Sviluppo di un sistema di protoplasti di cavolo per lo studio della tolleranza all'ipossia nelle brassicacee

Riepilogo

Questo protocollo descrive un efficiente sistema di protoplasti di mesofillo di cavolo. Sono stati testati vari trattamenti carenti di ossigeno e il sistema ha mostrato un'elevata attivazione dei geni responsivi all'ipossia, facilitando gli studi sui meccanismi genetici e molecolari della tolleranza all'allagamento nelle verdure delle Brassicaceae .

Abstract

Poiché il cambiamento climatico porta piogge più intense, il cavolo, un ortaggio chiave delle Brassicaceae , deve affrontare significative perdite di resa a causa dello stress da ipossia indotto dalle inondazioni. Per identificare i meccanismi di tolleranza alle inondazioni nei cavoli, è necessaria una piattaforma versatile per studi funzionali genetici per superare la natura recalcitrante alla trasformazione dei cavoli. In questo studio, sono stati sviluppati un sistema di espressione transitoria di protoplasti di cavolo e un corrispondente protocollo di induzione dell'ipossia di protoplasti. Questo protocollo ha raggiunto un'elevata resa e integrità dell'isolamento dei protoplasti dalle foglie di cavolo, con un'efficienza di trasfezione superiore al 40% utilizzando condizioni enzimatiche ottimizzate. Per alleviare la potenziale influenza ipossica prima dei trattamenti, la soluzione W5 è stata fatta gorgogliare con ossigeno gassoso per aumentare i livelli di ossigeno disciolto. Sono state testate diverse sostanze chimiche per la regolazione dei livelli di ossigeno e trattamenti fisiologici di eliminazione dell'ossigeno, tra cui EC-OxyRase, OxyFluor, solfito di sodio e un pacchetto di assorbitori di ossigeno. I saggi a doppia luciferasi hanno mostrato che i promotori dei geni della risposta alla respirazione anaerobica BoADH1 e BoSUS1L sono stati attivati nei protoplasti di cavolo dopo trattamenti di ipossia, con il più alto livello di induzione osservato dopo il trattamento con il pacchetto di assorbimento dell'ossigeno. In sintesi, il sistema di espressione transitoria del protoplasto di cavolo combinato con il trattamento dell'ipossia dimostra una piattaforma efficiente e conveniente. Questa piattaforma può facilitare gli studi sulla funzione genica e sui meccanismi molecolari associati alle risposte all'ipossia nei cavoli.

Introduzione

Il cambiamento climatico globale ha esacerbato le inondazioni, che sono emerse come un problema sempre più critico in tutto il mondo. Negli ultimi decenni si è assistito a una tendenza all'aumento della frequenza degli eventi alluvionali, con conseguenti perdite sostanziali di raccolto ^1,2. Il cavolo (Brassica oleracea var. capitata L.), un ortaggio di notevole importanza globale, è suscettibile agli effetti negativi delle forti piogge, rendendo necessario lo sviluppo di cultivar di cavolo resistenti alle inondazioni per garantire una produzione sostenibile di fronte a eventi meteorologici estremi. Pertanto, comprendere i meccanismi molecolari associati allo stress da inondazione nel cavolo è essenziale per affrontare questa sfida.

Per comprendere i meccanismi di regolazione genica nelle piante in condizioni sommerse, le linee transgeniche sono ampiamente utilizzate per studi funzionali genetici. Tuttavia, questo approccio è limitato dai costi elevati, dai processi di trasformazione e di sottocoltura che richiedono molto tempo, nonché dalle basse efficienze di trasformazione in molte specie di colture, che richiedono lo sviluppo di metodologie alternative. I sistemi di espressione transitoria basati su protoplasti sono stati ampiamente applicati nella ricerca molecolare sulle piante come alternativa versatile ed efficiente. Questi sistemi facilitano lo studio dell'attività del promotore, delle vie di segnalazione in risposta a stimoli ambientali, delle interazioni proteina-proteina o proteina-DNA e della localizzazione subcellulare³. La creazione di sistemi di espressione transitoria dei protoplasti è stata riportata non solo in piante modello ^4,5 ma anche in colture economicamente importanti come la canna da zucchero⁶, il garofano⁷, le orchidee Phalaenopsis ⁸ e la melanzana⁹. Inoltre, questi sistemi sono stati implementati con successo in piante legnose, tra cui Camellia oleifera¹⁰e Populus trichocarpa¹¹. Tuttavia, i protocolli per l'applicazione dei sistemi di protoplasti per studiare le verdure a foglia in condizioni di stress da ipossia indotta da immersione sono limitati. Pertanto, in questo lavoro è stato sviluppato un protocollo integrato per coloro che sono interessati a studiare le risposte all'ipossia negli ortaggi a foglia utilizzando un sistema di espressione transitoria di protoplasti di cavolo.

Per effettuare la risposta all'ipossia indotta da sommersione a livello cellulare, in studi precedenti sono state impiegate diverse metodologie di evavenging dell'ossigeno per simulare ambienti ipossici. Questi includono l'uso di EC-OxyRase, OxyFluor, solfito di sodio e sacche che consumano ossigeno. La EC-ossirasi è tipicamente utilizzata per il trattamento anaerobico nelle linee cellulari umane¹² e nei protoplasti di Arabidopsis ¹³. OxyFluor si è dimostrato efficace nel mitigare il fotosbiancamento causato da specie reattive dell'ossigeno durante l'imaging a fluorescenza su cellule vive^14,15. Il solfito di sodio è stato impiegato nel trattamento anaerobico dei nematodi¹⁶ e, più recentemente, nei protoplasti del riso, in combinazione con tecniche come i saggi di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)¹⁷. I pacchetti di assorbitori di ossigeno, utilizzati principalmente per la coltura batterica anaerobica¹⁸, hanno anche dimostrato efficacia nell'indurre l'attivazione dei promotori ZmPORB1 nei protoplasti di mais in condizioni anaerobiche¹⁹.

Il presente lavoro mira a stabilire una solida pipeline per l'isolamento dei protoplasti di cavolo e l'espressione transitoria. Successivamente, è stata valutata l'efficacia di vari trattamenti di regolazione dell'ossigeno valutando l'attività del promotore dei geni di risposta anaerobica utilizzando saggi a doppia luciferasi. Si prevede che il protocollo sviluppato in questo studio sarà prezioso per la ricerca futura relativa allo stress da sommersione o ipossia nei sistemi Brassicacei .

Protocollo

In questo studio sono state utilizzate due cultivar di cavolo commerciale (B. oleracea var. capitata): 'Fuyudori' e '228'. Nella Figura 1 è mostrata una rappresentazione grafica del flusso di lavoro del protocollo. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione delle piantine di cavolo

1. Semina i semi di cavolo 'Fuyudori' e '228' utilizzando un substrato per piante commerciali in fori rotondi di forma quadrata (P 4,5 cm x H 4,5 cm) di vassoi a 48 pozzetti (L 49 cm x L 28 cm x H 5 cm). Incorpora i semi a circa 1 cm di profondità nel terreno di coltura.
2. Coltivare piantine di cavolo in una camera di crescita a 22 °C con un ciclo luce-buio di 16/8 ore. Mantenere l'intensità luminosa di 100 μmol ^m-2·^s-1 (tubo fluorescente bianco) durante la fase luminosa.
3. Dopo 2-3 settimane di crescita, utilizzare piantine di cavolo allo stadio a 2 foglie per un ulteriore isolamento dei protoplasti del mesofillo.
   NOTA: La dimensione suggerita delle piantine di cavolo è uno stadio a 2 foglie, in cui la seconda foglia vera è completamente espansa, ma la terza foglia vera non è espansa e la sua lunghezza è inferiore a 1 cm (Figura 2A). Per sincronizzare le fasi di sviluppo delle piantine di cavolo, i semi 'Fuyudori' devono essere seminati circa 2 giorni prima dei semi '228' a causa dei loro diversi tassi di crescita. Questa regolazione garantisce una crescita e una maturità uniformi tra le piante di cavolo nella fase desiderata.

2. Isolamento dei protoplasti di cavolo

1. Preparare 12,5 mL di soluzione enzimatica (Tabella 1) prima di ogni isolamento del protoplasto.
   1. Preriscaldare una soluzione con 10 mM di MES (pH 5,7) e 0,6 M di mannitolo a 55 °C. Continuare a riscaldare la soluzione a 55 °C per 10 minuti dopo aver aggiunto l'1,5% di cellulasi R10 e lo 0,75% di macerozima R10.
   2. Dopo che la soluzione enzimatica si è raffreddata a temperatura ambiente (25 °C), aggiungere 10 mM di CaCl₂ e lo 0,1% di albumina sierica bovina (BSA). Filtrare: sterilizzare la soluzione enzimatica preparata in una piastra di Petri da 9 cm utilizzando un filtro per siringa da 0,22 μm.
      NOTA: Il preriscaldamento della soluzione aumenta la solubilità enzimatica e inattiva la proteasi. Gli effetti della digestione variano a seconda dei diversi tipi di enzimi cellulasi. La combinazione di Cellulasi R10 e Macerozyme R10 è adatta per l'isolamento di protoplasti di cavolo.
2. Raccogli le seconde foglie vere appena espanse da cinque a otto piantine di cavolo e tagliale a strisce di 0,5-1,0 mm usando una lama di rasoio affilata. Trasferire immediatamente le strisce fogliari nella soluzione enzimatica appena preparata.
   NOTA: La selezione di foglie sane e designate dal cavolo nella fase corretta è fondamentale. Le seconde foglie vere appena espanse da piantine di cavolo allo stadio a 2 foglie forniscono la massima efficienza di isolamento dei protoplasti. Le piante troppo mature, i cotiledoni o le foglie invecchiate non sono raccomandati per l'isolamento dei protoplasti. Da cinque a dodici foglie vere ben espanse possono produrre con successo protoplasti di cavolo in 12,5 mL di soluzione enzimatica. Il numero di foglie necessarie per l'isolamento dei protoplasti dipende dalla quantità desiderata di protoplasti necessari. Tipicamente, i protoplasti ottenuti da cinque a otto foglie sono sufficienti per le successive procedure sperimentali.
3. Dopo l'infiltrazione sottovuoto al buio per 30 minuti (Figura 2B), tenere le strisce di foglie di cavolo immerse nella soluzione enzimatica (Figura 2C) al buio a temperatura ambiente per altre 4-16 ore.
   NOTA: Il tempo di digestione enzimatica può variare tra le cultivar di cavolo e deve essere ottimizzato in base al genotipo specifico. Ad esempio, il 'Fuyudori' richiede un tempo di digestione più lungo (16 ore) rispetto al '228' (4 ore) a causa delle foglie più spesse di 'Fuyudori'.
4. Diluire la soluzione contenente protoplasti con un volume uguale di soluzione W5, che consiste di 2 mM di MES (pH 5,7), 154 mM di NaCl, 125 mM di CaCl₂, 5 mM di KCl e 5 mM di glucosio (vedere la Tabella 1 per la preparazione), per arrestare la digestione enzimatica.
5. Rilasciare la sospensione del protoplasto facendo roteare delicatamente o utilizzando un agitatore orbitale. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm in una provetta conica da 50 mL.
   NOTA: I protoplasti isolati sono in grado di passare attraverso un filtro cellulare da 70 μm, mentre i detriti vegetali non digeriti vengono trattenuti dal filtro e successivamente rimossi dalla sospensione. I filtri cellulari possono essere riutilizzati e conservati in etanolo al 75% dopo il lavaggio, ma è necessario sciacquare completamente i filtri cellulari con una soluzione W5 per rimuovere l'etanolo residuo prima dell'uso.
6. Centrifugare la soluzione di protoplasti con 150 x g per 2 minuti a 4 °C, quindi rimuovere con cautela il surnatante. Lavare delicatamente i protoplasti pellettati aggiungendo 10 mL di soluzione W5 lungo la parete del tubo conico ad una velocità di flusso approssimativa di 1 mL·^s-1. Centrifugare la provetta a 150 x g per 2 minuti a 4 °C e ripetere nuovamente questa procedura di lavaggio per garantire la completa rimozione della soluzione enzimatica.
7. Risospendere i protoplasti nella soluzione W5 e metterli in ghiaccio per 30 minuti. Dopo l'incubazione del ghiaccio, rimuovere il surnatante con una pipetta da 1 ml alla volta fino a rimuovere tutto il surnatante.
8. Risospendere i protoplasti in una soluzione di MMG pre-raffreddata con ghiaccio composta da 4 mM di MES (pH 5,7), 0,4 M di mannitolo e 15 mM di MgCl₂ (vedere la Tabella 1 per la preparazione).
9. Misurare la concentrazione di protoplasti con un emocitometro e regolare la concentrazione finale a 4 x 10⁵ protoplasti·^mL-1 utilizzando la soluzione MMG.

3. Trasfezione dei protoplasti

1. Mescolare un volume totale di 10 μL di plasmide (5-10 μg) (File supplementare 1) con 100 μL di protoplasti (4 x 10⁴ protoplasti) e porre in ghiaccio per 10 minuti.
   NOTA: Per la purificazione dei plasmidi di grado trasfezione, viene utilizzato un kit di plasmidi disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore. Circa 4 x 10⁴ protoplasti sono tipicamente impiegati in un saggio reporter a doppia luciferasi. Per esperimenti su larga scala, è disponibile una quantità maggiore di protoplasti per la trasfezione. In particolare, circa 2 x 10⁵ protoplasti trasfettati con 10 μg di plasmide mostrano un'efficienza di trasfezione comprovata che varia dal 30% al 40%.
2. Aggiungere un volume uguale (110 μl) di soluzione PEG appena preparata (vedere la Tabella 1 per la preparazione) contenente il 40% di polietilenglicole 4000 (PEG4000), 0,1 M di CaCl₂ e 0,2 M di mannitolo nella soluzione protoplastica e mescolare delicatamente.
3. Incubare la miscela di protoplasti a temperatura ambiente al buio per 10 minuti, quindi aggiungere 440 μL di soluzione W5 per terminare la reazione.
4. Centrifugare i protoplasti trasfettati a 150 x g per 2 minuti a 4 °C e risospendere il pellet in 750 μL di soluzione W5 arricchita di ossigeno. Trasferire i protoplasti risospesi in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti pre-rivestita con BSA all'1%.
   NOTA: La soluzione W5 utilizzata per l'incubazione cellulare deve essere fatta gorgogliare con ossigeno utilizzando un concentratore di ossigeno (~90% di ossigeno) collegato a una pietra porosa per 5 minuti (Figura 2D). A seguito di questo processo di ossigenazione, la concentrazione finale di ossigeno disciolto nella soluzione W5 è aumentata da 7,84 mg· ^L-1 ± 0,05 mg· ^L-1 a 29,18 mg· ^L-1 ± 0,43 mg· ^L-1, misurato con un misuratore di ossigeno disciolto. Il volume della soluzione W5 per la risospensione di protoplasti trasfettati dipende dal tipo di piastra di coltura cellulare tissutale utilizzata. Per le piastre per colture cellulari a 12 o 24 pozzetti, si consiglia di ridurre il volume della soluzione W5 per mitigare lo stress da ipossia durante l'incubazione a causa della maggiore profondità all'interno dei pozzetti. Per il rivestimento BSA, ogni pozzetto della piastra di coltura ha ricevuto 1 mL di soluzione BSA all'1%, che è stata lasciata rivestire i pozzetti per 10 s. La soluzione BSA è stata quindi scartata da ciascun pozzetto e i pozzetti sono stati successivamente riempiti con la soluzione W5. Questa procedura mirava a creare una superficie temporanea non aderente utilizzando BSA, impedendo efficacemente ai protoplasti di attaccarsi alla superficie plastica della piastra di coltura durante le successive fasi sperimentali.

4. Trattamento dell'ipossia su protoplasti di cavolo

1. Condurre trattamenti chimici o di ipossia indotta fisicamente immediatamente dopo la trasfezione dei protoplasti.
   NOTA: Si raccomanda di applicare il trattamento dell'ipossia immediatamente dopo la trasfezione del protoplasto. L'incubazione prolungata dei protoplasti può diminuire la successiva risposta all'ipossia.
   1. Per l'ipossia indotta chimicamente su protoplasti di cavolo, aggiungere OxyFluor, EC-Ossirasi e solfito di sodio alla soluzione di protoplasto W5.
      NOTA: L'utilizzo di 0,6 unità ^di EC-ossirasi, 0,6 unità di ^mL-1 di OxyFluor e 1 g·^mL-1 di solfito di sodio in W5 sono state le condizioni testate in grado di indurre il promotore BoADH1 e BoSUS1L (Figura 3A) con basso danno all'integrità del protoplasto nelle due varietà di cavolo esaminate.
   2. Per l'ipossia indotta da sacca che consuma ossigeno, posizionare due confezioni di assorbitori di ossigeno in un barattolo anaerobico da 3,5 L per creare un ambiente ipossico.
2. Raccogliere i protoplasti trattati con ipossia mediante centrifugazione a 150 x g per 2 minuti a 4 °C. Congelare i protoplasti raccolti utilizzando azoto liquido e conservarli in un congelatore a -80 °C per i saggi successivi.

5. Doppio dosaggio della luciferasi

1. Eseguire il test reporter a doppia luciferasi secondo le istruzioni del produttore con piccole modifiche.
   1. Risospendere i protoplasti di cavolo in 50 μL di tampone di lisi passiva 1x e vortice per 10 s.
   2. Incubare i protoplasti disgregati su ghiaccio per 10 minuti e raccogliere il surnatante dopo la centrifugazione a 10.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
   3. Aggiungere 20 μl di lisato cellulare a ciascun pozzetto della micropiastra. Erogare 100 μl di reagente del saggio della luciferasi II nei pozzetti e misurare l'attività della luciferasi della lucciola utilizzando un lettore di micropiastre.
   4. Aggiungere 100 μl del reagente del test disponibile in commercio a ciascun pozzetto e misurare l'attività della luciferasi Renilla utilizzando un lettore di micropiastre.

Risultati

Questo lavoro ha sviluppato con successo un sistema di espressione transitoria utilizzando protoplasti di cavolo (vedere la Figura 1 per il flusso di lavoro). I protoplasti sono stati isolati da foglie vere di cavolo di 2-3 settimane di dimensioni adeguate (Figura 2A) da cultivar di cavolo commerciali 'Fuyudori' e '228' utilizzando la digestione di cellulasi/macerozima e l'infiltrazione sotto vuoto scuro (Fi...

Discussione

Questo protocollo presenta un metodo semplificato per l'isolamento dei protoplasti da due cultivar di cavolo commerciali. L'efficacia di questo metodo viene valutata principalmente attraverso due parametri critici per il controllo della qualità: la resa di protoplasti vitali e l'efficienza della trasfezione dei protoplasti. L'attuazione di questo protocollo ha portato a una resa superiore a 4,00 x 10⁶ protoplasti·g⁻¹· FW di tessuto mesofillo da entrambe le cult...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-morpholino) ethanesulfonic Acid (MES)	PhytoTech Labs	M825	For enzyme solution preparation
228 cabbage seeds	Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japan)
50 mL Conical Tube	SPL Life Sciences	50050	For enzyme solution preparation
6-well tissue culture plate	Alpha Plus	16106	For protoplast incubation
70 μm cell strainer	Sorfa	SCS701	For protoplast filtration
9-cm Petri dish	Alpha Plus	16001	For enzymatic digestion
Anaerobic jar	HIMEDIA	Anaerobic Jar 3.5 L	For hypoxia treatment
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	For W5 solution preparation and culture plate coating
Calcium chloride	J.T.Baker	131301	For W5 solution and PEG solution preparation
Cellulase R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Desiccator	Tarsons	402030	For vacuum infiltration
D-Glucose	Bioshop	GLU501	For W5 solution preparation
Dissolved oxygen meter	Thermo Scientific	Orion Star A223	For oxygen measurement
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M1902	For enzyme solution, PEG solution, and MMG solution preparation
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1960	For Dual-luciferase reporter assay
EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	For hypoxia treatment
Fuyudori cabbage seeds	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japan)
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR21GIII	For protoplast harvest
Macerozyme R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Magnesium chloride	Alfa Aesar	12315	For MMG solution preparation
Microcentrifuge	Hitachi	CT15RE	For protoplast harvest
Microplate	Greiner	655075	For Dual-luciferase reporter assay
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax Mini	For Dual-luciferase reporter assay
Millex 0.22 μm syringe filter	Merck	SLGP033RS	For enzyme solution preparation
Oil Free Vacuum Pump	Rocker	Rocker 300	For vacuum infiltration
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	For hypoxia treatment
Oxygen absorber pack	Mitsubishi Gas Chemical Company	AnaeroPack, MGCC1	For hypoxia treatment
Oxygen concentrator	UTMOST PERFECT	AII-X	For oxygen-bubbling in W5 solution
Plant substrate	Klasmann-Deilmann	Potgrond H substrate	For cabbage seedlings preparation
Plasmid Midi Kit	QIAGEN	12145	For purification of transfection-grade plasmid DNA
Polyethylene Glycol 4000	Fluka	81240	For protoplast transfection
Potassium chloride	J.T.Baker	304001	For W5 solution preparation
Razor blade	Gillette		For cabbage leaf strips preparation
Sodium chloride	Bioshop	SOD002	For W5 solution preparation
Sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505	For hypoxia treatment
Water Bath	Yihder	BU-240D	For enzyme solution preparation