Imaging del calcio a singola cellula per lo studio dell'attivazione dei canali ionici del calcio

Riepilogo

Questo articolo presenta un metodo per il monitoraggio quantitativo in tempo reale delle concentrazioni di ioni calcio (Ca²⁺) nelle cellule utilizzando l'imaging Ca²⁺ a singola cellula con il colorante Fura-2/AM. Questa tecnica consente un caricamento efficiente del colorante e un calcolo accurato dei livelli di Ca²⁺ attraverso i rapporti di intensità della fluorescenza, rendendola un approccio semplice e rapido per le applicazioni di ricerca.

Abstract

L'imaging del Ca²⁺ a singola cellula è essenziale per lo studio dei canali del Ca²⁺ attivati da varie stimolazioni come temperatura, voltaggio, composto nativo e sostanze chimiche ecc. Si basa principalmente sulla tecnologia di imaging al microscopio e sul relativo indicatore Ca²⁺ Fura-2/AM (AM è l'abbreviazione di Acetossimetilestere). All'interno delle cellule, Fura-2/AM viene idrolizzato dalle esterasi in Fura-2, che può legarsi in modo reversibile con il Ca²⁺ citoplasmatico libero. La lunghezza d'onda massima di eccitazione passa da 380 nm a 340 nm (quando è saturo di Ca²⁺) al momento del legame. L'intensità della fluorescenza emessa è quantitativamente correlata alla concentrazione di Ca²⁺ legato. Misurando il rapporto 340/380, è possibile determinare la concentrazione di Ca²⁺ nel citoplasma, eliminando gli errori causati dalle variazioni dell'efficienza di carico della sonda fluorescente tra diversi campioni. Questa tecnologia consente il monitoraggio in tempo reale, quantitativo e simultaneo delle variazioni di Ca²⁺ in più cellule. I risultati vengono memorizzati in ". XLSX" per l'analisi successiva, che è veloce e genera curve di modifica intuitive, migliorando notevolmente l'efficienza di rilevamento. Da diverse prospettive sperimentali, questo articolo elenca l'uso di questa tecnologia per rilevare segnali di Ca²⁺ in cellule con proteine canale endogene o sovraespresse. Nel frattempo, sono stati mostrati e confrontati anche diversi metodi per attivare le cellule. L'obiettivo è quello di fornire ai lettori una comprensione più chiara dell'uso e delle applicazioni dell'imaging Ca²⁺ a singola cellula.

Introduzione

Il Ca²⁺ svolge un ruolo cruciale nella trasduzione del segnale cellulare, regolando varie funzioni cellulari come la contrazione muscolare¹, la conduzione nervosa², la secrezione³ e l'espressione genica⁴, influenzando così molteplici processi fisiologici. Concentrazioni anomale di Ca²⁺ possono portare a malattie come aritmie⁵, disturbi della coagulazione⁶ e squilibri ormonali⁷. Pertanto, lo studio dei meccanismi delle variazioni intracellulari della concentrazione di Ca²⁺ è di fondamentale importanza.

Vari canali ionici sono coinvolti nella regolazione della concentrazione di Ca²⁺ nelle cellule, inclusi i canali⁸ del calcio attivato con rilascio di calcio altamente selettivo per il Ca²⁺ (CRAC) e i canali cationici non selettivi della famiglia TRP⁹. Questi canali ionici possono essere attivati da stimoli come la temperatura¹⁰, i composti e i principi attivi presenti nella medicina tradizionale cinese¹¹, svolgendo un ruolo cruciale in vari processi fisiologici correlati al Ca²⁺.

Un monitoraggio efficace delle variazioni intracellulari della concentrazione di Ca²⁺ è essenziale per lo studio dei canali ionici correlati al Ca²⁺, in particolare nel campo della medicina tradizionale cinese, dove la regolazione del segnale del calcio gioca un ruolo centrale in molti approcci terapeutici. Attualmente, i metodi principali per misurare il Ca²⁺ intracellulare possono essere classificati in due tipi: misure elettriche e ottiche. L'approccio di misurazione elettrica utilizza la tecnica del patch-clamp per valutare le variazioni del potenziale di membrana cellulare dovute all'afflusso di Ca^{2+ 12}.

Nella misurazione ottica, le sonde fluorescenti si legano specificamente al Ca²⁺, consentendo ai ricercatori di tracciare i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza cellulare. I metodi ottici comuni includono tecniche basate su proteine fluorescenti e coloranti fluorescenti. Nei metodi basati sulle proteine fluorescenti, i ricercatori possono sovraesprimere proteine fluorescenti sensibili al Ca²⁺ come Cameleon¹³ e GCaMP¹⁴ nelle cellule e monitorare i cambiamenti del segnale di fluorescenza utilizzando la microscopia a fluorescenza o la citometria a flusso per osservare i cambiamenti nelle concentrazioni citoplasmatiche di Ca²⁺ . Inoltre, i ricercatori possono sovraesprimere queste proteine nei topi e utilizzare la microscopia a fluorescenza a due fotoni per il monitoraggio in tempo reale in vivo o a livello tissutale delle concentrazioni intracellulari di Ca²⁺ , fornendo un'alta risoluzione e una penetrazione profonda dei tessuti¹⁰.

Per i metodi basati su coloranti fluorescenti, le sonde Ca²⁺ comunemente utilizzate includono Fluo-3/AM, Fluo-4/AM e Fura-2/AM¹⁰. I ricercatori incubano le cellule in una soluzione contenente queste sonde fluorescenti, che attraversano la membrana cellulare e vengono scisse dalle esterasi intracellulari per formare composti attivi (ad esempio, Fluo-3, Fluo-4 e Fura-2) che rimangono all'interno della cellula. Queste sonde mostrano una fluorescenza minima nella loro forma di ligando libero, ma emettono una forte fluorescenza quando sono legate al Ca²⁺ intracellulare, indicando così cambiamenti nelle concentrazioni citoplasmatiche di Ca²⁺ . Rispetto ad altre proteine fluorescenti e coloranti, Fura-2 è tipicamente eccitato a lunghezze d'onda di 340 nm e 380 nm. Quando legato al Ca²⁺ libero intracellulare, Fura-2 subisce uno spostamento di assorbimento, spostando il picco della lunghezza d'onda di eccitazione da 380 nm a 340 nm, mentre il picco di emissione vicino a 510 nm rimane invariato. Esiste una relazione quantitativa tra l'intensità della fluorescenza e la concentrazione di Ca²⁺ legata, che consente di calcolare la concentrazione intracellulare di Ca²⁺ misurando il rapporto di intensità della fluorescenza a queste due lunghezze d'onda di eccitazione. Le misure del rapporto riducono gli effetti del fotosbiancamento, della perdita della sonda fluorescente, del carico irregolare e delle differenze di spessore delle celle, producendo risultati più affidabili e riproducibili (Figura 1).

I sistemi di imaging a cellula singola di Ca²⁺ utilizzano principalmente tecniche di microscopia e l'indicatore di Ca²⁺ Fura-2/AM per rilevare le concentrazioni intracellulari di Ca²⁺ . Questi sistemi comprendono un microscopio a fluorescenza, una sorgente di luce per l'imaging al Ca²⁺ e un software per l'imaging a fluorescenza, che consente il monitoraggio quantitativo in tempo reale delle variazioni del Ca²⁺ nel citoplasma di più cellule contemporaneamente (fino a 50 cellule per campo visivo). I risultati vengono salvati in formato ".xlsx" per l'analisi successiva. Il sistema offre una velocità di analisi rapida (circa 1 minuto per l'analisi di un gruppo di cellule all'interno di un campo visivo) e genera curve di variazione intuitive, migliorando significativamente l'efficienza di rilevamento. L'imaging a singola cellula di Ca²⁺ è un approccio tecnico essenziale per lo studio dei canali correlati al Ca²⁺ e ha un valore considerevole nella ricerca biomedica correlata ai canali ionici. Si prevede che la sua applicazione nella tecnologia di imaging del calcio a singola cellula farà progredire notevolmente la ricerca sui meccanismi alla base della medicina tradizionale cinese.

Protocollo

I metodi sperimentali sono stati approvati e hanno seguito le linee guida IACUC dell'Università Tsinghua e dell'Università di Medicina Cinese di Pechino. Questo protocollo introduce metodi di imaging Ca²⁺ a cellula singola per vari tipi di cellule, inclusi i cheratinociti primari isolati dalla pelle di diversi topi neonati (entro tre giorni dalla nascita, con cucciolate randomizzate per sesso, topi C57BL/6). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione delle cellule

NOTA: Le cellule primarie, le linee cellulari con geni bersaglio endogeni o quelle trasfettate con plasmidi sovraespressi sono tutte adatte per l'imaging di Ca²⁺ a singola cellula. I plasmidi utilizzati in questo studio sono stati ottenuti dal laboratorio del professor Xiao Bailong presso l'Università Tsinghua. Questi plasmidi sono stati costruiti incorporando sequenze della proteina fluorescente GFP con STIM1 umano, della proteina fluorescente DsRed con Orai1 umano, della proteina fluorescente mRuby con TRPV1 di coniglio, nonché della proteina fluorescente rossa mCherry in vettori plasmidici fagici¹⁰.

1. Preparare vetrini sterili con un diametro di 8 mm in una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere 500 μL di tampone poli-D-lisina (PDL) (50 μg/mL in DPBS) a ciascun pozzetto.
2. Incubare i vetrini a 37 °C per 1 ora per consentire il rivestimento, quindi scartare la soluzione di rivestimento utilizzando una pipetta.
3. Lavare le diapositive una volta con DPBS e metterle da parte per un uso successivo.
4. Coltura separata di cellule primarie e linee cellulari in base ai loro specifici metodi di coltivazione¹⁰.
5. Seminare le cellule sulla piastra preparata a 24 pozzetti a una densità di circa 1,5 x 10⁵ celle per pozzetto. Utilizzare le cellule per l'imaging del Ca²⁺ una volta che hanno aderito al vetrino coprioggetti.
6. Per le cellule che sovraesprimono plasmidi, trasfettare^10,15 il plasmide bersaglio (1 μg/pozzetto) utilizzando il reagente di trasfezione Lipofectamine 2000 (o Lipofectamine 3000) in rapporto 1:1 e incubare in un incubatore di coltura cellulare per circa 24 ore.
   NOTA: Un tempo di incubazione più lungo può essere necessario per proteine espresse più grandi.

2. Preparazione della soluzione di lavoro Fura-2/AM

1. Aggiungere 50 μL di dimetilsolfossido (DMSO) a una provetta contenente 50 μg di polvere di Fura-2/AM e mescolare bene per preparare una soluzione madre da 1 μg/μL di Fura-2/AM.
2. Miscelare la soluzione madre di Fura-2/AM e Pluronic F-127 nel tampone di Hank contenente 1,3 mM di Ca²⁺.
   NOTA: La concentrazione finale di Fura-2/AM e Pluronic F-127 nella soluzione di lavoro è di 2,5 μg/mL. Il tampone di Hank viene preparato aggiungendo 10 mM di HEPES a 1x tampone HBSS.
3. Utilizzare un foglio di alluminio per proteggere la soluzione di lavoro Fura-2/AM dalla luce.

3. Pretrattamento cellulare per l'imaging di Ca²⁺ a singola cellula

1. Trasferire i vetrini con le celle in una nuova piastra a 24 pozzetti contenente il tampone di Hank per il lavaggio.
2. Eliminare il tampone utilizzando una pipetta e aggiungere 500 μl di tampone di lavoro Fura-2/AM a ciascun pozzetto.
3. Incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti per consentire il caricamento della sonda.
4. Rimuovere il tampone di lavoro Fura-2/AM e lavare le celle tre volte con il tampone di Hank per eliminare l'eccesso di Fura-2/AM. Le celle sono ora pronte per l'uso.

4. Avvio del sistema di imaging Ca²⁺

NOTA: In questo studio, viene utilizzato un microscopio a fluorescenza per l'imaging Ca²⁺ .

1. Avviare i seguenti componenti in sequenza: luce DG4 (lampada allo xeno), fotocamera, sorgente di luce bianca, controller di tavolino del microscopio, microscopio, computer e software di imaging a fluorescenza.
   NOTA: Se si rileva l'attivazione dei canali ionici in base alla temperatura, accendere anche i seguenti componenti: sistema di perfusione, sistema di riscaldamento, regolatore di temperatura e dispositivo di riscaldamento/raffreddamento a circolazione di liquido.

5. Procedura di risposta cellulare al Ca²⁺

1. Aprire il software di imaging a fluorescenza (vedere Tabella dei materiali).
   1. Scegliere Protocollo, quindi selezionare File, quindi Carica protocollo. Selezionare il protocollo e fare clic su OK.
   2. Configurare l'esperimento (nell'elenco dei menu).
   3. Seleziona Nuovo esperimento.
2. Montare la camera di perfusione sul microscopio.
   NOTA: Abbassare sempre completamente l'obiettivo durante il montaggio o la rimozione delle camere utilizzando la manopola di messa a fuoco ruvida per evitare danni all'obiettivo.
3. Rimuovere i vetrini cellulari trattati con Fura-2/AM e posizionarli nella camera contenente il tampone di Hank.
4. Avviare il sistema di perfusione.
5. Seleziona l'obiettivo DIC 20x e regola la messa a fuoco in condizioni di luce bianca.
6. Fare clic su Cfg Exp sulla barra delle applicazioni.
   1. Selezionare i fluor desiderati per l'imaging.
   2. Determinare la frequenza di acquisizione e le impostazioni di visualizzazione sullo schermo (Acquisire: verificare la presenza di 340, 380, GFP; Intervallo di acquisizione: 1 s; Intervallo di salvataggio: 1 s).
7. Fuoco
   1. Nel pannello di controllo dell'esperimento, fare clic sul pulsante Messa a fuoco .
   2. Regola il tempo di acquisizione (di solito 100 ms) e il guadagno secondo necessità, quindi "salva per questa ondata".
      NOTA: Per la luce UV, utilizzare il guadagno invece del tempo di esposizione.
   3. Scegli la lunghezza d'onda desiderata per la messa a fuoco (ad esempio, 380) e fai clic su Inizia messa a fuoco.
   4. Cambia la vista dal binocolo al computer.
   5. Assicurarsi che un leggero colore verdastro sia visibile attraverso il binocolo.
   6. Metti a fuoco le celle, usando prima la messa a fuoco approssimativa per avvicinare l'obiettivo, quindi la messa a fuoco fine.
      NOTA: Il microscopio emette un segnale acustico se si avvicina troppo al tavolino. In tal caso, abbassare l'obiettivo, riallineare la piastra sul tavolino e mettere nuovamente a fuoco. Riduci al minimo il tempo dedicato alla messa a fuoco per ridurre i danni cellulari indotti dal laser.
   7. Controllare l'intensità della fluorescenza delle cellule durante il processo di focalizzazione.
   8. Regola l'intensità della fluorescenza delle celle modificando il tempo di esposizione e il guadagno.
      NOTA: Il tempo di esposizione e il guadagno per 340 e 380 devono essere coerenti.
   9. Una volta ottenuta una buona messa a fuoco, premere il pulsante sul microscopio per passare la vista al computer.
   10. Rimettere a fuoco secondo necessità per ottenere l'immagine più nitida sul computer, quindi fare clic su Interrompi messa a fuoco.
8. Procedura alternativa per trovare le cellule GFP positive
   1. Utilizzare prima la procedura 340/380 per ottenere una buona messa a fuoco delle celle.
   2. Selezionare FITC, quindi fare clic su Inizia messa a fuoco.
   3. Usa il controller di fase per trovare le celle GFP-positive.
   4. Passa la visualizzazione al computer e quindi fai clic su Interrompi messa a fuoco.
9. Selezione della regione
   1. Fare clic sul pulsante Regione nella barra dei menu.
   2. Selezionare il tipo di illuminazione desiderato (340/380/FITC/TRITC). I filtri FITC e TRITC sono selezionati rispettivamente per GFP e mCherry/DsRed/mRuby, per le cellule che sovraesprimono i plasmidi bersaglio; in caso contrario, selezionare Fura-2.
      NOTA: Evita di selezionare cellule in cattive condizioni o morte, come quelle che sono ovviamente arrotondate o hanno proteine fluorescenti sovraesposte.
   3. Fare clic su Acquisisci immagini, quindi su OK.
   4. Apparirà una nuova finestra; Seleziona le celle facendo clic sullo strumento ovale e quindi facendo clic sulla cella.
   5. Selezionare le cellule desiderate sotto la fluorescenza trasportata dalla proteina bersaglio (FITC o TRITC). Selezionare le cellule di controllo che non esprimono la proteina bersaglio nella condizione di 380 nm.
   6. Annullare un'area facendo clic con il pulsante destro del mouse sul cerchio e selezionando Elimina regione.
   7. Seleziona un campione di sfondo come ultima regione e registra il suo numero ID.
   8. Fare clic su Salva e poi su Fine.
10. Sottrazione di sfondo
    1. Fare clic sul pulsante del menu Riferimenti.
    2. Indicare il numero della regione di sfondo.
       NOTA: Se lo sfondo era l'ultima regione selezionata, inserendo un numero molto alto si passerà automaticamente all'ultima regione selezionata.
    3. Seleziona la casella Sottrai riferimenti e quindi fai clic su OK.
11. Dati di registro
    1. Fare clic sul pulsante Log Data nel pannello di controllo dell'esperimento.
       NOTA: Le immagini vengono salvate solo se si desidera riprodurre l'esperimento in un secondo momento; Normalmente, è sufficiente selezionare la casella dei dati.
    2. Assicurarsi che venga visualizzato un prompt che richiede il tipo di file di dati preferito; Selezione. Si consiglia il formato XLSX .
    3. Si aprirà un foglio di lavoro di tipo ".xlsx". Riducendo a icona il foglio di lavoro, si eviterà che occupi spazio sullo schermo.
12. Acquisizione dati
    1. Nella sezione Time Lapse del pannello di controllo, impostare l'intervallo di acquisizione dei dati su 1 s.
       NOTA: Questo può essere regolato in base alle effettive esigenze.
    2. Fare clic su Zero Clock e Acquisisci sul pannello di controllo dell'esperimento per avviare l'esperimento. Le linee di base saranno visibili su un grafico che indica ciascuna delle regioni delle celle selezionate.
    3. Eseguire una serie di trattamenti sulle cellule in base alle esigenze sperimentali.
    4. Per osservare la risposta alla temperatura delle celle, riscaldare il tampone nel sistema di perfusione a una temperatura appropriata utilizzando un regolatore di temperatura.
    5. Per osservare gli effetti dei farmaci sulle cellule, perfondere o aggiungere manualmente un tampone contenente farmaco e registrare i cambiamenti cellulari.
    6. Al termine dell'acquisizione dei dati, fare clic su Pausa.
       NOTA: L'acquisizione dei dati può essere messa in pausa e l'orologio può essere azzerato in qualsiasi momento durante l'esperimento.
    7. Salva e analizza i dati.
13. Fare clic su File e chiudi esperimento per terminare l'esperimento e selezionare No nella finestra di dialogo per salvare il protocollo.
14. Apri un nuovo esperimento facendo clic su Nuovo nel menu e ripeti il processo.
15. Spegni
    1. Chiudere il software e trasferire i dati dal computer.
    2. Invertire la procedura di avvio.
    3. Registra le ore sul foglio di iscrizione e ripulisci qualsiasi disordine.
16. Analisi dei dati
    1. Rappresentare la concentrazione intracellulare di Ca²⁺ mediante il rapporto Fura-2 340/380 o convertirla nella corrispondente concentrazione di Ca²⁺ .

Risultati

Rilevamento della risposta alla temperatura
Cheratinociti primari
I cheratinociti primari sono stati isolati da topi neonati e preparati secondo i protocolli stabiliti¹⁰. Queste cellule sono state seminate in piastre a 24 pozzetti contenenti vetrini. Dopo il caricamento della sonda Fura-2, la messa a fuoco è stata regolata al microscopio a una lunghezza d'onda di 380 nm per ottenere una chiara visualizzazione della morfologia cell...

Discussione

L'applicazione dei sistemi di imaging del Ca²⁺ a singola cellula è ampia, consentendo lo studio dei segnali del Ca²⁺ in vari tipi di cellule, tra cui cheratinociti, cellule staminali¹⁶, cellule epatiche, cellule cardiache¹⁷, podociti¹⁸, cellule immunitarie e linee cellulari che sovraesprimono proteine bersaglio^10,19. Questa tecnica misu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera	Nikon
Capsaicine	Sigma	211275
CL-100 temperature controller	Warner Instruments
Cyclopiazonic Acid (CPA)	Sigma	C1530
DG-4 light	Sutter Instrument Company
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
Fluorescence imaging software (MetaFluor, Paid software)	Molecular Devices
Fluorescence microscope	Nikon
Fura-2/AM	Invitrogen	F1201
HBSS buffer	Gibco	14175103
HEPES	Sigma	H3375
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
Pluronic F-127	Beyotime	ST501
poly-D-lysine	Beyotime	ST508
SC-20 liquid circulation heating/cooling device	Harvard Apparatus
White-light source	Nikon