Sindrome di Sjogren primaria associata ad adenocarcinoma polmonare: sondare i potenziali meccanismi patogenetici comuni e verifica sperimentale

Riepilogo

Questo manoscritto descrive le procedure operative e le precauzioni per sondare i potenziali meccanismi patogenetici comuni che legano la sindrome di Sjogren primaria e l'adenocarcinoma polmonare attraverso analisi bioinformatiche e verifiche sperimentali.

Abstract

Questo studio ha avuto lo scopo di sondare i potenziali meccanismi patogenetici comuni che collegano la sindrome di Sjogren primaria (pSS) e l'adenocarcinoma polmonare (LUAD) attraverso analisi bioinformatiche e verifiche sperimentali. I geni rilevanti associati a pSS e LUAD sono stati recuperati dal database Gene Expression Omnibus (GEO) e dal database Genecard. Successivamente, i geni differenzialmente espressi (DEG) associati a pSS e LUAD sono stati sottoposti a screening come pSS-LUAD-DEG. Le analisi di arricchimento dell'Enciclopedia dei geni e dei genomi (KEGG) e dell'ontologia genica (GO) di Kyoto sono state eseguite per chiarire le funzioni biologiche significative dei pSS-LUAD-DEG. I bersagli principali sono stati identificati costruendo la rete di interazione proteina-proteina (PPI), valutando ulteriormente l'accuratezza diagnostica del gene hub attraverso l'analisi della curva delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC). In questo studio, i topi NOD/Ltj sono serviti come modelli animali pSS e sono stati stimolati con particolato 2,5 (PM2,5) per generare una reazione infiammatoria. La reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale (qPCR), il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) e il western blotting sono stati impiegati per la verifica di esperimenti di biologia molecolare. I risultati rivelati attraverso le analisi di arricchimento KEGG e GO indicano che l'infiammazione svolge un ruolo fondamentale nel collegare pSS e LUAD. IL6, CCNA2, JAK2, IL1B, ASPM, CCNB2, NUSAP1 e CEP55 sono stati determinati come bersagli chiave di pSS-LUAD. I topi BALB/c e i topi NOD/Ltj hanno mostrato una maggiore espressione delle citochine infiammatorie IL-6 e IL-1β nei tessuti polmonari dopo 21 giorni di stimolazione con PM2.5, attivando la via di segnalazione JAK2/STAT3 e sovraregolando l'espressione dei geni associati al tumore CCNA2, CCNB2 e CEP55, con i topi NOD/Ltj che mostravano cambiamenti più pronunciati rispetto ai topi BALB/c. Questo protocollo dimostra che la cancerogenesi indotta dal microambiente infiammatorio polmonare può essere una ragione chiave per l'alta incidenza di LUAD nei pazienti con pSS. Inoltre, i meccanismi correlati al blocco possono aiutare a prevenire l'insorgenza di LUAD nei pazienti con pSS.

Introduzione

La sindrome di Sjögren primaria (pSS) è una malattia autoimmune caratterizzata da infiltrazione linfocitaria delle ghiandole esocrine e porta ai sintomi clinici di secchezza oculare (xeroftalmia) e secchezza delle fauci (xerostomia)^1,2. La pSS è solitamente accompagnata da manifestazioni extraghiandolari di coinvolgimento, tra cui iperglobulinemia³, malattia polmonare interstiziale⁴, acidosi tubulare renale⁵, danno neurologico⁶ e trombocitopenia⁷, che costituiscono i principali fattori prognostici avversi. Negli ultimi anni, una serie di studi ha dimostrato che la pSS è generalmente accompagnata da un'aumentata prevalenza di cancro, comprese le neoplasie ematologiche e i tumori solidi ^8,9,10. Il cancro del polmone è uno dei tumori più comuni correlati al pSS, in particolare l'adenocarcinoma polmonare (LUAD)¹¹.

Nel complesso, ulteriori indagini hanno suggerito che la pSS con LUAD potrebbe avere una patogenesi comune sottostante. Secondo le nostre attuali conoscenze, non esistono ancora studi speciali che spieghino i meccanismi comuni tra le due malattie. Recentemente, l'analisi bioinformatica ci offre una potenziale possibilità di rivelare meccanismi di malattia potenzialmente condivisi tra le specie 12,13,14. Per rivelare ulteriormente i meccanismi sottostanti, l'analisi bioinformatica viene utilizzata per l'analisi di bersagli comuni e vie di segnalazione tra pSS e LUAD, e successivamente vengono stabiliti modelli animali per la verifica sperimentale. La rivelazione di questi meccanismi può aiutare a fornire una base di prove per la prevenzione clinica della LUAD nei pazienti con pSS.

Questo studio ha utilizzato i database GEO e Genecard per recuperare i geni rilevanti associati a pSS e LUAD. Successivamente, i DEG associati a pSS e LUAD sono stati sottoposti a screening come pSS-LUAD-DEG. Abbiamo eseguito analisi di arricchimento KEGG e GO per chiarire le funzioni biologiche significative dei pSS-LUAD-DEG. La costruzione della rete PPI è stata utilizzata per identificare i bersagli principali e abbiamo ulteriormente valutato l'accuratezza diagnostica del gene hub attraverso l'analisi della curva ROC. Abbiamo utilizzato topi NOD/Ltj come modelli animali pSS stimolati con particolato 2,5 (PM2,5) per generare una reazione infiammatoria. QPCR, ELISA e western blotting sono stati eseguiti per verificare lo studio sperimentalmente. Nel complesso, i risultati indicano che la cancerogenesi indotta dal microambiente infiammatorio polmonare può essere una ragione critica per l'alta incidenza di LUAD nei pazienti con pSS. Suggerisce inoltre che l'insorgenza di LUAD nei pazienti con pSS può essere prevenuta da meccanismi correlati al blocco.

Protocollo

Gli animali da esperimento sono stati ospitati nella struttura per animali dell'Ospedale dell'Amicizia Cina-Giappone, dove le condizioni di stabulazione hanno soddisfatto l'ambiente di alimentazione degli animali in linea con lo standard nazionale cinese, Laboratory Animal-Requirements of Environment and Housing Facilities (GB14925-2010). Tutte le procedure e gli esperimenti per la cura degli animali sono stati conformi alle linee guida ARRIVE e si sono basati sui principi delle 3R (riduzione, sostituzione, perfezionamento), aderendo alle linee guida della legge nazionale sul benessere degli animali della Cina. I topi BALB/c sono stati acquistati da SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd., mentre i topi NOD/Ltj sono stati acquistati da Huafukang (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.

1. Analisi bioinformatica

1. Preparazione di dataset
   1. Apri il database Gene Expression Omnibus (GEO) (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)¹⁵ e utilizza la sindrome di Sjögren primaria e l'adenocarcinoma polmonare come parole chiave per cercare i profili di espressione genica. Quindi fare clic sui risultati nel database GEO DataSets e selezionare Homo sapiens in Top Organisms. Seleziona e scarica il set di dati di interesse insieme alle informazioni sulla piattaforma corrispondenti.
   2. Apri il database Genecard (https://www.genecards.org/)¹⁶ e usa lasindrome di Sjögren primiaria e l'adenocarcinoma polmonare come parole chiave per ottenere i geni di pSS e LUAD. Scarica i fogli di calcolo dei geni della malattia.
2. Identificazione di DEG condivisi tra pSS e LUAD
   1. Scarica e apri il software R (https://cran.r-project.org/)¹⁷. Installare il pacchetto GEOquery R, il pacchetto stringr R, il pacchetto ggplot2 R, il pacchetto reshape2 R e il pacchetto limma R nel software R.
   2. Identifica e visualizza i geni differenzialmente espressi (DEG) in diversi set di dati GEO (GSE84844, GSE51092, GSE32863 e GSE75037) utilizzando il software R, quindi confronta e analizza l'espressione genica tra questi set di dati. Considera i geni con un valore P aggiustato < 0,05 e il cambio di piega (FC) > 1,2 o < 0,83 come DEG.
   3. Selezionare i geni con un livello di espressione maggiore o uguale a 20 correlati a pSS e LUAD dal database Genecard.
   4. Unisci i DEG associati a pSS e i DEG associati a LUAD sia dal database GEO che dal database Genecard.
   5. Installa e carica il pacchetto VennDiagram in R per ottenere e visualizzare i DEG associati a pSS e LUAD (PSS-LUAD-DEG).
3. Analisi dell'arricchimento del percorso dell'Enciclopedia dei geni e dei genomi di Kyoto (KEGG)
   1. Entra in Metascape (https://metascape.org/)¹⁸. Fare clic su Seleziona file e caricare il file in formato .xlsx di pSS-LUAD-DEG. Selezionare H. sapiens in Input come specie. Allo stesso modo, selezionare H. sapiens in Analisi come specie.
   2. Fare clic su Analisi personalizzata. Fare clic su Arricchimento e selezionare Percorso KEGG. Fare clic su Analisi arricchimento, quindi su Pagina report analisi al termine dell'analisi dell'arricchimento.
   3. Fare clic su Tutto in un file zip per scaricare il risultato. Accedi al file _ FINAL_GO.csv nella cartella del Enrichment_GO di download per visualizzare il risultato.
   4. Utilizzare il pacchetto ggplot2 per eseguire il programma di visualizzazione KEGG in R.
4. Analisi dell'arricchimento dell'ontologia genica (GO)
   1. Installare e caricare clusterProfiler e il pacchetto enrichplot in R.
   2. Importa l'elenco in formato testo di pSS-LUAD-DEG in R.
   3. Esegui i pacchetti clusterProfiler e enrichplot per l'analisi dell'arricchimento GO e la visualizzazione dei risultati. Definisci la significatività statistica nell'analisi con un valore P rettificato < 0,05.
5. Costruzione di una rete di interazione proteina-proteina (PPI) e analisi dei moduli
   1. Entra nel database STRING (Retrieval of Interacting Genes) (http://string-db.org/)¹⁹. Fare clic su Sfoglia e caricare il file di pSS-LUAD-DEGs. Seleziona Homo sapiens in Organismi, quindi fai clic su Cerca.
   2. Fai clic su Continua. Una volta disponibili i risultati, fai clic su Impostazioni. In Impostazioni di base > punteggio minimo di interazione richiesto, seleziona Alta confidenza (0,700). Seleziona Nascondi nodi disconnessi nella rete in Impostazioni avanzate, quindi fai clic su Aggiorna.
   3. Fare clic su Esportazioni nella barra del titolo per scaricare il testo della relazione PPI in formato TSV.
   4. Scarica e attiva il software Cytoscape 3.7.1 (https://cytoscape.org/)²⁰. Fare clic su File > Importa > rete da file per importare il file in formato TSV per la creazione della rete PPI.
   5. Utilizzare lo strumento Network Analyzer per analizzare i parametri topologici della rete. Ottimizza le dimensioni e il colore dei nodi tramite la barra di stile nel pannello di controllo a sinistra.
   6. Sulla barra dei menu, selezionare Strumenti > Analizza rete. Nel pannello Tabella , fare clic su Grado per ordinare i componenti in base al grado in ordine decrescente. Prendi i primi 20 geni con gradi più alti come geni hub.
   7. Installa e carica i pacchetti igraph e ggplot2 in R per visualizzare i geni hub per grado.
6. Identificazione e validazione di geni hub
   1. Installare e caricare il pacchetto pROC in R.
   2. Importa l'elenco in formato testo dei geni hub in R.
   3. Tracciare le curve delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) dei geni dell'hub e calcolare l'area sotto i valori della curva ROC (AUC).
      NOTA: Fare riferimento al file di codifica supplementare 1 per il codice R per il filtraggio dei DEG.

2. Verifica sperimentale

NOTA: Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i dettagli sui materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Preparazione degli animali
   1. Nutrire 12 topi femmina BALB/c di nove settimane e 12 topi femmina NOD/Ltj di nove settimane in modo adattivo per 1 settimana.
   2. Usa una tabella numerica casuale per allocare uniformemente 12 topi femmina BALB/c di nove settimane nel gruppo di controllo vuoto e nel gruppo PM2.5. Allo stesso modo, dividere equamente 12 topi femmina NOD/Ltj di nove settimane nel gruppo pSS e nel gruppo pSS-PM2.5.
2. Preparazione della sospensione di particolato 2,5 (PM2,5)
   NOTA: Il PM2.5 può indurre l'insorgenza e lo sviluppo di LUAD correlato all'infiammazione nel modello murino²¹. I topi BALB/c e i topi NOD/Ltj sono stati indotti dal PM2.5 a sviluppare cambiamenti correlati all'infiammazione. Secondo il metodo descritto da Piao et ^al.22, la concentrazione della sospensione di PM2,5 è stata preparata a 1 mg/mL.
   1. Pesare le membrane in fibra di quarzo PM2,5, tagliarle in pezzi di 2 cm × 2 cm e immergerle in un becher contenente un'adeguata quantità di acqua deionizzata.
   2. Sigillare il becher e sonicarlo in un sonicatore a bagnomaria a 37 °C per 30 minuti ogni volta. Ripetere questo processo 3 volte fino a quando le particelle non sono completamente sciolte.
   3. Filtrare il liquido nel becher attraverso 16 strati di garza medica sterile, quindi spremere l'umidità residua dalla garza.
   4. Mettere il filtrato su un piatto piano e congelarlo in blocchi di ghiaccio in un congelatore a -20 °C. Quindi, utilizzare uno strumento di liofilizzazione (−52 °C, 0,1 mbar, 48 h) per asciugare i blocchi di ghiaccio di filtrato e raccogliere le particelle in polvere.
   5. Sciogliere accuratamente le particelle in polvere in soluzione salina per preparare una sospensione di PM2,5 con una concentrazione di 1 mg/mL. Versare la sospensione di PM2,5 in una bottiglia di vetro, metterla in uno sterilizzatore ad alta pressione e applicare alta pressione e temperatura (15 minuti a 121°C, 15 psi) per la sterilizzazione.
   6. Eseguire l'agitazione ultrasonica (200 W, 10 s di agitazione, 10 s di riposo, per 3 cicli). Dopo il trattamento, conservarlo in frigorifero a 4 °C per un uso successivo.
3. Istituzione del modello murino PM2.5
   NOTA: Al gruppo PM2.5 e al gruppo pSS-PM2.5 è stata somministrata una sospensione di PM2.5 mediante flebo tracheale una volta ogni 3 giorni per 28 giorni, con ogni dose di 0,1 ml. Al gruppo di controllo in bianco e al gruppo pSS è stata somministrata soluzione fisiologica mediante flebo di trachea una volta ogni 3 giorni per 28 giorni, con ogni dose di 0,1 ml.
   1. Iniettare una miscela di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) nel topo. Confermare il piano chirurgico dell'anestesia controllando la mancanza di risposta a un pizzicamento del dito del piede e garantendo il completo rilassamento muscolare. Monitorare continuamente i riflessi, la respirazione e la risposta generale per garantire che venga mantenuta un'anestesia adeguata durante tutta la procedura fino al completamento di tutti i passaggi.
   2. Posiziona il mouse sul piccolo sistema di ritenuta per animali con l'addome rivolto verso l'alto, la testa sollevata e la coda abbassata con un angolo di 45°. Utilizzare un filo sottile per avvolgere gli incisivi superiori del topo, tirandoli verso l'alto, e fissare il filo su una vite sul supporto dell'animale, garantendo la piena esposizione della cavità orale del topo.
   3. Apri la lampada a luce fredda e fai brillare la luce sulla pelle del collo del topo. Usa il forcipe per estrarre la lingua del topo, esponendo completamente la glottide. Osservare all'interno della cavità orale del topo un punto di luce ricorrente che si apre e si chiude, che indica la posizione dell'apertura delle vie aeree del topo.
   4. Inserire l'ago a permanenza venosa da 18 G nella trachea del topo, estrarre il nucleo dell'ago, posizionare il filo di cotone all'estremità esterna dell'ago a permanenza venosa e confermare il successo quando si osserva il filo di cotone che si muove con i movimenti del torace del topo.
   5. Aspirare prima 0,2 mL di aria utilizzando una siringa da 1 mL, quindi aspirare 0,1 mL di sospensione PM2,5, quindi aspirare altri 0,2 mL di aria. Iniettare la miscela attraverso l'ago a permanenza venosa da 18 G nella trachea.
   6. Estrarre l'ago a permanenza venosa da 18 G. Fissare il supporto dell'animale in posizione verticale e ruotarlo in senso orario e antiorario 30 volte per distribuire uniformemente la sospensione PM2.5 nei polmoni del topo. Quindi, allunga il collo del topo dritto e appoggialo su un lato per evitare il soffocamento.
4. Raccolta di esemplari
   NOTA: Raccogliere i campioni il 29^° giorno dell'esperimento per le successive analisi di biologia molecolare.
   1. Verificare la connessione del sistema di eutanasia e accendere il controller. Aprire la valvola della bombola di anidride carbonica (CO₂).
      NOTA: Non preriempire la camera di eutanasia prima di posizionare gli animali all'interno.
   2. Metti i topi nella camera e infondi CO₂ al 30%-70% del volume della camera al minuto. Esporre i topi a CO₂ per 5 minuti, assicurandosi che siano immobili, non respirino e abbiano le pupille dilatate. Chiudere la valvola della bombola di CO₂ e osservare per altri 5 minuti per confermare la morte.
   3. Posizionare il topo soppresso in posizione supina su una tavola da dissezione pulita. Esporre la trachea, il cuore e i polmoni.
   4. Usa forbici e pinze per rimuovere la pelle e i muscoli che coprono le regioni ventrali, toraciche e del collo. Usa forbici e pinze per praticare incisioni lungo i bordi delle costole su entrambi i lati della cavità toracica per esporre la cavità toracica contenente il cuore e i polmoni. Quindi, tagliare la clavicola per creare un'apertura sufficientemente ampia da esaminare a fondo i lobi polmonari sinistro e destro.
   5. Asportare i muscoli del collo che si estendono dallo sterno e dalle costole alla mascella. Inserire le forbici sotto il bordo anteriore delle costole e praticare incisioni su entrambi i lati per rimuovere la parte ossea che copre la trachea.
   6. Afferrare la trachea vicino alla mascella con una pinza e praticare un'incisione trasversale completa utilizzando le forbici posizionate sopra la pinza.
   7. Tirare delicatamente la trachea con una pinza, tagliando le connessioni del tessuto ventrale con le forbici fino a rimuovere l'intero tessuto toracico dal corpo.
   8. Appoggia i polmoni sul banco da lavoro. Sciacquare i residui superficiali del tessuto polmonare con soluzione fisiologica, asciugare con carta da filtro, aliquotare in criotubi e conservare a -80 °C.
5. Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR)
   1. Macinare il tessuto polmonare in polvere utilizzando un mortaio contenente azoto liquido.
   2. Pesare 20 mg di tessuto macinato utilizzando una bilancia di precisione, combinarlo con 750 μL di Buffer RL in una provetta da centrifuga, mescolare accuratamente utilizzando un miscelatore a vortice e lasciarlo riposare a temperatura ambiente (RT) per 3 minuti. Quindi, centrifugare a 14.000 x g per 5 minuti a RT e raccogliere il surnatante.
   3. Posizionare la mini colonna con filtro per DNA genomico (gDNA) in una provetta di raccolta da 2 mL. Trasferire il surnatante nella mini colonna del filtro gDNA e centrifugare a 14.000 x g per 2 minuti a RT.
   4. Eliminare la mini colonna del filtro gDNA. Aggiungere un volume uguale di etanolo al 70% al filtrato e mescolare pipettando su e giù 5 volte.
   5. Posizionare la mini colonna di RNA in una provetta di raccolta da 2 mL. Trasferire 750 μl della miscela nella mini colonna di RNA e centrifugare a 12.000 x g per 1 minuto a RT.
   6. Scartare il filtrato e reinserire la mini colonna di RNA nella provetta di raccolta da 2 mL. Aggiungere 500 μL di tampone RW1 alla mini colonna di RNA e centrifugare a 12.000 x g per 1 minuto a RT.
   7. Scartare il filtrato e reinserire la mini colonna di RNA nella provetta di raccolta da 2 mL. Aggiungere 500 μL di tampone RW2 alla mini colonna di RNA. Centrifugare a 12.000 x g per 1 minuto a RT. Ripetere ancora una volta questo passaggio.
   8. Scartare il filtrato e reinserire la mini colonna di RNA nella provetta di raccolta da 2 mL. Centrifugare a 12.000 x g per 2 minuti a RT.
   9. Trasferire la mini colonna di RNA in una provetta da centrifuga da 1,5 mL, aggiungere 100 μL di acqua priva di RNasi al centro della membrana della colonna e incubare a RT per 2 minuti. Quindi, centrifugare a 12.000 x g per 1 minuto a RT. Scartare la mini colonna di RNA e conservare la soluzione di RNA a -80 °C.
   10. Prelevare 2 μL della soluzione di RNA e misurarla utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop secondo il manuale dell'apparecchiatura per determinarne la concentrazione e la qualità.
       NOTA: Lo studio ha selezionato rapporti 260/280 e 260/230 per il controllo della qualità dell'RNA.
   11. Preparare la soluzione di RNA aggiungendo in sequenza i seguenti componenti in una provetta da microcentrifuga: 1 μg di RNA totale, 4 μL di MgCl₂ (25 mM), 2 μL di tampone 10x a trascrizione inversa, 2 μL di miscela dNTP (10 mM), 0,5 μL di inibitore ribonucleasi ricombinante, 15 unità di trascrittasi inversa, 0,5 μg di primer oligo(dT)₁₅ , e aggiungere acqua priva di nucleasi a 20 μl. Mescolare delicatamente il contenuto per raccogliere tutto il liquido sul fondo della provetta.
       NOTA: Le soluzioni cocktail devono essere preparate per garantire una sintesi del cDNA e una quantificazione dell'RNA più coerenti.
   12. Trascrivere la soluzione di RNA da 20 μL in cDNA incubandola a 42 °C per 15 minuti, denaturandola a 95 °C per 5 minuti e quindi raffreddandola a 4 °C, seguita da una conservazione a -20 °C.
   13. Combinare e miscelare accuratamente 6,4 μL di acqua distillata, 10 μL di master mix SYBR Green real-time PCR, 2 μL della soluzione di cDNA ottenuta, 0,8 μL di primer diretto (10 μM) e 0,8 μL di primer inverso (10 μM) (Tabella 1) per preparare il sistema di reazione.
   14. Eseguire la reazione sullo strumento PCR per ottenere i valori di soglia del ciclo (CT) per i geni bersaglio e i geni di riferimento.
       1. Impostare la denaturazione iniziale a 95 °C per 60 s all'inizio di ogni ciclo di PCR.
       2. Durante i cicli di PCR, eseguire la denaturazione a 95 °C per 15 s, la ricottura a 60 °C per 15 s e l'estensione a 72 °C per 45 s, raccogliendo i dati durante la fase di estensione. Condurre un totale di 40 cicli di PCR.
       3. Dopo aver completato i cicli di PCR, eseguire automaticamente l'analisi della curva di fusione utilizzando lo strumento PCR.
          NOTA: Se la curva di fusione mostra un doppio picco o una forma irregolare del picco, ciò indica che potrebbe esserci un problema con l'esperimento.
   15. Determinare i livelli di espressione relativi di ciascun gene bersaglio utilizzando il metodo ^2-ΔΔCT, seguito da ulteriori analisi statistiche. Utilizzare il seguente elenco di formule per il metodo ^2-ΔΔCT:
       ΔCT (test) = CT (bersaglio, test) - CT (ref, test)
       ΔCT (calibratore) = CT (target, calibratore) - CT (ref, calibratore)
       ΔΔCT = ΔCT (test) -ΔCT (calibratore)
       ^2-ΔΔCT = Variazione di piega nell'espressione genica

Nome del gene	Sequenza (da 5′ a 3′)
Mouse CCNA2 in avanti	CCCAGAAGTAGCAGAGTTTGTG
Mouse CCNA2 inverso	TTGTCCCGTGACTGTGTAGAG
Mouse ASPM in avanti	CTTATTCAGGCTATGTGGAGGA
Mouse ASPM inverso	CCAGGCTTGAATCTTGCAG
Mouse CCNB2 in avanti	TTGAAATTTGAGTTGGGTCGAC
Mouse CCNB2 inverso	CTGTTCAACATCAACCTCCC
Mouse NUSAP1 in avanti	CTCCCTCAAGTACAGTGACC
Mouse NUSAP1 inverso	TTTAACAACTTGGTTGCCCTC
Mouse CEP55 avanti	CCGCCAGAATATGCAGCATCAAC
Mouse CEP55 inverso	AGTGGGAATGGCTGCTCTGTGA

Tabella 1: Sequenze prime per la PCR quantitativa in tempo reale.

6. Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)
   NOTA: Secondo le istruzioni del kit ELISA, equilibrare il kit ELISA su RT, preparare un tampone di lavaggio e diluire lo standard. Diluire in anticipo 90 μl di anticorpo biotinilato concentrato con 8910 μl di tampone di diluizione di anticorpi biotinilati per preparare una soluzione di lavoro per anticorpi biotinilati (1:100). Allo stesso modo, diluire 90 μl di coniugato enzimatico concentrato con 8910 μl di tampone di diluizione coniugato enzimatico per preparare in anticipo una soluzione di lavoro coniugato enzimatico (1:100).
   1. Macinare il tessuto polmonare in polvere utilizzando un mortaio contenente azoto liquido.
   2. Pesare 50 mg di tessuto polmonare utilizzando una bilancia di precisione, combinarlo con 1 mL di PBS in una provetta di macinazione e macinarlo accuratamente con ghiaccio.
   3. Centrifugare la miscela a 4 °C, 3000 x g per 5 minuti e raccogliere il surnatante come campione.
   4. Posizionare 100 μL di campione/standard di diverse concentrazioni nei rispettivi pozzetti della piastra ELISA, coprire i pozzetti di reazione con una pellicola sigillante adesiva e incubare in un incubatore a 37 °C per 90 minuti.
   5. Utilizzare un lavapiastre automatizzato per lavare la piastra ELISA 4 volte, iniettando ogni volta 350 μL di tampone di lavaggio con un intervallo di 30 s tra l'iniezione e l'aspirazione.
   6. Aggiungere 100 μl di soluzione di lavoro per anticorpi biotinilati per pozzetto, sigillare i pozzetti con una pellicola sigillante adesiva e incubare in un incubatore a 37 °C per 60 minuti. Successivamente, lavare la piastra ELISA 4 volte seguendo la procedura descritta in precedenza.
   7. Aggiungere 100 μl di soluzione di lavoro coniugato enzimatico per pozzetto, sigillare i pozzetti con una pellicola sigillante adesiva e incubare in un incubatore a 37 °C per 30 minuti. Successivamente, lavare la piastra ELISA 4 volte seguendo la procedura descritta in precedenza.
   8. Aggiungere 100 μL di agente cromogenico per pozzetto, proteggere dalla luce e incubare in un incubatore a 37 °C per 10-20 minuti. Quindi, aggiungere 100 μL di soluzione di arresto per pozzetto, mescolare accuratamente e misurare immediatamente la densità ottica a valori di 450 nm (OD₄₅₀).
      NOTA: Una pipetta a 8 canali viene utilizzata per aggiungere la soluzione di lavoro dell'anticorpo biotinilato, la soluzione di lavoro coniugato enzimatico e la soluzione di arresto, che consente di completare rapidamente l'aggiunta ed evitare potenziali errori.
   9. Genera una curva standard utilizzando il software CurveExpert (http:// curveexpert.webhop.net/) per calcolare la concentrazione delle sostanze target in ciascun pozzetto del campione.
7. Western blotting
   1. Preparare la soluzione del saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA) mescolando il tampone di lisi RIPA, il fenilmetansulfonilfluoruro (PMSF) e l'inibitore della fosfatasi in un rapporto di 100:1:1 e metterlo su ghiaccio.
   2. Macinare i tessuti polmonari in polvere utilizzando un mortaio contenente azoto liquido.
   3. Pesare accuratamente 20 mg di tessuto polmonare utilizzando una bilancia di precisione e aggiungerli a 250 μl della soluzione miscelata RIPA.
   4. Incubare la miscela con ghiaccio per 20 minuti, quindi centrifugarla a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante come campione.
   5. Preparare la soluzione di lavoro BCA mescolando il reagente A e il reagente B del kit BCA in un rapporto 50:1.
      1. Diluire lo standard per preparare soluzioni standard diluite con concentrazioni di 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 e 0,5 mg/mL. Aggiungere 20 μl di ciascuna soluzione standard e campionare in pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti e incubare a 37 °C per 30 minuti.
      2. Misurare l'assorbanza a 490 nm utilizzando il lettore di micropiastre. Adattare la curva standard utilizzando le concentrazioni e le assorbanze delle soluzioni standard e calcolare la concentrazione del campione²³. Regolare le concentrazioni del campione allo stesso livello utilizzando la soluzione miscelata RIPA.
   6. Miscelare il surnatante proteico con un tampone di carico 5x in un rapporto di 4:1 in una provetta da centrifuga. Far bollire in un bagno di metallo per 5 minuti, quindi centrifugare a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante.
   7. Eseguire la separazione delle proteine utilizzando l'elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) e trasferire elettricamente le proteine su una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF). Bloccare la membrana in PVDF con latte scremato al 5% a RT per 1 ora.
   8. Incubare la membrana in PVDF con anticorpo primario (diluito 1:1000) a 4 °C per 12 ore, quindi lavare tre volte con TBST per 10 minuti ciascuna, quindi incubare con anticorpo secondario (diluito 1:5000) a RT per 2 ore.
   9. Rileva le bande target utilizzando un sistema di immunodosaggio a elettrochemiluminescenza completamente automatico ed esegui l'analisi quantitativa utilizzando il software integrato.
8. Analisi statistica
   1. Utilizzare un software appropriato per l'analisi statistica.
   2. Presentare i dati sperimentali come media ± deviazione standard.
   3. Determinare la significatività utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA).
   4. Considera P < 0,05 come statisticamente significativo.

Risultati

Un totale di 3290 DEG sono stati identificati dai 23348 geni in GSE84884 (pSS), inclusi 2659 geni up-regolati e 631 geni down-regolati (Figura 1A). Per GSE51092 (pSS), sono stati identificati un totale di 3290 DEG dai 11409 geni, inclusi 667 geni up-regolati e 587 geni down-regolati (Figura 1B). Il database GeneCards ha ottenuto 102 DEG ovarici correlati alla pSS e il punteggio di correlazione dei criteri di screening è stato d...

Discussione

Sebbene la pSS sia considerata una malattia caratterizzata principalmente dall'invasione delle ghiandole esocrine, il danno delle extra-ghiandole non può essere ignorato²⁴. I polmoni rappresentano un organo bersaglio per la pSS e il coinvolgimento polmonare è una manifestazione extra-ghiandolare comune della pSS, che tipicamente coinvolge l'infiltrazione linfocitaria della mucosa bronchiale e dell'interstizio polmonare²⁵. La ricerca indic...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Color Prestained Protein Marker	Epizyme	WJ103	Western Blot
Antibody Dilution Buffer	Epizyme	PS119	Western Blot
BCA Protein Quantification Kit	Epizyme	ZJ101	Western Blot
Cytoscape 3.7.1 software	National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH)	Version 3.7.1.	Open-source software for biological network analysis and visualization
ECL Luminous Fluid	Epizyme	SQ203	Western Blot
Electrophoresis Buffer	Epizyme	PS105S	Western Blot
GraphPad Prism 10.0	GraphPad	Version 10.0	Data analysis
HRP-conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014)	abclonal	AS014	Western Blot
JAK2 Antibody	Cell Signaling Technology	3230T	Western Blot
Mouse IL-1β ELISA Kit	Beijing 4A Biotech Co., Ltd	CME0015	ELISA
Mouse IL-6 ELISA Kit	Beijing 4A Biotech Co., Ltd	CME0006	ELISA
Phosphatase Inhibitor Cocktail (100×)	Epizyme	GRF102	Western Blot
Phospho-JAK2 (Tyr1007/1008) Antibody	Cell Signaling Technology	3776S	Western Blot
Phospho-STAT3 (Tyr705) Antibody	Cell Signaling Technology	9145S	Western Blot
Protease Inhibitor Cocktail (100×)	Epizyme	GRF101	Western Blot
Protein Free Rapid Blocking Buffer (5×)	Epizyme	PS108	Western Blot
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Western Blot
R software	R Foundation for Statistical Computing	Not Applicable	Statistical analysis software and programming language used for data analysis, visualization, and machine learning applications
Radio Immunoprecipitation Assay	Epizyme	PC101	Western Blot
Reverse Transcription System	Promega	A3500	PCR
SDS-PAGE	Epizyme	LK303	Western Blot
SDS-PAGE Protein Loading Buffer (5×)	Epizyme	LT103	Western Blot
STAT3 Antibody	Cell Signaling Technology	9139S	Western Blot
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	TOYOBO	QPK-201	PCR
TBST (10×)	Epizyme	PS103	Western Blot
Western Blot Transfer Buffer (10×)	Epizyme	PS109	Western Blot
β-Actin Antibody	abclonal	AC026	Western Blot