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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'esperimento qui utilizzato mostra un metodo di docking molecolare combinato con tecnologie di sonda per prevedere e convalidare l'interazione tra piccole molecole della medicina tradizionale cinese e bersagli proteici.

Abstract

Gli enzimi deubiquitinanti (DUB) svolgono un ruolo fondamentale nella modulazione dell'omeostasi dell'ubiquitinazione, con UCHL3 che è una cisteina archetipica DUB coinvolta in una miriade di processi fisiologici e patologici. Pertanto, lo sviluppo di inibitori di piccole molecole che hanno come bersaglio l'ubiquitina C-terminale idrolasi L3 (UCHL3) è di grande importanza. Questo protocollo mira a stabilire un processo per lo screening virtuale e la validazione in vitro di inibitori di piccole molecole di cisteina DUB rappresentati da UCHL3. In primo luogo, i potenziali inibitori di UCHL3 vengono virtualmente sottoposti a screening utilizzando la tecnologia di docking molecolare e viene visualizzata l'interazione tra farmaci e bersagli proteici. Successivamente, l'efficacia del farmaco sottoposto a screening, Danshensu, viene verificata attraverso saggi di inibizione dell'attività in vitro . L'ubiquitina-7-ammino-4-metilcumarina (Ub-AMC) e l'emoagglutirina-ubiquitina-vinil solfone (HA-Ub-VS) sono utilizzate come sonde per test di attività in vitro , in quanto possono legarsi in modo competitivo a DUB con inibitori di piccole molecole per valutare l'attività di UCHL3. I risultati indicano che Danshensu ha una buona affinità di legame con UCHL3 nel docking molecolare e può inibire in modo competitivo l'attività di UCHL3 con HA-Ub-VS. Questi risultati forniscono importanti riferimenti per ulteriori ricerche e sviluppo di farmaci terapeutici mirati a UCHL3.

Introduzione

L'ubiquitinazione è una modificazione post-traduzionale delle proteine, un processo mediante il quale gli enzimi E1 attivanti l'ubiquitina, gli enzimi E2 coniugati con l'ubiquitina e le ubiquitina ligasi E3 legano l'ubiquitina alla proteina bersaglio e l'intero processo di ubiquitinazione può essere invertito dagli enzimi deubiquitinanti (DUB)1,2,3,4. A causa del loro importante ruolo fisiologico e patologico, i DUB sono considerati bersagli importanti per la scoperta di farmaci 5,6.

Nell'uomo sono stati identificati oltre 100 DUB 7,8. Tipicamente funzionano come isopeptidasi responsabile della scissione del legame isopeptidico tra il C-terminale dell'ubiquitina e un residuo di lisina in un substrato o in un'altra molecola di ubiquitina 9,10. Attualmente, sono principalmente classificate in sette famiglie principali, vale a dire: peptidasi specifiche per l'ubiquitina (USP), proteasi tumorali ovariche (OTU), proteasi N-terminali + dominio (JAMM) Jab1/Mov34/Mpr1 Pad 1, motivo che interagisce con le nuove proteasi della famiglia DUB (MINDY) contenenti ubiquitina, idrossilasi C-terminali (UCH), proteasi del dominio Machado-Josephin (MJD) e peptidasi 1 ubiquitina contenente dita di zinco (ZUP1)9. Oltre alle JAMM, che appartengono alla famiglia delle metalloproteasi di zinco11, le altre DUB sono le proteasi della cisteina caratterizzate da una triade catalitica costituita da cisteina catalitica, istidina e un terzo residuo acido12,13. Questa specificità apre la strada allo sviluppo di inibitori di piccole molecole che prendono di mira il sito attivo dell'enzima o le tasche allosteriche vicine.

Nel campo della ricerca sugli enzimi deubiquitinanti, esiste una sfida significativa nel caratterizzare la loro attività 14,15. La caratterizzazione basata su sonde attive funge da approccio cruciale per lo studio degli inibitori DUB16. Eseguendo saggi competitivi con sonde e inibitori basati sull'attività in lisati cellulari o proteine ricombinanti, l'attività dei DUB può essere caratterizzata, facilitando lo sviluppo di inibitori di piccole molecole che hanno come bersaglio questi enzimi. Ub-AMC è una sonda precoce utilizzata per rilevare l'attività DUB, che ha un gruppo fluorescente attaccato all'estremità C-terminale dell'ubiquitina17,18. Quando i DUB esercitano la loro attività catalitica, l'AMC viene rilasciato in grandi quantità e l'intensità fluorescente della luce rilevata viene aumentata di conseguenza. Questa sonda è stata ampiamente utilizzata nello screening ad alto rendimento degli inibitori del DUB19,20. La sonda HA-Ub-VS viene utilizzata anche per misurare l'attività DUB21. Ha un gruppo vinilsulfone al C-terminale dell'ubiquitina, che lo rende un substrato suicida per i DUB. Dopo la separazione dell'elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE), i DUB attivi possono essere rilevati utilizzando il western blotting 22,23,24.

La medicina tradizionale cinese (MTC) utilizza piante medicinali da più di 2000 anni. Lo sviluppo di nuovi farmaci a partire da prodotti naturali è di grande importanza dal punto di vista medico, con particolare attenzione all'identificazione dei principi attivi e al chiarimento dei loro meccanismi25. Salvia miltiorrhiza Bge è un'erba ampiamente utilizzata nel trattamento di una varietà di malattie, tra cui il cancro, cardiovascolare, epatica e neurologica26. Attualmente, contiene piccole molecole note come il tanshinone27, il Danshensu28, l'acido tanshinico29, ecc. Questi composti mostrano diverse attività biologiche come effetti antitrombotici, antiossidanti e antitumorali, il che li rende molto preziosi per la ricerca26. Studi recenti hanno identificato Danshensu come un inibitore covalente della proteasi 3-chimotripsina-simile (3CLpro) di SARS-CoV-230. È stato dimostrato che forma un legame covalente con il residuo attivo del sito C145 di 3CLpro, indicando la presenza di potenziali inibitori della proteasi a piccole molecole in Salvia miltiorrhiza Bge.

L'ubiquitina C-terminale idrolasi L3 (UCHL3) appartiene alle proteasi della cisteina all'interno della famiglia dei DUB. Si basa su residui conservati come la cisteina95, l'istidina169 e l'acido aspartico184 per catalizzare efficacemente le sue funzioni 31,32. Svolge un ruolo cruciale in molteplici percorsi molecolari, tra cui il ciclo cellulare, la ricombinazione omologa e la riparazione delle rotture del DNA legate alle proteine33. Inoltre, è sovraregolato in vari tumori come i tumori ovarici, prostatici, pancreatici, colorettali e polmonari non a piccole cellule34. Sulla base di questi studi, UCHL3 sembra essere un bersaglio promettente per il trattamento delle malattie. Sono stati identificati diversi inibitori di piccole molecole di UCHL3 che stanno progredendo verso l'uso clinico35,36.

In questo studio, il docking molecolare è stato eseguito per studiare le interazioni tra piccole molecole di Salvia miltiorrhiza Bge e UCHL3. Successivamente, un esperimento in vitro con sonde specifiche per DUB Ub-AMC e HA-Ub-VS ha identificato Danshensu come un inibitore di piccole molecole di UCHL3. Il docking molecolare ha anche predetto potenziali siti di legame per Danshensu, suggerendo il suo meccanismo d'azione.

Protocollo

1. Scaricare le strutture di piccole molecole di Salvia miltiorrhiza Bge e dell'UCHL3

  1. Scarica il file della piccola molecola.
    1. Apri il database TCMSP (https://old.tcmsp-e.com), inserisci danshen (nome dell'erba), quindi premi la ricerca e fai clic su Radix Salviae nell'elenco dei risultati.
    2. Clicca su scarica uno per uno degli elementi e salva la struttura 2D in formato .mol2.
  2. Scarica il file delle proteine.
    1. Aprire il database PDB (https://www.rcsb.org/), inserire UCHL3, quindi premere la ricerca. Fai clic su Homo sapiens, quindi premi cerca in perfezionamenti.
    2. Selezionare la struttura 1XD3 con co-cristallizzazione di piccole molecole-proteine, quindi fare clic su scarica file e selezionare il formato PDB .

2. Docking molecolare

  1. Salva il file.
    1. Crea una nuova cartella chiamata danshen_UCHL3 docking sul desktop e salva i composti delle strutture Salvia miltiorrhiza Bge e UCHL3 in questa cartella. Assegna un nome alla cartella in inglese; In caso contrario, il file non verrà importato.
  2. Imposta il percorso.
    1. Aprire il software Maestro, fare clic su File, selezionare Cambia directory di lavoro, fare clic su Desktop, fare doppio clic per selezionare la cartella di ancoraggio danshen_CUHL3 e fare clic su Scegli opzioni.
  3. Lavorazione di piccole molecole
    1. Importazione di strutture di piccole molecole.
      1. Fare clic sulle opzioni File e Importa strutture. Fare clic su Desktop, fare doppio clic sulla cartella di ancoraggio e fare clic sul file di struttura Salvia miltiorrhiza Bge. Quindi, fai clic su Apri per importare tutte le piccole molecole.
    2. Prepara la piccola molecola.
      1. Fare clic su Attività e selezionare l'opzione LigPrep . Nella finestra LigPrep visualizzata, fare clic sulla tabella del progetto sull'opzione Usa struttura da , selezionare l'opzione Determina chiralità dalla struttura 3D durante il calcolo e lasciare tutte le altre impostazioni software come predefinite.
      2. Modificare il nome del processo in danshen_ligprep1, quindi fare clic su Esegui per eseguire l'elaborazione di piccole molecole.
  4. Elaborazione della struttura proteica
    1. Importa la struttura proteica.
      1. Fare clic sulle opzioni File e Importa strutture , fare clic su Desktop e fare doppio clic sulla cartella di ancoraggio danshen_CUHL3.
      2. Fare clic sul file della struttura proteica UCHL3 , quindi fare clic su Apri per importare il file della struttura proteica.
    2. Prepara le proteine.
      1. Selezionare i due legami covalenti che collegano UCHL3 e la piccola molecola ed eliminarli utilizzando il pulsante Elimina . Quindi, selezionare i due residui proteici che sono incompleti dopo l'eliminazione. Fare clic sul pulsante Crea , selezionare Altre modifiche, quindi per Gly75 fare clic sul pulsante C , per Cys95 scegliere Muta residuo e CYS.
      2. Fare clic su Attività e selezionare l'opzione Flusso di lavoro per la preparazione delle proteine. Lasciare tutte le altre impostazioni software come predefinite. Modificare il nome del processo in UCHL3_protein pre, quindi fare clic su Esegui per eseguire l'elaborazione delle proteine.
    3. Configurare la scatola di aggancio.
      1. Fare clic su Attività, scegliere Generazione griglia recettoriale e selezionare Scegli per identificare la molecola del ligando . Seleziona la piccola molecola nel campo di lavoro e apparirà una casella di aggancio rosa centrata sulle coordinate della piccola molecola.
      2. Mantenere le impostazioni predefinite, denominare il processo come 1XD3_danshen_glide_grid e quindi fare clic su Esegui.
        NOTA: In 1XD3, la piccola molecola forma un legame covalente con la proteina. È necessario rimuovere questo legame covalente per separare la piccola molecola dalla proteina. In caso contrario, durante il processo di configurazione della griglia del recettore, la piccola molecola non può essere selezionata.
  5. Eseguire l'aggancio molecolare.
    1. Fare clic su Attività e selezionare l'opzione Docking ligand . Selezionare la griglia del recettore, fare clic su Da file, quindi fare clic su Sfoglia. Selezionare 1XD3_danshen_glide_grid.zip file, quindi fare clic su Apri.
    2. Fare clic su Usa ligandi da come file, quindi fare clic su Sfoglia. Fare clic danshen_ligprep1 file, selezionare danshen_ligprep1-out. maegz e quindi fare clic su Apri.
    3. Fare clic su Impostazioni e selezionare l'opzione Precisione come SP , modificare il nome del lavoro in danshen_UCHL3_ glidedock _SP e fare clic su Esegui.
  6. Visualizza i risultati dell'attracco.
    1. Fare clic sulle opzioni File e Importa strutture . Fare clic su Desktop e fare doppio clic sulla cartella di ancoraggio danshen_CUHL3.
    2. Fare doppio clic sul file danshen_UCHL3_ glidedock _SP , fare clic sul file danshen_UCHL3_ glidedock _SP_pv.maegz , quindi fare clic su Apri.
    3. Fare clic sull'opzione Tabella , quindi visualizzare il punteggio in Punteggio di ancoraggio.
  7. Visualizza le interazioni danshensu e UCHL3.
    1. Fare doppio clic sul file danshen_UCHL3_glidedock _SP_pv.maegz e aprirlo in Maestro. Nell'elenco delle voci, tieni premuto Maiusc e seleziona contemporaneamente danshensu e la proteina.
    2. Fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Unisci per creare una nuova struttura. Selezionare la nuova struttura, fare clic con il pulsante destro del mouse, scegliere Esporta, quindi fare clic su Strutture, assegnare al file danshensu_UCHL3 il nome ed esportarlo in formato .pdb.
    3. Seleziona la struttura di unione nel pannello, fai clic su Attività, seleziona 2D Sketcher e ottieni un'immagine della struttura 2D dell'interazione tra danshensu e UCHL3.
    4. Importare il file danshensu_UCHL3.pdb nel software pymol e visualizzarlo in base alla struttura 2D ottenuta da Maestro.

3. Purificazione della proteina UCHL3

  1. Costruzione del plasmide di espressione procariotica pHUE-UCHL3
    1. Ottenere la sequenza codificante del gene della proteina ricombinante UCHL3 da NCBI (isform2). Integrare il frammento genico ottenuto nel vettore pHUE-10HIS tramite ricombinazione omologa e trasformarlo in cellule competenti per DH5α. Estrarre il DNA plasmidico per ottenere il costrutto desiderato.
  2. Induzione e purificazione di proteine ricombinanti
    1. Coltura batterica:
      1. Trasformare i plasmidi ricombinanti in cellule competenti BL21 (DE3) e diffonderli su piastre di agar Luria-Bertani (LB) contenenti ampicillina. Incubare le piastre a 37 °C per una notte.
      2. Prelevare singole colonie, inocularle in 12 mL di terreno LB liquido integrato con 50 μg/mL di ampicillina e coltivare per una notte a 37 °C.
    2. Trasformazione e induzione
      1. Diluire la coltura batterica durante la notte al 2% utilizzando un terreno fresco. Quando OD600 ha raggiunto 0,4-0,6, aggiungere isopropil-beta-D-tiogalattopiranoside (IPTG) a una concentrazione finale di 0,4 mM per induzione a bassa temperatura a 16 °C per 12 ore.
    3. Raccolta di colture batteriche
      1. Trasferire la coltura batterica in provette da centrifuga sterili e centrifugare a 2200 x g per 10 minuti. Rimuovere il surnatante e conservare i ceppi a -80 °C per la conservazione.
    4. Sonicazione
      1. Risospendere il ceppo in 25 mL (1/20 della coltura batterica raccolta) di tampone 1 (50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA). Eseguire la sonicazione batterica nelle seguenti condizioni: acceso per 4 s, spento per 6 s, energia impostata al 60%, per 15 min. Aggiungere l'1% di Triton X-100 e limare a 4 °C per 30-60 min.
    5. Separazione del surnatante e del pellet
      1. Centrifugare il campione a 9000 x g a 4 °C per 30 min. Raccogliere il surnatante e filtrarlo attraverso un filtro a membrana da 0,45 μm. Riservare 50 μl di surnatante come input.
      2. Risospendere il pellet nel tampone 1, aggiungere una quantità appropriata di 5 tamponi campione (25% 1M Tris-HCl [pH 6,8], 10% dodecil solfato di sodio, 0,5% blu di bromofenolo, 41,67% glicerolo e 10% DL-ditiotreitolo) e far bollire a 100 °C per 10 minuti.
  3. Purificazione delle proteine
    1. Equilibratura della colonna
      1. Caricare 1 mL di resina di nichel NiNTA nella colonna, lasciarla riposare per 10 minuti, quindi equilibrare in sequenza la colonna con 5 volumi di colonna di tampone 2 (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM NaCl) contenenti 10 mM, 500 mM e 10 mM di imidazolo.
      2. Utilizzare una pipetta per aggiungere 5 mL (circa 5 volumi della colonna) della soluzione di imidazolo da 10 mM lungo la parete della colonna. Eseguire questo processo senza controllare la portata.
      3. Una volta che il liquido copre appena il materiale di imballaggio ed è quasi drenato, aggiungere in sequenza 5 volumi di colonna della soluzione di imidazolo da 500 mM e la soluzione di imidazolo da 10 mM per l'equilibrio. Quando i restanti 10 mM di soluzione di imidazolo coprono appena il materiale di imballaggio, chiudere il regolatore di flusso per arrestare l'equilibrio.
    2. Purificazione delle proteine
      1. Far passare il surnatante proteico filtrato attraverso la colonna a una velocità di flusso di 0,5 mL/min (<15 s per goccia), raccogliendo la frazione a flusso continuo. Preparare un gradiente di concentrazione di 10 mM, 30 mM, 50 mM e 100 mM di imidazolo utilizzando il tampone 2, insieme a 0,5 M di NaCl.
      2. Eluire in sequenza da basse ad alte concentrazioni di imidazolo, utilizzando una pipetta per aggiungere circa 5 volumi di soluzione lungo la parete della colonna senza controllare la portata. Raccogliere l'eluato in provette da microcentrifuga pulite da 1,5 mL, prelevando 1 mL di flusso per provetta.
      3. Dopo aver raccolto cinque provette, prelevare 1 μL di flusso da ciascuna provetta per farla reagire con 1 μL di tampone Bradford. Se la reazione rimane blu, continuare i passaggi; Se diventa trasparente, interrompere l'eluizione a quella concentrazione e passare a quella successiva.
      4. Dopo l'eluizione con 100 mM di imidazolo, lavare con 10 volumi di colonna di 0,5 M di NaCl senza controllare la portata o raccogliere l'eluato.
      5. Infine, eluire con 500 mM di imidazolo (<15 s per goccia). Utilizzando una pipetta, aggiungere 1 mL della soluzione alla colonna, mantenendo la velocità di eluizione lenta di cui sopra. Raccogliere 1 mL di eluato utilizzando una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e ripetere questo processo 10 volte.
    3. Valutare la proteina purificata utilizzando la colorazione Coomassie Brilliant Blue.
      1. Quantificare il pellet precedentemente ottenuto, il surnatante di pre-purificazione e le 10 provette proteiche raccolte prelevando 10 μl da ciascun gruppo e aggiungendo il tampone campione 5x appropriato, quindi riscaldando a 100 °C per 5 minuti.
      2. Preparare la soluzione standard di albumina sierica bovina (BSA) a 1 mg/mL, 500 μg/mL e 100 μg/mL. Quindi aggiungere il tampone campione 5x appropriato e riscaldare a 100 °C per 5 minuti.
      3. Eseguire l'elettroforesi su gel SDS-PAGE sui campioni, quindi rimuovere il gel e incubarlo a temperatura ambiente (RT) in soluzione Coomassie Brilliant Blue su un agitatore a bassa velocità per una notte.
      4. Il giorno successivo, trasferire il gel in una soluzione decolorante (40% etanolo, 10% acido acetico, 50% H2O) per la decolorazione, applicando un calore delicato secondo necessità. Una volta che il gel è trasparente, osservare sotto uno strumento di sviluppo per quantificare la proteina purificata in base ai livelli di BSA e valutare la purezza controllando la presenza di una singola banda.
    4. Conservazione delle proteine: Aliquotare la proteina in provette da microcentrifuga a 50 μl per provetta, congelarla in azoto liquido e conservarla a -80 °C.

4. Saggio di attività UCHL3 (saggio Ub-AMC)

  1. Preparazione proteica
    1. Scongelare la proteina con ghiaccio, centrifugare il campione a 1000 x g a RT per 3 minuti e determinare la concentrazione proteica utilizzando il metodo BCA. Diluire la proteina a una concentrazione di 40 nM utilizzando il tampone 1.
  2. Impostazione dei gruppi
    1. Designare il buffer 1 come gruppo di controllo e UCHL3 come gruppo sperimentale. Aggiungere 200 μl di ciascun campione per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti, impostando 3 repliche per gruppo.
  3. Scoperta
    1. Poco prima della misurazione, aggiungere rapidamente Ub-AMC a ciascun pozzetto e agitare energicamente per 2-5 s. La concentrazione di Ub-AMC utilizzata è di 250 nM. Misura i valori OD a una lunghezza d'onda di eccitazione di 380 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 460 nm in condizioni di 37 °C, effettuando letture ogni 30 s per un massimo di 10 minuti.

5. Saggio di inibizione dell'attività di UCHL3 mediante HA-Ub-VS (saggio HA-Ub-VS)

  1. Preparazione proteica
    1. Scongelare la proteina con ghiaccio, centrifugare il campione a 1000 x g a RT per 3 minuti e determinare la concentrazione proteica utilizzando il metodo BCA. Diluire la proteina a una concentrazione di 10 μg/mL.
  2. Preparazione di piccole molecole
    1. Pesare Danshensu e diluirlo in gradiente utilizzando acqua ad alta purezza a 5 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM e 1 μM.
  3. Impostazione dei gruppi
    1. Impostare il gruppo proteico puro e il gruppo senza farmaci a piccole molecole come gruppi di controllo negativi. Utilizzare PR619 (inibitore DUB) come gruppo di controllo positivo e gli altri gruppi come gruppi di trattamento farmacologico a piccole molecole.
  4. Preparazione del campione
    1. Secondo il raggruppamento, aggiungere in sequenza 9 μL di UCHL3 e 1 μL di Dansensu alle concentrazioni corrispondenti a ciascun gruppo trattato con il farmaco. Aggiungere 1 μL di PR619 (50 μM in uso) al gruppo di controllo positivo. Utilizzare acqua ad alta purezza e tampone 1 per compensare il gruppo di controllo negativo.
    2. Mescolare accuratamente con vortice e incubare a 37 °C per 30 minuti. Posizionare i campioni di reazione sul ghiaccio, aggiungere HA-Ub-VS a una concentrazione finale di 1 μM, mescolare accuratamente mediante vortex e incubare a 37 °C per 30 minuti.
    3. Aggiungere una quantità appropriata di tampone campione 5x e scaldare in un bagno di metallo a 100 °C per 10 minuti. Mettere i campioni a RT per 5 minuti e caricarli sul gel.

6. Macchia occidentale

  1. Preparazione del gel SDS-PAGE
    1. Sciacquare una serie di pannelli di vetro con acqua ultrapura. Posizionare le piastre nella fessura di serraggio, quindi su una tavola trasparente. Aggiungere acqua ultrapura e controllare le perdite per 10 minuti.
    2. Preparare la colla di separazione secondo la tabella di erogazione della colla.
    3. Versare l'acqua ad alta purezza dalla cassetta del gel e assorbire l'acqua rimanente con carta da filtro. Aggiungere rapidamente e uniformemente il gel separatore al 12% preparato. Quindi aggiungere 1 mL di isopropanolo e attendere circa 30 minuti fino a quando il gel non si solidifica.
    4. Preparare lo strato superiore di colla concentrata secondo la tabella di erogazione della colla.
    5. Rimuovere l'isopropanolo dalla parte superiore del gel separatore, lavarlo 3 volte con acqua ad alta purezza e asciugare con carta da filtro. Aggiungere rapidamente il gel da impilare al 3% preparato, inserire un pettine a 15 fori da 1,0 mm e attendere circa 30 minuti.
      NOTA: Tenere il pettine perpendicolare alla superficie della colla e assicurarsi che non appaiano bolle d'aria.
  2. Elettroforesi
    1. Rimuovere verticalmente il pettine e versare una quantità sufficiente di tampone di scorrimento nella camera interna dell'apparecchio per elettroforesi, assicurandosi che il liquido copra i pozzetti del campione.
    2. Posizionare il marcatore proteico e i campioni sperimentali preparati a RT, agitare accuratamente e centrifugare brevemente. Aggiungere 3 μL di marcatore proteico nel primo pozzetto del campione a sinistra, seguiti da 10 μL di campione sperimentale in ogni pozzetto successivo.
    3. Aggiungere una quantità adeguata di tampone di corsa nella camera esterna del serbatoio dell'elettroforesi, coprire il serbatoio con il coperchio e collegare l'alimentatore. Assicurarsi che l'alimentatore sia collegato correttamente.
    4. Accendere l'alimentatore e impostare la tensione a 80 V fino a quando i campioni non si concentrano in linee, quindi aumentare la tensione a 120 V una volta iniziata la separazione nel gel separatore.
      NOTA: Durante il processo, assicurarsi che non si formino bolle sul fondo. Se compaiono bolle, inclinare l'apparecchio di elettroforesi da un lato per espellerle.
  3. Trasferimento su membrana
    1. Usa un coltello di plastica per aprire la cassetta del gel. Tagliare un angolo in alto a sinistra dove il caricamento del campione ha iniziato a segnare l'orientamento. Immergere il gel e la carta da filtro necessaria nel tampone di trasferimento per 1-2 minuti.
    2. Misurare e tagliare la membrana del difluoruro di polivinilidene (PVDF) in base alle dimensioni necessarie per la proteina bersaglio. Attivare la membrana PVDF immergendola in metanolo per 20-1 minuto, quindi immergerla con il gel nel tampone di trasferimento.
    3. Versare una piccola quantità di tampone di trasferimento nell'apparecchio di trasferimento e utilizzare un rullo per bagnare l'unità di trasferimento semi-asciutta. Disponi i componenti nel seguente ordine dal basso verso l'alto: tre strati di carta da filtro, gel, membrana PVDF e altri tre strati di carta da filtro.
    4. Dopo aver posizionato ogni strato, utilizzare il rullo per rimuovere eventuali bolle. Bagnare il coperchio con il tampone di trasferimento e quindi coprire l'apparecchio.
      NOTA: Assicurarsi che sia presente una quantità adeguata di buffer di trasferimento, aggiungendone una piccola quantità dopo aver completato ogni livello. Preparare i segni in anticipo, distinguendo tra i lati sinistro e destro del gel in cui sono stati caricati i campioni, oltre a identificare la parte anteriore e posteriore della membrana. Dopo aver posizionato ogni strato, arrotolare delicatamente per rimuovere eventuali bolle.
    5. Accendere l'alimentazione, assicurandosi della corretta polarità. Regolare la corrente a 190 mA e impostare il tempo su 45 min.
  4. Inceppamento
    1. Preparare una soluzione di latte in polvere scremato al 5% in TBST (1% Tween20) come tampone bloccante. Posizionare la membrana in PVDF con il lato anteriore rivolto verso l'alto in una scatola di ibridazione, versare 10 mL di tampone bloccante e agitare delicatamente su uno shaker a bassa velocità a RT per 1 ora per bloccare.
  5. Incubazione dell'anticorpo primario
    1. Preparare l'anticorpo primario con la soluzione anticorpale1 a 1:1000 e aggiungere 10 mL di anticorpo primario alla nuova scatola di incubazione. Posizionare la scatola di incubazione in una cella frigorifera a 4 °C e tenerla su un agitatore per una notte.
  6. Incubazione dell'anticorpo secondario
    1. Raccogliere l'anticorpo primario nella scatola di incubazione il giorno successivo, quindi aggiungere una soluzione TBST adeguata e posizionarla su uno shaker per lavare per 5 minuti, ripetere 3 volte.
    2. Preparare l'anticorpo secondario con una soluzione di latte al 5% a 1:5000. Far cadere 1 mL di anticorpo secondario sul fondo di una scatola di ibridazione inumidita. Posizionare la membrana in PVDF con il lato proteico rivolto verso il basso sull'anticorpo secondario, quindi incubare a RT su un agitatore a bassa velocità per 1,5 ore.
    3. Aggiungere la soluzione TBST adeguata e posizionarla su uno shaker per lavare per 5 minuti; Ripeti 3 volte.
  7. Esposizione delle strisce
    1. Prelevare volumi uguali di reagenti chemiluminescenti A e B, agitare e mescolare bene. Proteggere la soluzione dalla luce.
    2. Applicare la soluzione di sviluppo in modo uniforme sulla membrana in PVDF, agitandola delicatamente per assicurarsi che la membrana sia rivestita uniformemente con la soluzione.
    3. Posizionare la membrana nel sistema di imaging su gel e impostare il tempo di esposizione, il numero di esposizioni e altri parametri rilevanti.
      NOTA: Lo sviluppatore deve coprire completamente la striscia e lo sviluppo deve essere in un ambiente buio.

Risultati

Per escludere le piccole molecole nella Salvia miltiorrhiza Bge che possono inibire efficacemente UCHL3, abbiamo eseguito il docking molecolare tra le piccole molecole ottenute dal sito web TCMSP con UCHL3. Le prime 30 piccole molecole nei risultati del docking e i loro punteggi sono mostrati nella Tabella 1. I risultati dell'aggancio per tutte le piccole molecole sono presentati nella Tabella supplementare 1. Abbiamo selezionato Danshensu come ...

Discussione

I DUB svolgono un ruolo cruciale nella regolazione dell'omeostasi dell'intero sistema dell'ubiquitina rimuovendo l'ubiquitina dai substrati o dalle catene di poliubiquitina37. Negli ultimi anni, questi enzimi hanno anche attirato molta attenzione come bersagli per lo sviluppo di farmaci13. Tuttavia, ci sono sfide nel processo di sviluppo di farmaci a piccole molecole. Ad esempio, lo screening ad alto rendimento che coinvolge decine di migli...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation di Pechino [sovvenzione numero 7244498].

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
30% AcrylamideBeijing Lablead Biotech Co., LtdA3291
Ammonium persulfateChina National Medicines Corporation Ltd10002616
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074Cell Signaling Technology7074P2
BeyoECL PlusBeyotimeP0018S
Bradford Protein Assay KitBeyotimeP0006
ClonExpress Ultra One Step Cloning KitVazymeC115-01
DanshensuShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdB20254
DMSOAmeresco, Inc.21K2356571
Electrophoresis SystemLiuyi Biotechnology112-0630
HEPESSigmaH3375
His-tagged protein purification kit (NTA-Ni agarose magnetic beads)BeyotimeP2247S
Immun-Blot PVDF Membrane, Roll, 26 cm x 3.3 mBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1620177
Isopropyl alcoholMacklinI811925
M5 Prestained Protein LadderMei5 Biotechnology Co.LtdMF-212-01
MaestroSchrödinger’shttps://www.schrodinger.com/platform/products/maestro/
Methyl alcoholChina National Medicines Corporation Ltd10014108
MF-MilliporeMilliporeHAWP04700
MyFug mini centrifugeSigmaZ764183
Pierce Dilution-Free Rapid Gold BCA Protein AssayThermo ScientificA55860
PR-619Cell Signaling Technology26065S
Primary Antibody Dilution Buffer for Western BlotMacklinP917820
Recombinant Human HA-Ubiquitin Vinyl Sulfone Protein, CFR&D SystemsU-212-025
Recombinant Human Ubiquitin AMC Protein, CFR&D SystemsU-550-050
Skim MilkBecton,Dickinson and Company232100
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Ameresco, Inc.205-788-1
TEMEDAmeresco, Inc.2545C134
Tween 20Beijing Lablead Biotech Co., Ltd0777-1
UCHL3 (D25E6) Rabbit mAbCell Signaling Technology8141T

Riferimenti

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