Valutazione del rilascio di LC3-II attraverso vescicole extracellulari in relazione all'accumulo di vescicole intracellulari LC3-positive

Riepilogo

Qui, presentiamo la metodologia per valutare in modo conciso i livelli di LC3-II del marcatore autofagosomico nelle vescicole extracellulari (EV) mediante immunoblotting. L'analisi dei livelli di LC3-II nelle vescicole extracellulari, nella formazione di autolisosomi e nella formazione di omegasomi suggerisce il nuovo ruolo di STX6 nel rilascio di vescicole extracellulari LC3-II positive quando la fusione autofagosoma-lisosoma è inibita.

Abstract

La (macro)autofagia rappresenta una fondamentale via di degradazione cellulare. In questo processo, vescicole a doppia membrana note come autofagosomi inghiottono il contenuto citoplasmatico, fondendosi successivamente con i lisosomi per la degradazione. Oltre al ruolo canonico, i geni correlati all'autofagia modulano anche una via secretoria che coinvolge il rilascio di molecole infiammatorie, fattori di riparazione tissutale e vescicole extracellulari (EV). In particolare, il processo di diffusione delle proteine patologiche tra le cellule, in particolare nelle malattie neurodegenerative che colpiscono il cervello e il midollo spinale, sottolinea l'importanza della comprensione di questo fenomeno. Ricerche recenti suggeriscono che la proteina 43 kDa (TDP-43) che lega il DNA di risposta transattiva, un attore chiave nella sclerosi laterale amiotrofica e nella degenerazione lobare frontotemporale, viene rilasciata in modo autofagico-dipendente tramite EV arricchite con il marcatore autofagosomico proteina associata ai microtubuli 1A/1B light chain 3B-II (LC3-II), specialmente quando la fusione autofagosoma-lisosoma è inibita.

Per chiarire il meccanismo alla base della formazione e del rilascio di vescicole extracellulari LC3-II-positive, è imperativo stabilire un metodo accessibile e riproducibile per valutare le vescicole LC3-II-positive sia intracellulari che extracellulari. Questo studio presenta un protocollo dettagliato per la valutazione dei livelli di LC3-II tramite immunoblotting nelle frazioni cellulari e EV ottenute attraverso la centrifugazione differenziale. La bafilomicina A1 (Baf), un inibitore della fusione autofagosoma-lisosoma, funge da controllo positivo per aumentare i livelli di vescicole LC3-II positive intracellulari ed extracellulari. Il gene 101 (TSG101) è usato come marcatore per i corpi multivescicolari. Applicando questo protocollo, è dimostrato che il knockdown mediato da siRNA della sintaxina-6 (STX6), un fattore di rischio genetico per la malattia sporadica di Creutzfeldt-Jakob, aumenta i livelli di LC3-II nella frazione EV delle cellule trattate con Baf senza mostrare alcun effetto significativo sui livelli di TSG101. Questi risultati suggeriscono che STX6 può regolare negativamente il rilascio extracellulare di LC3-II attraverso le vescicole extracellulari, in particolare in condizioni in cui la fusione autofagosoma-lisosoma è compromessa. In combinazione con metodi consolidati per la valutazione dell'autofagia, questo protocollo fornisce preziose informazioni sul ruolo di molecole specifiche nella formazione e nel rilascio di EV LC3-II-positive.

Introduzione

La proteina 43 legante il DNA (TDP-43) è una ribonucleoproteina nucleare eterogenea ampiamente espressa coinvolta nella regolazione dello splicing dell'esone, della trascrizione genica e della stabilità dell'mRNA, tutti vitali per la sopravvivenza cellulare ^1,2. In condizioni neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e la degenerazione lobare frontotemporale (FTLD), una proteina nucleare TDP-43 si accumula in modo anomalo nel citoplasma. Questo spostamento si traduce in una perdita della funzione di TDP-43 nel nucleo e in un guadagno di funzione tossico nel citoplasma. L'accumulo patologico di TDP-43 inizia in regioni specifiche del cervello e del midollo spinale, diffondendosi attraverso queste aree in modo simile a quello dei prioni, un processo strettamente associato alla progressione della malattia³. Tuttavia, l'esatto meccanismo con cui la patologia TDP-43 si diffonde attraverso il cervello e il midollo spinale rimane sconosciuto.

La TDP-43 viene secreta attraverso le vescicole extracellulari (EV) e livelli elevati di TDP-43 vengono rilevati nel plasma e nel liquido cerebrospinale (CSF) dei pazienti affetti da SLA e FTLD-TDP ^4,5,6. Il liquido cerebrospinale di pazienti con diagnosi di SLA e FTLD induce un'errata localizzazione intracellulare e l'aggregazione di TDP-43 endogeno nelle cellule di glioma umano⁷. Pertanto, la TDP-43 rilasciata extracellulare tramite vescicole extracellulari può mediare la diffusione da cellula a cellula della patologia TDP-43.

L'autofagia è un meccanismo di degradazione cellulare ben conservato che coinvolge l'incapsulamento di sostanze indesiderate all'interno di vescicole a doppia membrana, note come autofagosomi, che sono marcate da LC3. Questi autofagosomi si fondono con i lisosomi positivi alla proteina di membrana 1 (LAMP1) per formare autolisosomi (LC3⁺/LAMP1⁺), portando alla degradazione del loro contenuto⁸. Le analisi istologiche indicano che gli autofagosomi che inghiottono le inclusioni si accumulano nei neuroni dei pazienti sporadici affetti da SLA⁹. Alcuni geni causali della SLA familiare e dell'FTLD-TDP sono legati alla regolazione dell'autofagia 10,11,12. Questi risultati suggeriscono che l'autofagia è soppressa nei pazienti con SLA e FTLD-TDP.

Lo studio precedente ha indicato che TDP-43 è secreto tramite EV positive per il marcatore autofagosomico LC3-II quando la fusione autofagosoma-lisosoma è inibita¹³. La disregolazione della via autofagia-lisosoma potrebbe causare non solo l'accumulo intracellulare di TDP-43, ma anche il rilascio extracellulare di TDP-43 attraverso le EV¹⁴. Tuttavia, non è noto come vengano rilasciate le vescicole extracellulari LC3-II positive e quanto questo sia significativo nella diffusione della patologia TDP-43.

Le vescicole extracellulari sono classificate in vescicole extracellulari di grandi dimensioni (da 100 a 1000 nm di diametro), prodotte dalla gemmazione della superficie cellulare, e vescicole extracellulari piccole (da 50 a 150 nm di diametro), prodotte dalla gemmazione delle membrane endosomiali verso l'interno dell'endosoma (note come esosomi) e dell'apparato di Golgi. Per raccogliere separatamente le vescicole extracellulari grandi e piccole, eseguiamo la centrifugazione sequenziale e raccogliamo i pellet mediante centrifugazione rispettivamente a 20.000 × g e 110.000 × g. La frazione EV P1 (20.000 × g di pellet) è preparata per raccogliere EV di grandi dimensioni, mentre la frazione EV P2 (110.000 × g di pellet) è preparata per raccogliere EV di piccole dimensioni¹⁵. La metodologia per valutare i livelli di LC3-II in EV grandi e piccole derivate dalla centrifugazione sequenziale mediante immunoblotting è stabile e riproducibile¹⁶. Oltre ad analizzare i livelli di LC3-II nelle vescicole extracellulari, l'analisi della formazione di autolisosomi e omegasomi migliora la comprensione di come la disregolazione dell'autofagia porti al rilascio di vescicole extracellulari LC3-II positive. Qui, il presente studio mostra il ruolo soppressivo della sintaxina 6 (STX6), una proteina SNARE, che promuove il movimento delle vescicole di trasporto verso le membrane bersaglio¹⁷, nel rilascio di EV positive per LC3-II quando la fusione autofagosoma-lisosoma è inibita.

Protocollo

1. Preparazione della cellula, della frazione EV P1 e P2 dal terreno di coltura di cellule HeLa

1. Preparazione della frazione EV P1 e P2 dal terreno di coltura di cellule HeLa
   1. Giorno 1
      1. Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule e seminare 1 × 10⁶ cellule su una piastra di 6 cm contenente un terreno di coltura composto da DMEM ad alto glucosio, 10% FBS e 1% penicillina/streptomicina. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 h.
   2. Giorno 2 (opzionale)
      1. Preparare una soluzione di siRNA da 20 μM.
      2. Mescolare 100 μl di terreno sierico ridotto e 3 μl di siRNA in una provetta a bassa ritenzione per preparare la soluzione A.
      3. Miscelare 100 μl di terreno sierico ridotto e 5 μl di reagente di trasfezione in una provetta a bassa ritenzione per preparare la soluzione B.
      4. Mescolare la soluzione A e la soluzione B, quindi incubare la miscela a temperatura ambiente (RT) per 5 minuti.
      5. Aggiungere la miscela delle soluzioni A e B al terreno utilizzato per la coltura delle cellule HeLa. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 h.
   3. Giorno 3
      1. Lavare le celle con PBS ed esporle a 500 μL di tripsina allo 0,25% e 1 mM di soluzione EDTA a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 5 minuti.
      2. Aggiungere 2,5 mL del terreno di coltura alle cellule e utilizzare una pipetta di trasferimento Pasteur con un puntale da 200 μL collegato per preparare una sospensione a cellula singola.
      3. Contare le cellule utilizzando un contacellule e seminare 1 × 10⁶ celle su una piastra di 10 cm. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 h.
         NOTA: È necessario preparare almeno 1 × 10⁶ cellule per raccogliere le vescicole extracellulari dal terreno di coltura necessario per l'analisi di immunoblotting.
   4. Giorno 4
      1. Preparare un terreno di coltura (vedere il passaggio 1.1.1.1) contenente un veicolo (DMSO) o 100 nM di Bafilomicina A1 (Baf).
      2. Esporre le cellule al mezzo contenente veicolo o Baf 100 nM e incubarle a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 ore.
   5. Giorno 5
      1. Raccogliere tutto il terreno di coltura dalla piastra da 10 cm, trasferirlo in una provetta da 15 ml e centrifugarlo a 3.000 × g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti cellulari.
         NOTA: Le celle rimanenti nella piastra da 10 cm verranno utilizzate nella sezione 1.2.1.
      2. Per l'isolamento della frazione P1 EV, trasferire il surnatante dopo la centrifugazione a 3.000 × g in una provetta da centrifugazione, quindi centrifugarlo a 20.000 × g a 4 °C per 1 ora.
      3. Per l'isolamento della frazione P2 EV, trasferire il surnatante dopo la centrifugazione a 20.000 × g in una provetta per ultracentrifuga, quindi centrifugarlo a 110.000 × g a 4 °C per 1 ora.
      4. Dopo aver rimosso l'umidità in eccesso all'interno della provetta con un panno da laboratorio, risospendere i pellet rimanenti nella provetta da centrifugazione in 50 μl di tampone campione 2x [2,5% SDS, 125mM Tris-HCl tampone (pH 6,8), 30% glicerolo, 10% 2-mercaptoetanolo, 0,4% blu bromofenolo] per preparare la frazione P1 EV.
      5. Rimuovere il surnatante mediante decantazione, rimuovere l'umidità in eccesso all'interno della provetta con un panno da laboratorio, quindi risospendere i pellet rimanenti nella provetta di ultracentrifugazione in 50 μl di tampone campione 2x per preparare la frazione P2 EV.
      6. Incubare le frazioni EV P1 e P2 a 100 °C su un blocco termico per 10 minuti.
         NOTA: Non agitare le provette dopo la centrifugazione a 20.000 × g e 110.000 × g per evitare di scartare accidentalmente i pellet rimanenti. Dopo aver inclinato il tubo per trasferire il surnatante, mantenere la posizione del tubo per evitare che il pellet venga nuovamente immerso nel surnatante rimanente.
2. Preparazione della frazione cellulare da cellule HeLa in coltura
   1. Giorno 5
      1. Dopo aver trasferito il terreno di coltura dalla piastra da 10 cm in una provetta da 15 mL, lavare le cellule nella piastra da 10 cm con PBS ed esporle a 2 mL di tripsina allo 0,25% e 1 mM di soluzione EDTA a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 5 min.
      2. Aggiungere 8 mL di terreno di crescita alle cellule, quindi utilizzare una pipetta di trasferimento Pasteur con un puntale da 200 μL per pipettare le cellule e preparare una sospensione a cellula singola.
      3. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugarla a 1.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
      4. Rimuovere il surnatante con un aspiratore, aggiungere PBS al pellet della cella e centrifugare a 1.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
      5. Rimuovere il PBS utilizzando un aspiratore e sonicare il pellet cellulare in 1 mL di tampone A68 [10 mM di tampone Tris-HCl, pH 7,5, 0,8 M NaCl, 1 mM di glicole etilenico bis(β-amminoetil etere)-N,N,N,N-tetraacetico (EGTA)] contenente l'1% di sarkosil.
      6. Misurare la concentrazione proteica del lisato cellulare utilizzando un kit per il dosaggio delle proteine BCA.
      7. Miscelare 300 μl di lisato cellulare con 100 μl di tampone campione 4x e incubare la miscela a 100 °C su un blocco termico per 10 minuti per preparare la frazione cellulare.

2. Analisi di immunoblotting

1. Separare le quantità equivalenti di proteine nei campioni mediante SDS-PAGE¹⁸.
2. Trasferire le proteine separate su membrane di polivinilidene difluoruro (PVDF).
3. Dopo il trasferimento, bloccare le membrane con l'agente bloccante per 20 minuti.
4. Incubare la membrana ostruita per una notte con l'anticorpo primario indicato nel tampone Tris contenente il 10% (v/v) di siero di vitello a RT.
5. Lavare la membrana con tampone Tris per 5 s e poi incubarla con un anticorpo secondario coniugato con biotina a RT per 2 ore.
6. Lavare la membrana con tampone Tris per 5 s e poi incubarla con tampone Tris contenente le soluzioni A allo 0,4% (v/v) e la soluzione B del kit a RT per 1 h.
7. Lavare la membrana con PBS, quindi incubarla con PBS contenente lo 0,04% (p/v) di diaminobenzidina, lo 0,8% (p/v) di NiCl₂·6H₂O e lo 0,3% (v/v) di H₂O₂ per il rilevamento colorimetrico delle bande.
   NOTA: Per il rilevamento dei segnali, è accettabile anche un metodo di chemiluminescenza.
8. Digitalizzare l'immagine della membrana con uno scanner e sottoporla ad analisi densitometrica utilizzando Fiji.
   1. Apri l'immagine digitalizzata utilizzando Fiji e converti l'immagine a colori RGB in un'immagine a 8 bit facendo clic su Immagine | Tipologia | 8 bit.
   2. Fare clic sullo strumento rettangolo e regolare le dimensioni del rettangolo trascinandolo per circondare le bande. Identificare la banda da analizzare facendo clic su Analizza | Gel | Selezionare Prima corsia.
   3. Posizionare il rettangolo sulla seconda banda e sulle successive e identificare le bande per l'analisi facendo clic su Analizza | Gel | Seleziona Corsia successiva.
   4. Dopo aver riconosciuto la banda finale, misurare la densitometria attraverso il rettangolo facendo clic su Analizza | Gel | Trame Lanes.
   5. Circondare l'area del segnale della banda con una linea retta, fare clic sullo strumento bacchetta e fare clic nell'area per calcolare l'intensità del segnale della banda.

3. Analisi del numero di autofagosomi e autolisosomi

1. Giorno 1
   1. Contare il numero di cellule HeLa utilizzando un contatore di cellule e seminare 1 × 10⁵ cellule HeLa che esprimono LAMP1-GFP e mCherry-LC3 su un piatto di 3,5 cm. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 h.
2. Giorno 2 (opzionale)
   1. Eseguire i passaggi descritti nella sezione 1.1.2 in piatti da 3,5 cm.
3. Giorno 3
   1. Scartare il terreno di coltura dai piatti da 3,5 cm.
   2. Lavare le celle con PBS, esporle a 400 μL di tripsina allo 0,25% e 1 mM di soluzione EDTA e incubare a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 5 minuti.
   3. Aggiungere 1,6 ml di terreno di coltura alle cellule e pipettarle con una pipetta di trasferimento Pasteur per preparare una sospensione di una singola cellula.
   4. Conta il numero di cellule usando il contacellule e semina 1 × 10⁴ celle su un vetrino coprioggetti a 8 camere. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 h.
      NOTA: Due pozzetti del vetrino coprioggetti camerato sono preparati rispettivamente per il controllo e per le celle di abbattimento STX6, dopo il trattamento DMSO o Baf come descritto nella sezione 3.4.2.
4. Giorno 4
   1. Preparare il terreno di coltura senza rosso fenolo (DMEM senza rosso fenolo, 10% FBS, 1% penicillina/streptomicina), contenente un mezzo disperdente (DMSO) o 100 nM di Baf disciolto in DMSO.
   2. Sostituire il terreno di coltura con un terreno privo di rosso fenolo, contenente veicolo o Baf 100 nM, e incubare per 4 ore.
      NOTA: Per valutare l'effetto di Baf sul numero di autofagosomi e autolisosomi, preparare cellule trattate con veicolo come controlli.
   3. Colorare i nuclei con 0,33 μg/mL di Hoechst 33342 per 30 minuti prima dell'osservazione.
   4. Esegui l'imaging di cellule vive utilizzando un obiettivo 60x su un microscopio laser confocale e acquisisci dieci fotogrammi diversi.
      1. Apri l'immagine unita RGB nelle Fiji e dividila nei rispettivi componenti dell'immagine rosso, verde e blu facendo clic su Immagine | Colore | Canali divisi.
      2. Impostare una soglia costante per i segnali rosso e verde in ogni immagine facendo clic su Immagine | Regola | Soglia per ogni esperimento.
      3. Conta il numero di aree positive per i segnali rossi o verdi facendo clic su Analizza | Analizza le particelle. Selezionare la casella Riepiloga , quindi fare clic su OK. Registrare i valori del conteggio per identificare le vescicole associate all'autofagosoma e al lisosoma.
      4. Per sovrapporre l'immagine verde all'immagine rossa, impostare la modalità di trasferimento su AND facendo clic su Modifica | Controllo Incolla. Copia l'immagine verde e poi incollala sull'immagine rossa per unirle, evidenziando le aree positive sia per i segnali rossi che per quelli verdi.
      5. Per identificare i numeri degli autolisosomi, contare il numero di aree positive per i segnali rossi e verdi facendo clic su Analizza | Analizza le particelle. Selezionare la casella Riepiloga , fare clic su OK e registrare i valori nella sezione Conteggio per identificare le vescicole associate agli autofagosomi e ai lisosomi.
   5. Dividi il numero totale di autolisosomi e autofagosomi per il numero totale di cellule per calcolare il numero di autolisosomi e autofagosomi per cellula.
      NOTA: Contare almeno 35 cellule in ciascuno dei tre esperimenti indipendenti.

4. Analisi per la formazione di omegasomi

1. Giorno 1
   1. Contare il numero di cellule HeLa utilizzando un contacellule e seminare 1 × 10⁵ cellule su un piatto di 3,5 cm. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 h.
2. Giorno 2 (opzionale)
   1. Eseguire i passaggi descritti nella sezione 1.1.2.
3. Giorno 3
   1. Preparare una sospensione a cellula singola come descritto nei passaggi 3.3.1-3.3.2.
   2. Contare le cellule utilizzando il contacellule e seminare 1 × 10⁵ celle su un piatto di 3,5 cm. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 h.
4. Giorno 4
   1. Mescolare 1 μg di pEGFP-C1-hAtg13, 3 μl di reagente di trasfezione del DNA e 100 μl di terreno sierico ridotto in una provetta a bassa ritenzione. Incubare la miscela per 20 minuti, quindi aggiungerla al terreno di coltura.
   2. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 h.
5. Giorno 5
   1. Tripsinizzare le cellule come descritto nei passaggi 3.3.1-3.3.2.
   2. Aggiungere 2,5 mL di terreno di coltura alle cellule. Pipettare la miscela utilizzando una pipetta di trasferimento Pasteur per preparare una sospensione unicellulare.
   3. Contare le cellule utilizzando il contacellule e seminare 1 × 10⁴ celle su un vetrino coprioggetti a 8 camere. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 h.
6. Giorno 6
   1. Seguire i passaggi 3.4.1-3.4.4 per eseguire l'imaging di cellule vive delle cellule dal passaggio 4.5.3 utilizzando un microscopio laser confocale. Cattura dieci diversi fotogrammi di immagini.
      1. Seguire i passaggi 3.4.4.1-3.4.4.3 per dividere le immagini unite RGB nei rispettivi componenti dell'immagine rosso, verde e blu, impostare una soglia costante per i segnali verdi in ciascuna immagine e determinare l'intensità del segnale GFP. Registrare i valori dalla sezione Area totale per determinare l'intensità del segnale di GFP-ATG13.
      2. Dividi l'intensità totale del segnale per il numero di celle esaminate per calcolare l'intensità del segnale per cella.
         NOTA: Contare almeno 34 cellule in ciascuno dei tre esperimenti indipendenti.

Risultati

Come mostrato in studi precedenti, il trattamento con Baf ha aumentato i livelli di TSG101 (P1: P < 0,01, P2: P = 0,012, come determinato dall'ANOVA a due vie in EZR¹⁹) e LC3-II (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, come determinato dall'ANOVA a due vie in EZR¹⁹) nella frazione ricca di EV. In particolare, il trattamento con Baf ha anche aumentato i livelli di STX6 (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, come determinato dall'ANOVA a due vie in EZR

Discussione

Lo studio di immunoblotting ha rivelato i livelli di LC3-II e TSG101 nella frazione cellulare, nella frazione EV P1 ricca di microvescicole e nella frazione EV P2 ricca di esosomi. L'imaging su cellule vive è stato utilizzato per esaminare autofagosomi, autolisosomi e omegasomi, fornendo informazioni sul fatto che il knockdown di STX6 influenzi l'autofagia. Questi risultati combinati suggeriscono che il knockdown di STX6 influisce sul rilascio di EV LC3-II positive, po...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 % Trypsin EDTA	Fujifilm Wako	201-16945
10 cm Dish	Thermo Fisher Scientific	150464
15 mL Tube	Thermo Fisher Scientific	339650
200 μL Pipette Tip	Nippon Genetics	FG-301	pipetting
2-Mercaptoethanol	Nacalai Tesque	21417-52	a material for sample buffer solution
3,3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Nacalai Tesque	11009-41	a material for DAB solution
3.5 cm Dish	Thermo Fisher Scientific	150460
6 cm Dish	TrueLine	TR4001
Aluminium Block Thermostatic Baths (dry thermobaths)	EYELA	273860
Aspirator	SANSYO	SAP-102	inhaling solution
Avanti JXN-30	Beckman Coulter	B34193
Bafilomycin A1	Adipogen	BVT-0252
Biotin-conjugated Goat Anti-rabbit IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-1000	2nd antibody for immunoblotting
Biotin-conjugated Horse Antimouse IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-2000	2nd antibody for immunoblotting
Blocking One	Nacalai Tesque	03953-95	a material for immunoblotting
Bromophenol Blue	Nacalai Tesque	05808-61	a material for sample buffer solution
Calf Serum	cytiva	SH30073.03
CanoScan LiDE 220	Canon	CSLIDE220	Scanner
Centrifuge 5702 R	eppendolf	5703000039
Counting Slides Dual Chamber	Bio-Rad	1450015J	cell counting
Digital Sonifier 450	BRANSON
Dimethyl Sulfoxide	nacalai tasque	09659-14	vehicle
DMEM High Glucose	Nacalai Tesque	08458-45	culture medium
DMEM without Phenol Red	Nacalai Tesque	08489-45	culture medium
EGTA	Dojindo	348-01311	a material for A68 solution
Excel	Microsoft	version 16.16.27	satistical analysis
EZR	Reference No. 24	version 1.68	satistical analysis
FBS	Sigma	173012	Culture medium
Fiji	NIH		Image analysis tool
Glycerol	Nacalai Tesque	09886-05	a material for sample buffer solution
Hoehst33342	Dojindo	H342
Hydrogen Peroxide	Fujifilm Wako	080-0186	a material for DAB solution
Kimwipe S-200	NIPPON PAPER CRECIA	62011	cleaning wipe
Low Retention Tube	Nippon Genetics	FG-MCT015CLB	siRNA and DNA transfection
LSM780 Confocal Laser Microscope	Carl Zeiss
Monoclonal Mouse Anti-LC3 Antibody	MBL	M186-3	1st antibody for immunoblotting
Nickel(II) Chloride Hexahydrate	Fujifilm Wako	149-01041	a material for DAB solution
N-Lauroylsarcosine Sodium Salt	Nacalai Tesque	20117-12
Optima XE-90 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985-070	siRNA and DNA transfection
pEGFP-C1-hAtg13	Addgene	22875
Penicillin/Streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Culture medium
Pierce BCA Protein Assay Kits	Thermo Fisher Scientific	23225
Polyclonal Rabbit Anti-PCNA Antibody	BioAcademia	70-080	1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-syntaxin 6 Antibody	ProteinTech	10841-1-AP	1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-TSG101 Antibody	ProteinTech	28283-1-AP	1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-ULK1 Antibody	ProteinTech	20986-1-AP	1st antibody for immunoblotting
Polyvinylidene Difluoride Membrane	Milliore	IPVH00010	a material for immunoblotting
R	R development core team	version 4.4.1	satistical analysis
RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778	siRNA transfection reagent
siRNA STX6	Thermo Fisher Scientific	HSS115604	siRNA for transfection
Sodium Chloride	Nacalai Tesque	31320-05	a material for Tris buffer and A68 solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Fujifilm Wako	192-13981	a material for sample buffer solution
SPARK Microplate Reader	TECAN
Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GC	Thermo Fisher Scientific	12935300	siRNA transfection
Sucrose	Fujifilm Wako	193-00025	a material for A68 solution
TC20 Automated Cell Counter with Thermal Printer	Bio-Rad	1450109J1	cell counting
Thermobath	TOKYO RIKAKIKAI	MG-3100	incubation
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	DNA transfection reagent
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR2300	DNA transfection reagent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Nacalai Tesque	35406-75	a material for Tris buffer, sample buffer and A68 solution
Trypan Blue Dye 0.40%	Bio-Rad	1450021	cell counting
Ultra-Clear Open-Top Tube, 16 x 96mm	Beckman Coulter	361706	collecting for the P1 EV fraction
Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Coulter	344059	collecting for the P2 EV fraction
Vectastain ABC Standard Kit	Vector Laboratories	PK-4000	immunoblotting
Wash Bottle	As One	1-4640-02	washing membrane
μ-Slide 8 Well High	ibidi	80806