il liquido cerebrospinale (CSF), la saliva e persino l'urina, il loro uso benefico può abbracciare il campo dei biomarcatori e della diagnostica non invasiva. Ad esempio, la ricerca sull'AD può indicare l'uso di rapporti proteici patogeni biofluidi, come tau/Aβ, o anche Aβ₄₂/Aβ₄₀⁴.

Un carico noto di sEV è il microRNA (miRNA), un gruppo di piccole molecole di RNA non codificanti di circa 22 nucleotidi di lunghezza che si legano alle regioni 3'-UTR dell'mRNA e di solito regolano negativamente l'espressione proteica. Coinvolti in molti ruoli cellulari, i miRNA sono stati anche implicati nella patogenesi di varie malattie, tra cui tumori e malattie neurodegenerative. Cheng et al. hanno condotto un'analisi di sequenziamento ad alto rendimento delle firme di espressione dei miRNA sEV derivate dal siero da pazienti con AD⁵. Una volta accoppiati con i registri di neuroimaging e i fattori di rischio noti di età, sesso e presentazione dell'allele APOE ε4, i risultati sono risultati predittivi di AD con una sensibilità dell'87% e una specificità del 77%. Inoltre, la ricerca ha identificato due miRNA upregolati nel liquido cerebrospinale (miR-151a-3p, let-7f-5p) e 3 miRNA sottoregolati (miR-27a-3p, miR-125a-5p e miR-423-5p) che possono potenzialmente diagnosticare la PD⁶ in stadio iniziale. Con le malattie patologiche, lo stato patologico può precedere alcuni sintomi caratteristici delle malattie, mentre nella neurodegenerazione, l'accumulo di segni patologici si verifica molto prima del declino cognitivo.

I microRNA sono potenzialmente un biomarcatore più efficace delle proteine, a causa delle loro diverse funzioni e della regolazione epigenetica di ordine superiore. Utilizzando il tessuto cerebrale, i ricercatori possono potenzialmente identificare specifiche firme di miRNA sEV derivate dal cervello (BDsEV) per le malattie e i loro sottotipi. Ad esempio, le sEV con marcatori neuronali e gliali possono presentare un diverso carico di miRNA e l'analisi può portare a metodi più precisi di rilevamento della malattia. Inoltre, si ritiene che le BDsEV svolgano un ruolo importante nella diffusione transsinaptica delle proteine neuropatogene⁷. Rapporti precedenti hanno suggerito l'immunoprecipitazione e l'ultracentrifugazione con gradiente di densità (gradiente di saccarosio) per ottenere sEV da tessuto cerebrale appena congelato ^8,9. Tuttavia, questi approcci richiedono un'infrastruttura specifica con ultracentrifuga e metodi di purificazione a valle per ottenere campioni di sEV di alta qualità¹⁰. Rapporti più recenti hanno suggerito diverse modifiche e miglioramenti all'approccio 11,12,13; tuttavia, nonostante ciò, l'isolamento e lo studio di microRNA derivati da sEV da tessuti umani non sono ancora ampiamente applicati. L'approccio descritto in questo protocollo mira a fornire un protocollo raffinato e graduale per lo studio delle sEV derivate dal cervello per migliorare l'accessibilità a questa tecnica. Abbiamo stabilito un protocollo utilizzando quantità minime di tessuto cerebrale, da cui abbiamo isolato le sEV pure utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale e mostriamo dati di sequenziamento di nuova generazione di alta qualità dal carico di microRNA di queste sEV.

Protocollo

Il lavoro è stato approvato eticamente dalla Manchester Brain Bank (riferimento REC 09/H0906/52) e dal comitato etico dell'Università di Salford (ID domanda: 3408).

1. Rottura della matrice intracellulare mediante collagenasi su sezioni di tessuto cerebrale congelato

1. Affettare sottilmente 250 mg di tessuto cerebrale congelato (frammenti spessi circa 0,4 mm) utilizzando un bisturi sterilizzato su una piastra fredda e aggiungere 2 mL di soluzione di collagenasi di tipo III/ibernato 75 U/mL.
2. Incubare ogni campione in un bagno d'acqua a 37 °C per 20 minuti. Al punto di 5 minuti, capovolgere ogni campione due volte per mescolare; al punto di 10 minuti, pipettare delicatamente ogni campione tre volte utilizzando una stripette monouso in plastica da 10 mL.
3. Mettere ogni campione sul ghiaccio e aggiungere 1x cocktail di inibitori della proteasi e 1x inibitore della fosfatasi. Questo interrompe la reazione enzimatica ed è il punto finale della digestione utilizzando la collagenasi di tipo III.
4. Centrifugare ogni campione di tessuto cerebrale a 300x g per 10 minuti a 4 °C. Raccogliere ogni surnatante e centrifugare ulteriormente a 2000 x g per 15 minuti a 4 °C.
5. Raccogliere nuovamente ogni surnatante e filtrarlo attraverso un filtro da 0,22 μm. Centrifugare ciascun filtrato a 10 000 x g per 48 minuti a 4 °C.
6. Raccogliere il surnatante e aggiungere il tampone di precipitazione in un rapporto di 2:1 per ciascun campione. Incubare per una notte a 4 °C.
7. Centrifugare ciascun campione a 10 000 x g per 96 minuti a 4 °C e risospendere il pellet in 100 μl di PBS libero da vescicole extracellulari (EV).

2. Preparazione delle colonne cromatografiche ad esclusione dimensionale

1. Prima dell'uso, equilibrare la colonna SEC pre-preparata a temperatura ambiente (RT) per 15 minuti.
   NOTA: Il tappo inferiore deve essere rimosso prima del tappo a vite.
2. Dopo l'equilibratura, rimuovere il tampone conservante dalla parte superiore della colonna e lavare la colonna due volte utilizzando 250 μl di PBS senza EV. Ogni lavaggio PBS viene lasciato entrare nella colonna per gravità.

3. Isolamento di piccole vescicole extracellulari mediante cromatografia ad esclusione dimensionale

1. Aggiungere il pellet risospeso alla sommità della colonna SEC e centrifugare la colonna a 50 x g per 30 s. Scartare il flusso.
2. Aggiungere 180 μl di PBS privo di EV alla parte superiore della colonna SEC e centrifugare la colonna a 50 x g per 1 minuto, consentendo alle sEV derivate dal cervello di eluire dalla colonna.
   NOTA: La parte del protocollo descritta sopra è riepilogata nella Figura 1.

4. Conferma di piccoli marcatori di vescicole extracellulari mediante western blotting

1. Per lisare le sEV prima dell'analisi western blot (per garantire l'analisi di tutti i carichi di membrana e citosolici), diluire il campione di sEV isolato 1:1 in tampone di lisi ed estrazione (1x inibitore della proteasi e 1x inibitore della fosfatasi).
2. Agitare il campione a 4 °C per 30 minuti.
3. Centrifugare il campione a 14 000 x g per 15 min.
4. Raccogli il surnatante proteico e misura le concentrazioni proteiche utilizzando un kit per il dosaggio delle proteine.
5. Mescolare i campioni con 4 tamponi Laemmli e caricare 20 μg di proteine in ciascun pozzetto contro una scala proteica precolorata.
6. Una volta risolte, trasferire le proteine su una membrana di nitrocellulosa da 0,45 μm. Dopo il trasferimento, bloccare la membrana per 2 ore al 5% BSA.
7. Incubare le membrane con anticorpi primari (Tabella 1) durante la notte.
8. Lavare la membrana tre volte con un tampone di lavaggio (1% Tween20 in PBS) e colorare con un anticorpo secondario anti-topo. Successivamente, lavare tre volte con tampone di lavaggio (1% Tween20 in PBS).
9. Segui i passaggi precedenti nel manoscritto prima di immaginare le macchie.
10. Immagine utilizzando il substrato della perossidasi di rafano (HRP).

5. Conferma di piccole vescicole extracellulari mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA)

1. Eseguire l'NTA per analizzare la concentrazione e le dimensioni di tutte le particelle nel campione. A tale scopo, diluire ciascun campione in PBS con un fattore di diluizione di 1:1000.
2. Iniettare il campione nello strumento NTA e leggere il campione a una lunghezza d'onda di 550 nm. In questa fase, utilizzare la quantità di particelle per misurare la quantità di proteine per particella (solitamente espressa in femtogramma) come raccomandato nelle linee guida MISEV.
3. Successivamente, per l'NTA fluorescente, diluire la maschera cellulare arancione (CMO) (colora tutte le particelle biologiche all'interno di un campione) in PBS con un fattore di diluizione di 1:1000. Da questo, diluire il colorante CMO utilizzando il campione sEV con un fattore di diluizione di 1:10 - Incubare questa fase di diluizione al buio per 30 minuti a 4 °C.
4. Diluire la seconda diluizione CMO utilizzando PBS con un fattore di diluizione di 1:1000.
   NOTA: La diluizione finale del colorante OCM deve essere 1:10 000 000.
5. Leggere il CMO di ciascun campione di sEV a una lunghezza d'onda di 550 nm utilizzando lo strumento NTA.
6. Per gli anticorpi fluorescenti con tetraspanina (vedi Tabella dei materiali), in primo luogo, diluire ciascun rispettivo anticorpo in PBS con un fattore di diluizione di 1:10. Da questo, diluire ciascuno dei coloranti utilizzando il campione sEV con un fattore di diluizione di 1:10 - Incubare la fase di diluizione al buio per 2 ore a 4 °C.
7. Diluire la seconda diluizione anticorpale utilizzando PBS con un fattore di diluizione di 1:1000.
   NOTA: La diluizione finale di ciascun anticorpo tetraspanina deve essere 1:100 000.
8. Leggere le letture degli anticorpi fluorescenti del campione sEV a una lunghezza d'onda di 550 nm utilizzando lo strumento NTA.

6. Conferma di piccole vescicole extracellulari mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM)

NOTA: Questo protocollo è stato eseguito dalla Biomedical Microscopy Facility dell'Università di Liverpool.

1. In primo luogo, fissare i campioni di sEV utilizzando glutaraldeide e colorare con acetato di uranile.
2. Attraverso una serie di alcoli graduati, disidratare il campione pronto per la TEM.
3. Immagini di campioni utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione adatto.

7. Trattamento con proteinasi K e RNasi A

1. A 50 μL di EV isolate derivate dal cervello, aggiungere 1 μL di 20 μg/μL di proteinasi K e incubare a 37 °C per 30 minuti.
2. Arresta ogni reazione aggiungendo 1x cocktail di inibitori della proteinasi e incuba con ghiaccio per 10 minuti.
3. Dopo l'incubazione, aggiungere 1 μL di 10 μg/μL di RNasi A a ciascun campione e incubare ulteriormente a 37 °C per 30 minuti.
   NOTA: Passare immediatamente alla sezione 8.

8. Isolamento totale dell'RNA da piccole vescicole extracellulari

1. Per isolare l'RNA totale, aggiungere 700 μL di reagente di lisi di recupero dell'RNA di alta qualità a 50 μL di campione di EV derivato dal cervello (BDsEV). Agitare ogni campione per 1 ora.
2. Aggiungere 140 μl di cloroformio, agitare energicamente ogni campione per 20 s e lasciare incubare a RT per 3 minuti.
3. Centrifugare il campione a 12 000 x g per 15 minuti a 4 °C e raccogliere l'interfase dal campione. Aggiungere 1,5 volte il volume di etanolo al 100%.
4. Aggiungere 700 μL di colonne di isolamento dell'RNA della miscela interfase/etanolo e centrifugare a ≥8000 x g per 15 s a RT.
   NOTA: Ripetere questo passaggio utilizzando tutti i campioni di interfase/etanolo.
5. Alla colonna, aggiungere 700 μL di tampone di lavaggio e centrifugare a ≥8000 x g per 15 s. Scartare il flusso.
6. Aggiungere 500 μl di tampone RPE e centrifugare nuovamente a ≥8000 x g per 15 s. Scartare il flusso.
7. Aggiungere 500 μl di etanolo all'80% e centrifugare a ≥8000 x g per 2 minuti. Scartare il flusso.
8. A questo punto, asciugare la membrana della colonna centrifugando le colonne alla massima velocità (>8000 x g) per 5 min con il coperchio aperto.
9. Trasferire la colonna in una nuova provetta di raccolta, aggiungere 14 μL di acqua priva di RNasi direttamente alla membrana della colonna e centrifugare a ≥8000 x g per 1 minuto per eluire l'RNA totale dalle BDsEV.
10. Quantificare il microRNA totale con i campioni utilizzando un kit di dosaggio per la quantificazione dei miRNA, in cui i campioni sono stati misurati su un fluorimetro per quantificazione, selezionando il tipo di test per i miRNA.

9. Sequenziamento di piccoli RNA

1. Dopo la quantificazione del miRNA all'interno del campione, sintetizzare una libreria di cDNA utilizzando il kit di preparazione della libreria Small RNA-Seq.
   NOTA: Utilizzando questo protocollo, la generazione della libreria includeva quattro passaggi: legatura dell'adattatore 3', purificazione, legatura dell'adattatore 5' e trascrizione inversa - dove, alla fine, viene formata una libreria di RNA/cDNA. Dopo la generazione della libreria, l'amplificazione PCR dell'endpoint avviene con l'aggiunta di primer indice (utilizzati per scopi di multiplexing), dopodiché i campioni vengono purificati.
2. Per testare la qualità dell'RNA, utilizzare un test applicativo di controllo qualità che descriva in dettaglio le dimensioni di ciascuna preparazione e l'intensità di picco.
3. Per verificare la concentrazione di DNA, misurare la quantificazione del DNA su un fluorimetro di quantificazione, selezionando il tipo di saggio dsDNA.
4. Preparare i campioni per Small RNA Seq utilizzando il kit di reagenti, dopodiché i campioni vengono caricati nella cella a flusso.

Risultati

Per confermare la presenza di BDsEVsEV, sono state utilizzate tre tecniche: western blotting, NTA e TEM (Figura 3). I risultati del Western blot (Figura 3A e File supplementare 1) mostrano la presenza di tutti e cinque i marcatori positivi (CD9, CD63, CD81, Flot-1 e TSG101) e l'assenza di Calnexina nelle sEV (utilizzate come controllo negativo), confermando l'assenza di contaminazione con il contenuto cellulare....

Discussione

Questo protocollo modificato e migliorato per l'isolamento di piccole vescicole extracellulari derivate dal cervello e del loro carico di microRNA dimostra la fattibilità dell'utilizzo di una quantità minima di tessuto senza compromettere la qualità e la quantità dei prodotti a valle. Nel campo della scoperta di biomarcatori, l'identificazione di identificatori molecolari specifici per i tipi di cellule e tessuti può portare a mezzi più accessibili per test diagnostici non invasiv...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Merck	A9418-100G
Cell Mask Orange Plasma Membrane Stain	ThermoFisher Scientific	C10045
Collagenase Type-III	StemCell Technologies	07422
ExoSpin Columns and Buffer	Cell Guidance Systems Ltd.	EX01-50	This kit contains SEC columns used in this experiment, precipitation buffer and EV free PBS.
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)	ThermoFisher Scientific	78429
Hibernate-E Medium	ThermoFisher Scientific	A1247601
Laemmli Sample Buffer (4x)	BioRad	1610747
Lexogen Small RNA-Seq Library Prep Kit	Lexogen	052.24	This kit contains Small RNA preparation reagent box with i7 Index primer plate.
miRNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	217084	This kit contains high-quality RNA recovery lysis reagent (Qiazol), RNA isolation columns, isolation buffers (RWT, RPE) and RNase free water.
MiSeq Reagent Kit v3	Illumina	MS-102-3001	This is the Illumina Preparation Kit
Nitrocellulose Membrane, 0.45 μm	ThermoFisher Scientific	88018
PE/Dazzle 594 anti-human CD63 Antibody	BioLegend	143914	Used for fNTA Analysis
PE/Dazzle 594 anti-human CD81 Antibody	BioLegend	349520	Used for fNTA Analysis
PE/Dazzle 594 anti-human CD9 Antibody	BioLegend	312118	Used for fNTA Analysis
PhosSTOP	Merck	4906845001
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049
Qubit microRNA Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q32880
Qubit 1X dsDNA HS assay kit	ThermoFisher Scientific	Q33230
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216
RIPA Lysis and Extraction Buffer	ThermoFisher Scientific	89901
RNase A	ThermoFisher Scientific	EN0531
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	ThermoFisher Scientific	34094