Imaging tridimensionale dei tessuti aortici nell'aterosclerosi

Riepilogo

Qui, presentiamo protocolli ottimizzati di pulizia dei tessuti per visualizzare l'aorta murina in tre dimensioni (3D). Delineiamo procedure all'avanguardia per l'immunocolorazione, la pulizia ottica e l'imaging con l'intento di definire la prossimità anatomica del sistema nervoso periferico con le placche aterosclerotiche e l'avventizia nell'aterosclerosi.

Abstract

Recenti ricerche hanno fatto progredire la comprensione dell'aterosclerosi come una malattia infiammatoria cronica transmurale che coinvolge tutti e tre gli strati della parete arteriosa, compresa la placca intima, la media e l'avventizia, che forma il rivestimento esterno del tessuto connettivo delle arterie. I nostri studi recenti hanno suggerito che l'avventizia viene utilizzata dal sistema nervoso periferico come condotto per raggiungere tutte le cellule dei tessuti. Abbiamo anche scoperto che il sistema nervoso periferico, cioè il sistema nervoso sensoriale e simpatico, subisce importanti processi di rimodellamento che coinvolgono la neogenesi delle reti assonali adiacenti alle placche aterosclerotiche. In questo contesto, la comprensione della struttura della rete neurale e delle sue interazioni con i componenti vascolari delle arterie malate è molto promettente per una migliore comprensione della patogenesi delle malattie cardiovascolari. Per raggiungere questi obiettivi, sono necessari metodi per visualizzare l'architettura subcellulare delle arterie sane e malate intatte insieme ai compartimenti perivascolari circostanti. La pulizia dei tessuti consente l'imaging intatto dei tessuti profondi di compartimenti tissutali più grandi che altrimenti sarebbero inaccessibili. Consente l'imaging volumetrico di arterie intatte attraverso l'integrazione di strumenti di etichettatura, pulizia, imaging microscopico avanzato ed elaborazione delle immagini. Qui, descriviamo due approcci distinti ma complementari per la pulizia passiva dei tessuti, ovvero la pulizia acquosa del 2,2-tiodietanolo (TDE) e l'imaging tridimensionale abilitato dall'immunomarcatura a base di solvente della purificazione dell'organo con solvente (iDISCO) per l'imaging di segmenti aortici isolati o dell'intera aorta in situ nell'intero topo.

Introduzione

Le tecniche istologiche forniscono una comprensione di base dei campioni biologici attraverso il sezionamento di tessuti/organi. Tuttavia, la delineazione di complesse interazioni anatomiche cellula/cellula e tessuto/tessuto in tre dimansioni (3D) è stata, fino a poco tempo fa, difficile da realizzare. Questo bisogno insoddisfatto era particolarmente evidente nel contesto del sistema cardiovascolare in condizioni sane e malate. In passato, l'imaging di tessuti intatti è stato difficile a causa dell'assorbimento e della diffusione della luce, che li rendevano intrinsecamente opachi. La pulizia dei tessuti rende trasparente il campione biologico intatto riducendo al minimo queste limitazioni. I recenti sviluppi nelle tecniche di pulizia dei tessuti consentono l'imaging 3D ad alta risoluzione di tessuti trasparenti non sezionati per fornire una visione considerevole della microarchitettura cellulare e strutturale di interi organi a risoluzione micrometrica, consentendo così la definizione di reti di connettività anatomica.

L'aterosclerosi coinvolge tre strati della parete arteriosa, tra cui lo strato intimo interno, lo strato medio medio e lo strato esterno del tessuto connettivo, che è chiamato avventizia. Le placche aterosclerotiche nello strato interno delle arterie sono state un obiettivo convenzionale della ricerca per decenni ^1,2. Tuttavia, lo strato avventizio contiene vasi sanguigni, vasi linfatici e fibre nervose del sistema nervoso periferico. Inoltre, l'avventizia è collegata al tessuto adiposo perivascolare e ai componenti del tessuto neuronale, compresi i nervi periferici e i gangli perivascolari ^3,4. È noto che i nervi periferici utilizzano l'avventizia come condotti per raggiungere i tessuti bersaglio distanti e, in effetti, le cellule⁵. I nostri studi recenti hanno fatto avanzare i progressi nella comprensione delle interazioni a più livelli dei principali sistemi biologici, che includono il sistema immunitario, il sistema nervoso e il sistema cardiovascolare. Abbiamo chiamato queste interazioni interfacce neuroimmunitarie-cardiovascolari ^6,7. Durante l'aterogenesi, i componenti della parete arteriosa subiscono una robusta ristrutturazione e rimodellamento. Ad esempio, adiacente alla progressione della placca aterosclerotica nell'intima, si formano aggregati di cellule immunitarie e la neogenesi degli assoni neuronali si verifica nell'avventizia aortica murina ^6,8,9. Con il progredire dell'aterosclerosi, gli aggregati di cellule immunitarie si sviluppano in organi linfoidi terziari arteriosi (ATLO) ben strutturati con aree distinte di cellule T, cellule B e plasmacellule¹⁰. Tuttavia, delineare questi cambiamenti in 3D, l'imaging ad alta risoluzione del tessuto intatto è stato difficile a causa dell'insufficiente permeabilizzazione della membrana e della diffusione intrinseca della luce¹¹. Gli approcci di pulizia tissutale hanno superato i principali limiti degli approcci istologici convenzionali 11,12,13,14,15 con una maggiore penetrazione degli anticorpi per raggiungere in profondità i tessuti o gli organi intatti regolando uniformemente l'indice di rifrazione (RI), portando a immagini con risoluzione micrometrica con una maggiore profondità di imaging nei voxel. Le RI dei campioni possono essere abbinate al glicerolo (RI 1.46) o all'olio da immersione (RI 1.52), riducendo così notevolmente la dispersione della luce e le aberrazioni sferiche, consentendo un'alta risoluzione. Recenti progressi nelle tecniche di pulizia dell'intero organo o dell'intero corpo di tessuto, come il 2,2-tiodietanolo a base acquosa (TDE) e l'imaging 3D di organi purificati con solvente (iDISCO) abilitati dall'immunomarcatura, insieme alle tecniche di imaging volumetrico (tra cui l'imaging confocale, multifotonico e al microscopio a foglio di luce) hanno permesso di ricostruire la microanatomia dell'architettura vascolare costruendo il loro atlante di connettività^11,16. La visualizzazione di queste connessioni cellulari e strutturali in 3D può fornire nuove intuizioni per rispondere a domande biologiche finora senza risposta.

Protocollo

Il presente studio è stato condotto secondo le linee guida del comitato locale e nazionale per l'uso e la cura degli animali. Nel presente studio sono stati utilizzati topi maschi iperlipidemici Apoe^-/- su sfondo C57BL/6J mantenuti con una dieta standard per roditori che sviluppano spontaneamente l'aterosclerosi durante l'invecchiamento.

1. Imaging a montaggio intero dell'aorta isolata e della pulizia TDE

1. Preparazione dei tessuti
   1. Preparare l'anestetico a 150 mg/kg di ketamina e 30 mg/kg di xilazina (vedere la tabella dei materiali) per topo. Anestetizzare profondamente i topi mediante iniezione intraperitoneale e confermarlo con la mancanza di reazione al test del dolore profondo.
      NOTA: La concentrazione e il volume di iniezione sono i seguenti: ketamina 100 mg/mL; Xilazina 20 mg/mL; Volume di iniezione 50:50 miscela in volume di ketamina e xilazina a 3 μL/g.
   2. Posiziona il mouse su una piastra di schiuma ricoperta di carta assorbente chirurgica e fissa braccia e gambe in posizione supina con del nastro adesivo. Disinfettare il torace con etanolo al 75% (vedere Tabella dei materiali) e prelevare il sangue attraverso il ventricolo sinistro con una siringa monouso da 1 ml per rimuovere il sangue per una migliore perfusione.
      NOTA: È possibile utilizzare anche il prelievo di sangue cardiaco tramite toracotomia.
   3. Praticare un'incisione sulla linea mediana sul torace per esporre il cuore e una piccola incisione nell'atrio destro per consentire la perfusione transcardiaca. Perfondere il topo attraverso il ventricolo sinistro con 10 mL di acido etilendiamminetraacetico 5 mM (EDTA; vedere Tabella dei materiali) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 5 minuti, seguiti da 20 mL di PBS per 5-10 minuti fino a quando il sangue non viene espulso. Infine, perfondere con 10 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% per 20 minuti.
      NOTA: Tutte le procedure possono essere eseguite con una pompa di perfusione peristaltica con pressione di 100-125 mm Hg a temperatura ambiente (RT). L'ago di perfusione viene inserito nel cuore del topo attraverso lo stesso foro dell'estrazione del sangue.
   4. Rimuovere gli organi interni, tra cui milza, fegato, polmone e organi gastrointestinali e riproduttivi, utilizzando strumenti chirurgici. Mantenere intatti il cuore, l'aorta e i reni in situ.
      NOTA: Gli strumenti chirurgici utilizzati per la dissezione e la rimozione degli organi sono le forbici da dissezione, le forbici dell'iride fine, le forbici a molla, le pinze smussate, le pinze curve e le pinze fini curve.
   5. Esporre l'intera aorta dall'aorta ascendente alla biforcazione iliaca sotto lo stereomicroscopio da dissezione (ingrandimento 30-40x). Rimuovere con cura il timo e il tessuto adiposo senza ferire l'aorta.
      NOTA: Fare attenzione a non tagliare l'aorta. Per i topi Apoe^-/- , mantenere il tessuto adiposo perivascolare circondato minimo dell'aorta per la struttura collegata.
   6. Raccogli l'intera aorta in una capsula di Petri riempita di PBS. Separare l'aorta in diversi segmenti e dividere l'intera aorta longitudinalmente utilizzando un'iride o una forbice a molla per esporre la superficie intimale seguendo la sequenza e la direzione indicate nella Figura 1A per la pulizia TDE.
   7. Appuntare l'aorta en face sulla lastra di cera nera piatta a forma di Y, come indicato nella Figura 1A. Postfissarlo in PFA al 4% per una notte a 4 °C.
      NOTA: Fissare l'aorta alla piastra di cera prima del fissaggio per evitare che si pieghi e si arricci nei passaggi successivi.
   8. Sganciare l'aorta e trasferirla nel PBS. Lavare accuratamente l'aorta per 5 minuti per 5 volte.
      NOTA: Trasferire l'aorta in diversi tubi riempiti di PBS ogni volta per il lavaggio.
2. Colorazione degli anticorpi per l'aorta en-face
   NOTA: Tutte le fasi di incubazione vengono eseguite in provette da 2 mL con chiusura di sicurezza con rotazione delicata o agitazione a RT.
   1. Trasferire l'aorta fissa in una soluzione bloccante per 2 ore per il blocco e la permeabilizzazione.
      NOTA: La soluzione bloccante varia in base agli anticorpi primari e secondari. Ad esempio, soluzione bloccante: 0,5 mg/mL CD16/32 (1:100), 10% siero d'asina normale, 2% Triton X-100 in PBS (vedi Tabella dei materiali)
   2. Incubare l'aorta con gli anticorpi primari nella soluzione bloccante sopra descritta (passaggio 1.2.1), ad esempio CD3e (diluizione 1:100), NF200 (diluizione 1:200) e B220 (diluizione 1:200) per 24 ore (vedere la Tabella dei materiali). Lavare l'aorta in PBS per 5 minuti per 5 volte.
   3. Incubare l'aorta con anticorpi secondari in siero d'asino normale al 10% (diluizione 1:300) e 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; 1 mg/mL) per la colorazione nucleare durante la notte (vedere la Tabella dei materiali). Lavare l'aorta in PBS per 5 minuti 5 volte e conservare l'aorta in PBS a 4 °C fino alla procedura di pulizia dei tessuti.
      NOTA: Trasferire l'aorta in diversi tubi riempiti di PBS ogni volta per il lavaggio. Copri i tubi con un foglio di alluminio per tenerli al buio per il passaggio 1.2.3.
3. Pulizia dei tessuti TDE
   NOTA: Tutte le fasi di incubazione vengono eseguite in provette da 2 mL con chiusura di sicurezza, che ruotano delicatamente a RT e coperte con un foglio di alluminio al buio. Le soluzioni di lavoro TDE (vedi Tabella dei materiali) sono altamente permeabili e devono essere maneggiate con cura in una cappa aspirante. Raccogliere e smaltire i rifiuti secondo le normative locali.
   1. Trasferire l'aorta colorata in soluzioni di lavoro al 20% di TDE e incubare per 1 ora.
   2. Trasferire l'aorta in soluzioni di lavoro al 47% di TDE e incubare per 12 ore. Trasferire l'aorta in soluzioni di lavoro al 60% di TDE e incubare per 24-36 ore fino a quando i campioni diventano trasparenti alla luce visibile per corrispondere al RI.
   3. Conservare l'aorta in TDE al 60% a RT al buio fino all'imaging.
      NOTA: Aggiornare le soluzioni funzionanti ogni 30 minuti per il breve periodo di incubazione (ad esempio, passaggio 1.3.1) e ogni 4 ore per il lungo periodo di incubazione (ad esempio, passaggio 1.3.2). Il tempo di incubazione per ogni fase può essere regolato in base alle dimensioni del tessuto per ottenere una migliore penetrazione degli anticorpi o una trasparenza di eliminazione. Per l'aorta di topo Apoe^-/- circondata da tessuto adiposo, il tempo di incubazione deve essere adeguatamente prolungato.
4. Imaging dell'aorta che chiarisce il TDE utilizzando il microscopio a scansione laser confocale (CLSM)
   1. Utilizzare pozzetti distanziatori rettangolari adesivi su entrambi i lati disponibili in commercio con uno spessore di 0,2 mm (vedere la Tabella dei materiali). Attaccare il pozzetto su un vetrino pulito e trasferire l'aorta liberata. Assicurarsi che l'avventizia aortica sia rivolta verso il vetrino coprioggetti.
      NOTA: Picchiettare delicatamente l'aorta en face con il lato abluminale dell'aorta en face in alto utilizzando una pinza angolata. Se necessario, impilare più pozzetti distanziatori per immagini in modo che corrispondano alle dimensioni del tessuto.
   2. Montare l'aorta con gocce di soluzione di TDE al 60%. Fissare con cura un vetrino coprioggetti al pozzetto, evitando bolle d'aria tra il campione e il vetrino coprioggetti.
      NOTA: Rimuovere con cautela le bolle con un ago prima del vetrino coprioggetti. Non utilizzare una quantità eccessiva di soluzione di montaggio, poiché il campione potrebbe galleggiare.
   3. Utilizzare uno strumento CLSM invertito (vedi Tabella dei materiali) dotato di un obiettivo a immersione (multiplo) 20x (NA: 0,75).
      NOTA: Il CLSM consente l'imaging volumetrico fino a 70 μm di profondità con una risoluzione più elevata, necessaria per l'analisi del diametro del nervo e dell'interazione nervo-cellula immunitaria nell'avventizia aortica.
   4. Selezionare l'obiettivo a immersione (olio) 20x/0,75. Sintonizzare i rilevatori a diodi ibridi in base ai coloranti colorati. Regolare le impostazioni di visualizzazione e selezionare il formato XY 1024 x 1024 pixel per l'imaging.
      NOTA: Un obiettivo a immersione in olio cattura i segnali meglio dell'acqua.
   5. Far cadere l'olio da immersione (con glicerolo) in modo uniforme lungo l'aorta sul vetrino coprioggetti. Spostare grossolanamente l'obiettivo 63x verso il campione fino a toccare l'olio da immersione/vetrino coprioggetti.
   6. Spostare l'obiettivo 63x sotto il microscopio per individuare la regione di interesse. Acquisizione di Z-stack dal lato avventizio dell'aorta en face con incrementi di 2-4 μm fino a 60 μm di profondità per l'imaging 3D.
   7. Assegna un nome al file con i dettagli del campione, i dettagli della scansione e salva i dati.
5. Imaging dell'aorta di pulizia TDE utilizzando un microscopio multifotone
   1. Seguire i passaggi 1.4.1-1.4.2 per montare l'aorta en face sul vetrino.
   2. Utilizzare un microscopio multifotone verticale (vedi Tabella dei materiali) dotato di un obiettivo 20x (immersione in acqua, NA: 1,00, distanza di lavoro = 2 mm), che consente l'imaging volumetrico fino a 1,5 mm di profondità.
   3. Acquisizione di Z-stack dal lato abluminale con passo di 10-15 μm fino a 700 μm di profondità. Assegnare un nome al file e salvare i dati come indicato nel passaggio 1.4.7.

2. Immunocolorazione di tutto il corpo e pulizia dei tessuti iDISCO

1. Preparazione dei tessuti
   1. Seguire i passaggi 1.1.1-1.1.3 sopra per l'anestesia, il fissaggio del mouse e la perfusione.
   2. Rimuovere la pelle e gli organi interni, tra cui milza, fegato, polmone e organi gastrointestinali e riproduttivi, utilizzando strumenti chirurgici. Mantenere intatti il cuore, l'aorta e i reni in situ.
   3. Sezionare la parte del corpo al di sopra del livello del diaframma e fissare la parte inferiore del corpo con PFA al 4% per 1-2 giorni a 4 °C.
      NOTA: Eseguire la fissazione, i lavaggi e le incubazioni in provette da 50 mL su uno shaker che ruota delicatamente. Rinfrescare la soluzione in nuove provette per 2-3 volte.
   4. Lavare accuratamente il campione per 10 minuti 3 volte a RT.
      NOTA: Trasferire ogni volta l'aorta in diversi tubi riempiti di PBS.
   5. Incubare il campione in una soluzione di imaging cervello/corpo al 20% chiara e non ostruita e in una soluzione di analisi computazionale (CUBIC) per 48 ore per la decolorazione.
      NOTA: Per una soluzione cubica al 20%, sciogliere 25 g di urea in 15 mL di Triton X-100 e 28 mL di Quadrol e aggiungere PBS al volume finale di 100 mL. Prepararlo nella cappa poiché gli ingredienti sono stimolanti (vedi Tabella dei Materiali).
   6. Lavare accuratamente il campione per 1 ora cinque volte in PBS a RT.
2. Colorazione degli anticorpi
   NOTA: Tutte le fasi di incubazione vengono eseguite in provette da 50 mL con rotazione delicata o agitazione a 4 °C.
   1. Incubare il campione in una soluzione di PBS-gelatina-Triton X-100-siero (PGST) per una notte per la permeabilizzazione e il blocco.
      NOTA: La soluzione bloccante varia in base agli anticorpi. Ad esempio, soluzione bloccante: PBS-gelatina-Triton X-100-siero (PGST, vedere Tabella dei materiali) soluzione: 0,2% di gelatina per pelle suina, 0,5% di Triton X-100 e 5% di siero di capra in PBS.
   2. Incubare il campione con anticorpi primari in soluzione PGST, ad esempio NF200 (diluizione 1:200, vedere la Tabella dei materiali) a 4 °C, e agitare delicatamente per 10-12 giorni. Quindi, lavare accuratamente il campione in PGST per 1 ora e 5 volte a RT.
   3. Incubare il campione con una soluzione di anticorpi secondari (diluizione 1:300) e DAPI (1 mg/mL) in PGST a 4 °C per 7 giorni.
   4. Lavare accuratamente il campione in PGST per 1 ora e 5 volte in RT. Trasferire il campione in PBS e conservare l'aorta in PBS a 4 °C per ulteriori passaggi.
      NOTA: Coprire i tubi con un foglio di alluminio per mantenerli scuri per i passaggi 2.2.3-2.2.4.
3. Pulizia dei tessuti iDISCO modificata
   NOTA: Durante lo svuotamento, i tubi devono essere coperti con un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento/spegnimento del segnale dovuto all'esposizione diretta alla luce naturale/artificiale. Tutti i reagenti organici utilizzati nella pulizia DISCO sono dannosi e tutte le fasi di pulizia devono essere eseguite in una cappa aspirante. Indossare un camice da laboratorio, guanti e una maschera quando si maneggiano i reagenti per evitare l'inalazione e il contatto con la pelle e gli occhi. Raccogliere e scaricare i rifiuti di sgombero negli appositi contenitori per rifiuti nel cofano.
   1. Trasferire i campioni colorati dal passaggio 2.2.4 a una serie di concentrazioni aumentate di tetraidrofurano (THF, vedere Tabella dei materiali) soluzioni di lavoro per la disidratazione, ovvero 50%, 70%, 90% e 100% (due volte il 100%). Incubare per 12 ore per concentrazione.
      NOTA: Diluire il reagente THF (99%-100%) in acqua distillata per soluzioni di lavoro di diverse concentrazioni nella cappa. Aggiorna le soluzioni di lavoro ogni 6 ore.
   2. Trasferire il campione in una soluzione di diclorometano assoluto (DCM, vedere Tabella dei materiali) per 3 ore per la rimozione dei lipidi.
   3. Trasferire il campione nella soluzione di lavoro BABB (benzil-alcol-benzil-benzoato) compatibile con RI (vedere la Tabella dei materiali). Incubare per 3-6 ore fino a quando il tessuto è traslucido e per lo più trasparente alla luce visibile.
      NOTA: Per preparare la soluzione di lavoro BABB, mescolare 1 parte di alcol benzilico e 2 parti di benzoato di benzile (1:2) in una bottiglia di vetro. Agitare delicatamente per 5 minuti nella cappa.
4. Imaging del tessuto di pulizia iDISCO utilizzando un microscopio a foglio luminoso
   NOTA: Acquisire l'immagine del campione cancellato non appena si ottiene una trasparenza ottimale. Per l'imaging viene utilizzato un microscopio a foglio luminoso, come un ultramicroscopio-II (vedi Tabella dei materiali). Riempire il serbatoio di imaging con la soluzione di pulizia finale, la soluzione BABB. Fare attenzione a non versare BABB sullo strumento per evitare danni allo strumento.
   1. Utilizzare un obiettivo pneumatico 1x per immagini a basso ingrandimento che coprono l'intera larghezza dell'intero campione. Trasferire delicatamente il campione dalla soluzione di chiarificazione su un panno di carta e asciugarlo brevemente.
      NOTA: Utilizzare una pinza smussata per evitare di schiacciare il campione.
   2. Selezionare un portacampioni di dimensioni adeguate in base alle dimensioni del campione/tessuto e fissare il lato posteriore del campione al supporto del campione con la supercolla.
      NOTA: Attendere 1-2 minuti fino a quando il campione non è saldamente fissato al supporto del campione.
   3. Riempire il serbatoio di imaging del microscopio a foglio luminoso con la soluzione BABB e posizionare delicatamente il campione al suo interno. Regolare il portacampioni per assicurarsi che il campione sia perpendicolare al foglio luminoso e illuminato correttamente.
   4. Abbassare l'obiettivo per mettere a fuoco il campione e regolare le impostazioni di visualizzazione durante la messa a fuoco per visualizzare correttamente il campione. Selezionare i fogli luminosi appropriati nel software del microscopio e regolarne la larghezza per illuminare uniformemente l'intero campo visivo.
      NOTA: In un sistema a ultramicroscopio con illuminazione laser su entrambi i lati, iniziare allineando e focalizzando il laser su un lato. Una volta impostati entrambi i lati, attivare entrambi i laser laterali per osservare un'immagine di scansione unita da entrambe le illuminazioni.
   5. Selezionare un canale rosso lontano (680 nm) per visualizzare le strutture neuronali colorate con NF200 e un canale di autofluorescenza (488 nm) per visualizzare l'aorta e i tessuti connettivi non colorati. Regolare la potenza del laser in base all'intensità del segnale fluorescente per un rapporto segnale/rumore ottimale, al tempo di esposizione e alla larghezza del foglio o dei fogli luminosi.
   6. Selezionare la modalità di scansione x-y-z. Impostare la scansione z-stack con un passo z di 2-8 μm e selezionare la sovrapposizione del 25%-60% lungo l'asse y longitudinale delle scansioni tile (16 bit) che copre le superfici ventrali e dorsali dei campioni per visualizzare l'intero volume del campione (fino a 6-8 mm di profondità).
   7. Assegna un nome alla scansione con informazioni dettagliate, tra cui la data della scansione, il nome del campione, l'anticorpo utilizzato, l'obiettivo, il fattore di zoom, i passi z e i laser utilizzati. Salvare i dati.
   8. Passa a un ingrandimento maggiore (2x o 4x) tramite la funzione di zoom per visualizzare specifiche regioni del corpo di interesse.
   9. Seguire i passaggi 2.4.4-2.4.7 sopra per l'imaging e salvare i dati.

3. Elaborazione e analisi delle immagini

NOTA: Per l'elaborazione è necessaria una workstation di elaborazione ad alta potenza. Garantire il backup dei dati immediatamente dopo l'elaborazione a causa dell'elevato volume di imaging (5-100 GB per immagine).

1. Elaborazione di immagini CLSM e multifotone
   1. Carica le immagini affiancate Z-stack da microscopi CLSM e multifotone sulla workstation di elaborazione delle immagini dotata di software Las X, Imaris (software di analisi delle immagini) o Fiji per la visualizzazione, la segmentazione e la quantificazione 3D e bidimensionale (2D).
   2. Per codificare a colori la profondità del volume di una cella o di una struttura, utilizzare un software di ripristino dell'immagine (vedere la Tabella dei materiali) per deconvoluzione dell'immagine grezza e generare una proiezione di massima intensità dei dati deconvoluti utilizzando la codifica temporale a colori a Las X o nelle Figi.
2. Elaborazione delle immagini di fogli leggeri
   1. Carica la serie di immagini TIFF affiancate Z-stack nel software Fiji. Unisci le immagini con il plug-in di cucitura delle Fiji e salva le immagini cucite in formato TIFF.
      NOTA: Se necessario, comprimere le immagini unite in formato LZW per consentire un'elaborazione rapida con diversi software.
   2. Caricare le immagini unite nel software di visualizzazione 3D (vedere Tabella dei materiali) per la segmentazione delle immagini. Tracciare manualmente le strutture neuronali e vascolari sull'asse x-y-z. Per il tracciamento manuale di piccole fibre nervose, selezionare manualmente i segnali NF200⁺ pixel per pixel in ogni piano z lungo l'intero percorso della fibra nervosa tra l'aorta e i gangli.
   3. Carica le immagini pre-elaborate nel software di analisi delle immagini (vedi Tabella dei materiali) per la generazione di video, la visualizzazione 2D e 3D delle immagini.
   4. Utilizzare l'autofluorescenza per segmentare l'aorta e i tessuti connettivi, compresi i linfonodi e i muscoli, nel software di analisi delle immagini. Applica pseudocolori separati nel software di analisi delle immagini per visualizzare segmenti aortici distinti come la parete aortica e la placca.
   5. Utilizzare la funzione di equalizzazione adattiva dell'istogramma a contrasto limitato (CLAHE) nel software Fiji per migliorare il contrasto locale sullo sfondo delle immagini elaborate.

Risultati

Per dimostrare la microanatomia dell'aorta sana e malata intatta e per rivelare le connettività fisiche tra il sistema immunitario, il sistema nervoso e il sistema cardiovascolare in modelli murini di aterosclerosi, abbiamo utilizzato due approcci complementari di pulizia tissutale: la pulizia TDE dell'aorta isolata e la pulizia iDISCO dell'intero topo (Figura 1). Dopo l'immunocolorazione a montaggio intero, l'aorta frontale è stata ripulita con u...

Discussione

L'aterosclerosi può essere vista come una malattia infiammatoria transmurale delle arterie che coinvolge tutti e tre gli strati della parete arteriosa. Inoltre, le arterie sono circondate dai tessuti adiposi e neuronali perivascolari. Durante la progressione dell'aterosclerosi, ciascuno di questi tessuti subisce notevoli alterazioni cellulari e strutturali, che richiedono metodi per acquisire l'accesso ottico subcellulare ai tessuti intatti che circondano le arterie sane e malate. Quest...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2’-thiodiethanol (TDE)	Sigma	166782	Clearing reagent
Amira	Thermo Fisher Scientific		3D visualization software; Image processing software used for manual segmentation and tracing in 3D images
Benzyl alcohol	Sigma	W213713	Clearing reagent
Benzyl benzoate	Sigma	B6630	Clearing reagent
CD16/32	eBioscience	14-0161-82	Blocking solution
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	TCS- SP8 3X	Imaging device for multidimensional high-resolution imaging of intact biological tissues or sections with high specificity at subcellular resolution.
DAPI	Invitrogen	D3571	Nuclei marker
Dichloromethane (DCM)	Sigma	270997	Clearing reagent
Dissecting pan-black wax	Thermo Scientific	S17432	Aorta dissection and fixation
Dissection stereomicroscope	Leica Microsystems	Stemi 2000	Mouse organ dissection
Ethanol	Sigma	E7023	Defection
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Roth	8040.1	Perfusion buffer
Fiji	(ImageJ, NIH)		Open source image processing software for 2D and 3D images
Goat anti-Hamster IgG, Cy3	Dianova	127-165-099	Secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 680	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	A-21109	Secondary antibody
Goat anti-Rat IgG, Cy5	Dianova	712-175-150	Secondary antibody
Hamster Anti-CD3e	BD Bioscience	145-2C11	Pan-T cell marker
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging, The Netherlands	Version 19.10	Image restoration software; Image processing software used mainly for deconvolution of 2D and 3D images
Image processing workstation	MIFCOM	MIFCOM X5	Image processing workstation equipped with all image processing software including Leica application suite X, Fiji, and Imaris for post-processing of images acquired by confocal, multiphoton and light sheet microscopes
Imaris	Bitplane	Version 8.4	Image analysis software; Image processing software used for automated segmentation of 3D images
Incubator and rotator	Marshall Scientific	Innova 4230	Incubation and rotation device during tissue clearing
iSpacer	Sunjin Lab	IS4020	Rectangular well as the sample holder
Ketamine	Livisto		Anesthetic
Leica Application Suite X (LAS-X)	Leica Microsystems	Version 3.5	Image processing software for the images acquired with Leica microscope
Light microscope	Leica Microsystems	DM LB	Imaging device for bright filed imaging
Light sheet  microscope	LaVision BioTech	Ultramicroscope II	Imaging technique for fast, high-resolution imaging of large biological specimens or whole mouse with low light exposure by rapidly acquiring images of thin optical sections.
Multiphoton microscopy	Leica Microsystems	TCS-SP5II MP	Imaging modality for multidimensional, high-resolution imaging of intact and viable biological tissues at sub-cellular and molecular level over prolonged periods of time, deep in the sample and with minimal invasion.
Normal goat serum	Sigma	G9023	Blocking solution
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P-6148	Fixation
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	Washing buffer
Porcine skin gelatin	Sigma	G1890	Incubation buffer
Quadrol	Sigma	122262	CUBIC clearing reagent
Rabbit Anti-NF200	Sigma	N4142	Pan-neuronal marker
Rat Anti-B220	BD Bioscience	RA3-6B2	Pan-B cell marker
Sucrose	Sigma	90M003524V	Dehydration
Sytox	Thermo Fisher Scientific	S11380	Nuclei marker
Tetrahydrofuran	Sigma	401757	Clearing reagent
Triton X-100	Roth	3051.1	Penetration
Urea	Sigma	U5128	CUBIC clearing reagent
Xylene	Fisher Chemical	x/0250/17	Anesthetic