MEDUSA per l'identificazione dei geni regolatori della morte nei dati di profilazione chemio-genetica

Riepilogo

Questo protocollo descrive come utilizzare il metodo analitico MEDUSA per quantificare l'effetto regolatorio della morte di ciascun gene knockout. Include istruzioni su come determinare le condizioni sperimentali che ottimizzano la sensibilità e un tutorial passo dopo passo sull'esecuzione dell'analisi.

Abstract

Lo screening sistematico delle perturbazioni genetiche di guadagno o perdita di funzione può essere utilizzato per caratterizzare le dipendenze genetiche e i meccanismi di regolazione per essenzialmente qualsiasi processo cellulare di interesse. Questi esperimenti in genere comportano la profilazione da un pool di perturbazioni di un singolo gene e il modo in cui ciascuna perturbazione genetica influisce sulla relativa fitness cellulare. Se applicati nel contesto di studi sull'efficacia dei farmaci, spesso chiamati profili chemio-genetici, questi metodi dovrebbero essere efficaci nell'identificare i meccanismi d'azione dei farmaci. Sfortunatamente, gli studi di profilazione chemio-genetica basati sulla fitness sono inefficaci nell'identificare tutti i componenti di una risposta ai farmaci. Ad esempio, questi studi generalmente non riescono a identificare quali geni regolano la morte cellulare indotta dai farmaci. Diversi problemi contribuiscono a oscurare la regolazione della morte negli screening basati sulla fitness, tra cui gli effetti confondenti della variazione del tasso di proliferazione, la variazione della coordinazione indotta dal farmaco tra crescita e morte e, in alcuni casi, l'incapacità di separare il DNA dalle cellule vive e morte. MEDUSA è un metodo analitico per identificare i geni regolatori della morte nei dati convenzionali di profilazione chemio-genetica. Funziona utilizzando simulazioni computazionali per stimare i tassi di crescita e mortalità che hanno creato un profilo di fitness osservato, piuttosto che assegnare un punteggio alla fitness stessa. L'uso efficace del metodo dipende dalla titolarità ottimale delle condizioni sperimentali, tra cui la dose del farmaco, la dimensione iniziale della popolazione e la durata del test. Questo manoscritto descriverà come impostare uno studio di profilazione chemio-genetica per l'analisi basata su MEDUSA e dimostreremo come utilizzare il metodo per quantificare i tassi di mortalità nei dati di profilazione chemio-genetica.

Introduzione

Nella profilazione chemio-genetica, le perturbazioni genetiche sistematiche vengono utilizzate per comprendere il contributo di ciascun gene a una data risposta al farmaco ^1,2,3. Questi esperimenti sono preziosi e possono rivelare importanti informazioni sulle risposte ai farmaci, tra cui il bersaglio di legame del farmaco e i meccanismi di afflusso/efflusso del farmaco. Tuttavia, poiché questi esperimenti vengono in genere eseguiti in modo aggregato che valuta tutti i geni contemporaneamente, la generazione di intuizioni meccanicistiche dai dati di profilazione chemio-genetica può essere impegnativa.

I meccanismi di controllo e le dipendenze genetiche per la morte cellulare indotta da farmaci tendono ad essere difficili da risolvere nei dati di profilazione chemio-genetica. Ci sono diverse ragioni per questo problema, ma molte di queste derivano dagli impatti della variazione nella proliferazione cellulare⁴. Ad esempio, poiché le cellule proliferano in modo esponenziale, l'effetto di una perturbazione genetica sul tasso di proliferazione ha un impatto maggiore sulla dimensione della popolazione rispetto alla variazione dei tassi di morte cellulare. Inoltre, poiché questa sensibilità distorta si esacerba nel tempo e poiché questi esperimenti vengono in genere eseguiti nell'arco di diverse settimane, la maggior parte degli studi è ottimizzata per essere altamente sensibile ai difetti di proliferazione ed essenzialmente insensibile ai cambiamenti nella morte cellulare indotta dai farmaci. Altri problemi legati alla proliferazione includono il vario coordinamento tra proliferazione e morte (ad esempio, la velocità con cui ogni clone cresce mentre muore, e questo varia tra le perturbazioni genetiche) e le variazioni nei tassi di proliferazione per ciascun clone in assenza di farmaco, che cambia il numero previsto di cellule che avrebbero dovuto/potuto essere recuperate se il farmaco non fosse stato efficace. La linea di fondo è che gli esperimenti di profilazione chemio-genetica generalmente valutano l'impatto delle perturbazioni genetiche utilizzando misurazioni proporzionali alle dimensioni relative della popolazione, confrontando le popolazioni trattate e non trattate. Poiché la dimensione della popolazione è un prodotto sia della crescita cellulare che dei tassi di morte cellulare, dal punto di vista della morte cellulare, la proliferazione rappresenta un'influenza confondente.

Per rimediare a questi problemi, abbiamo creato un metodo per valutare la morte utilizzando un approccio assistito da simulazione (MEDUSA)⁵. MEDUSA funziona interpretando i dati osservati sulla dimensione relativa della popolazione attraverso la lente delle simulazioni computazionali per dedurre la combinazione di tassi di crescita e mortalità indotti dai farmaci che hanno generato la risposta ai farmaci osservata per ciascun clone genetico. Dati precedenti suggeriscono che il metodo può dedurre con precisione come le perturbazioni genetiche influenzano il tasso di mortalità indotta dai farmaci, ma l'accuratezza di questo metodo dipende da una comprensione dettagliata di come la proliferazione cellulare e la morte cellulare sono coordinate da un farmaco e di come questi tassi variano nel tempo ^5,6. Inoltre, le inferenze basate su MEDUSA richiedono che un farmaco venga testato a una dose che provoca una sostanziale morte cellulare. È importante sottolineare che queste condizioni di droga creano ulteriori preoccupazioni sulle dimensioni della popolazione iniziale e sulla lunghezza dei saggi, che dovrebbero essere attentamente considerate e ottimizzate. In questo protocollo, descriviamo come impostare uno studio di profilazione chemio-genetica per l'analisi basata su MEDUSA e forniamo un uso dettagliato di questo metodo analitico. L'obiettivo generale di MEDUSA è determinare in che modo ogni delezione genica influisce sui tassi di crescita e mortalità indotti dai farmaci.

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Protocollo

1. Ottimizzazione della dose del farmaco per indurre la morte cellulare

NOTA: Il protocollo seguente serve per ottimizzare una combinazione di linea cellulare, farmaco e dose utilizzando il test FLICK ^7,8. I dati di esempio per questo protocollo descrivono l'ottimizzazione e lo screening di 5 μM di etoposide nelle cellule U2OS, ma gli stessi passaggi di ottimizzazione potrebbero essere applicati a qualsiasi altra combinazione desiderata di linea cellulare e farmaco/dose. Questo protocollo non richiede la raccolta o l'analisi delle cellule morte. Questo protocollo può essere utilizzato per le colture in sospensione, a condizione che le cellule morte vengano rimosse. Per le colture in sospensione, le cellule morte possono essere selezionate/separate utilizzando un marcatore di vitalità o un marcatore specifico per la morte cellulare.

1. Prima di eseguire un saggio FLICK, ottimizzare il numero di cellule, la permeabilizzazione Triton-X, la concentrazione di SYTOX e le impostazioni di acquisizione del lettore di piastre utilizzando il protocollo dettagliato descritto in⁸.
2. Celle a piastre in piastre nere a fondo trasparente a 96 pozzetti. Le densità di semina tipiche sono di 1500-5000 cellule per pozzetto e questo numero dovrebbe essere ottimizzato per linea cellulare. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO₂ e umidità per 16-24 ore.
3. Preparare le diluizioni del farmaco in terreni contenenti la concentrazione di SYTOX che è stata identificata come ottimale nella fase (1.1). I farmaci sono in genere testati in una serie di diluizioni logaritmiche contenenti 8-12 dosi biologicamente o clinicamente rilevanti.
   NOTA: Alcuni farmaci possono emettere fluorescenza alla stessa lunghezza d'onda del SYTOX, rendendo impossibile la quantificazione con questo test. In questi casi, l'utilizzo di varianti SYTOX che emettono fluorescenza a diverse lunghezze d'onda potrebbe essere vantaggioso. Inoltre, questo test non è in grado di valutare la reazione ai farmaci che influenzano la fluorescenza di SYTOX o impediscono a SYTOX di legarsi al DNA.
4. Lisi una piastra (T0) utilizzando Triton-X alla concentrazione ottimizzata al passo (1.1). Dopo la lisi cellulare, utilizzare un lettore di piastre per misurare la fluorescenza SYTOX e determinare il numero totale di cellule iniziali in base alla relazione empiricamente stabilita tra fluorescenza e numero di cellule (vedere il protocollo FLICK ^7,8).
5. Misurare la fluorescenza di SYTOX nelle piastre sperimentali a T0 utilizzando un lettore di piastre, con impostazioni ottimizzate nel passo (1.1).
6. Monitora il segnale SYTOX nel tempo per tre giorni. Per vincolare i dati cinetici risultanti, utilizzare almeno tre punti temporali al giorno, ciascuno a distanza di 4 ore.
   NOTA: Questo protocollo valuta la morte e la crescita cellulare nell'arco di 3 giorni. Questo periodo di tempo è solitamente sufficiente per i farmaci che inducono la morte; Tuttavia, il test può essere accorciato o allungato per adattarsi a farmaci con cinetica di morte alternativa.
7. Dopo l'ultimo punto temporale, lisare la/e piastra/e sperimentale/i con Triton-X per determinare la dimensione finale della popolazione di ciascuna condizione.
8. Calcolare la vitalità frazionaria (FV) e adattare i dati dell'endpoint alle curve di dosaggio, come descritto nel protocollo FLICK ^7,8.
9. Identificare le dosi di farmaci che inducono circa il 50% di morte cellulare valutando le curve di dose FV.
   NOTA: L'identificazione delle cellule morte mediante SYTOX richiede sia la rottura della membrana plasmatica che la rottura dell'involucro nucleare. Queste membrane necessitano di una manutenzione continua, quindi SYTOX identificherà le cellule morte indipendentemente dal meccanismo di morte cellulare indotto dal farmaco. Tuttavia, questi processi non avvengono con la stessa efficacia per tutte le forme di morte cellulare, il che potrebbe influenzare la capacità di SYTOX di misurare con precisione le cellule morte. Inoltre, diversi meccanismi di morte cellulare produrranno cadaveri cellulari di varia stabilità. Tuttavia, abbiamo scoperto che tutte le forme di morte cellulare testate finora portano al DNA legato al SYTOX (sia all'interno di un nucleo permeabilizzato che nei terreni di coltura cellulare). Questo segnale SYTOX è generalmente stabile per un test di 72 ore, ma può essere monitorato valutando il numero totale di cellule all'inizio e alla fine del test.

2. Selezione della lunghezza del saggio

1. Utilizzando i dati FLICK raccolti nel passaggio 1, calcolare la frazione letale (LF) di ciascuna condizione nel tempo come descritto nel protocollo FLICK ^7,8. Adattare i dati LF cinetici a un modello di morte esponenziale (LED) di ritardo, come descritto in precedenza⁹.
2. Tracciare la LF nel tempo per ogni dose letale identificata nella fase 1. Selezionare una dose e un punto temporale che producano ~50% LF.
   NOTA: Una frazione letale di ~50% arricchisce segnali forti e specifici per la morte nei dati di screening CRISPR, lasciando un numero sufficiente di cellule vive per mantenere la rappresentazione della libreria⁵. Tuttavia, alcuni farmaci saranno limitati dalla precedenza della letteratura o da un intervallo ristretto di dosi che inducono uno specifico fenotipo desiderato. Se la dose è limitata, l'endpoint del test deve essere accorciato o esteso per garantire che la dose desiderata raggiunga ~50% LF. Se la letalità del 50% non è possibile, potrebbe essere necessario aumentare le dimensioni della popolazione iniziale.

3. Determinazione della dimensione iniziale della popolazione

1. Selezionare la dose di farmaco desiderata per ottimizzare ulteriormente lo screening in base all'ottimizzazione di cui sopra.
2. Piastre di celle su piastre da 10 cm in media completo. Ogni condizione deve essere placcata con triplicati tecnici e repliche biologiche sufficienti in modo che le cellule possano essere contate ogni 12-24 ore per la lunghezza dello schermo, compreso il punto temporale T = 0.
   NOTA: Potrebbe essere necessario ottimizzare separatamente il numero di cellule piastrate per le cellule non trattate e quelle trattate, considerando il tasso di crescita netto della popolazione e le dimensioni delle cellule. Le cellule devono generalmente essere piastrate a densità che risultino in una confluenza che non comprometta la salute delle cellule al punto finale del saggio (cioè, per molti tipi di cellule < l'80% confluente). Le cellule trattate e non trattate possono anche essere riplaccate durante lo schermo, se necessario, purché venga mantenuta la rappresentazione della libreria.
3. Incubare le cellule per una notte a 37 °C con CO₂ al 5%.
4. Aggiungere il farmaco alla concentrazione desiderata alle piastre di trattamento. In parallelo, prelevare le cellule da 3 piastre non trattate e contare il numero di cellule vive utilizzando un emocitometro. Colorare le cellule morte con blu di tripano (o un colorante di vitalità comparabile) per assicurarsi che vengano contate solo le cellule vive. Questi dati stabiliscono il numero di celle al punto temporale T = 0.
5. Dopo 12-24 ore, prelevare le cellule da 3 piastre non trattate e 3 trattate e contare il numero di cellule vive. Ripetere la raccolta fino a raggiungere il punto finale del saggio. Per comprendere appieno il farmaco e la cinetica di morte cellulare, si raccomanda di monitorare le cellule vive per 24-48 ore dopo il punto temporale identificato nella fase (2.2).
6. Visualizza i cambiamenti nella vitalità tracciando le dimensioni della popolazione (asse y) nel tempo (asse x).
   NOTA: Sulla base del numero massimo di cellule osservato e della dimensione finale della popolazione, è possibile effettuare una stima approssimativa della frazione letale al punto finale. Questo dovrebbe essere confrontato con i dati di vitalità frazionaria e frazione letale generati utilizzando il saggio FLICK (fase 1.9 e fase 2.2) per garantire che venga raggiunta la quantità attesa di morte cellulare.
7. Identificare il punto temporale con la dimensione della popolazione più piccola. A seconda della quantità di crescita che si verifica in presenza del farmaco, questo avverrà all'inizio o alla fine dello screening CRISPR.
8. Selezionare una dimensione iniziale della popolazione. Assicurati che il numero iniziale di celle sia ottimizzato per mantenere una copertura minima della libreria 500x-1000x su tutto lo schermo.
   NOTA: Ad esempio, la libreria TKOv3 ha 70.948 sgRNA. Per rappresentare questa libreria con una copertura di 500x, è necessario mantenere non meno di 35.474.000 cellule per replicato per condizione per tutta la durata del test. Questa dimensione della popolazione del collo di bottiglia si verifica spesso all'inizio del test o dopo la tripsinizzazione e il sottocampionamento per condizioni non trattate o proliferanti. Al contrario, la dimensione della popolazione del collo di bottiglia è spesso dettata dalla dimensione della popolazione all'endpoint del test per i trattamenti farmacologici che inducono una letalità sostanziale.
9. Se lo si desidera, ripetere l'ottimizzazione sopra sulle piastre che verranno utilizzate per lo schermo CRISPR (ad esempio, piastre da 15 cm) per confermare che l'efficacia del farmaco scala correttamente.

4. Esecuzione della schermata CRISPR

NOTA: Le cellule possono essere sottoposte a screening utilizzando i metodi di screening CRISPR consolidati in seguito all'ottimizzazione della dose del farmaco e della lunghezza del test. Protocolli consolidati, come il protocollo di screening TKO del laboratorio Moffat^10,11, possono essere utilizzati per preparare la libreria di screening CRISPR, produrre virus, eseguire lo screening CRISPR e preparare le librerie per il sequenziamento (Figura 1A-B). Il protocollo seguente descrive le fasi specifiche dell'analisi MEDUSA, che devono essere eseguite sui dati a livello di conteggio dopo il sequenziamento.

1. Calcolare le variazioni di piega osservate sperimentalmente per ciascun sgRNA (Figura 1C) come descritto di seguito.
   1. Genera una tabella di conteggio a livello di sgRNA per preparare i dati di sequenziamento per l'analisi. Trim e mappatura delle librerie di sequenziamento utilizzando pipeline standard, come descritto ^5,12.
   2. Normalizza la profondità della libreria di sequenziamento. Normalizza le librerie manualmente o utilizzando funzioni integrate come quelle in DESeq2, come in ^5,12. Esegui la normalizzazione su tutte le guide o utilizzando la distribuzione di guide non di targeting.
   3. Assegna in modo casuale sgRNA non mirati a geni non mirati. Ad esempio, una libreria con quattro sgRNA per gene dovrebbe avere quattro sgRNA non bersaglio per gene non bersaglio.
   4. Per ogni confronto di interesse (non trattato/T0 e/o trattato/non trattato), calcolare il log2(fold-change). Si consiglia di calcolare questo utilizzando un adattamento parametrico in DESeq2, sebbene sia possibile eseguire anche un calcolo manuale della modifica della piega.
   5. Taglia gli sgRNA con un basso numero di conteggi. La corretta strategia di taglio dipenderà dal livello di rumore tra le repliche e da come questo varia nel corso dei conteggi. Queste funzionalità variano a seconda della libreria CRISPR e testano più cutoff in parallelo per nuovi dati. Le strategie di cut-off comuni basate su precedenti di letteratura includono la rimozione del 5% più basso delle guide o la rimozione delle guide al di sotto di una certa soglia nominale¹³.
2. Determinare l'impatto di ogni singolo gene knockout sul tasso di crescita come descritto di seguito.
   1. Calcolare il tasso di crescita netto della popolazione (NPG) delle cellule non trattate (cioè il tempo di raddoppio della popolazione osservato, Figura 1D). Questo può essere estratto dai dati FLICK nella fase 1, dalla conta delle cellule vive nel tempo nella fase 3 o da precedenti misurazioni sperimentali per la linea cellulare di interesse.
   2. MEDUSA richiede tre parametri per modellare la condizione non trattata: NPG: tasso di crescita netto della popolazione, in raddoppi/h; T_start: Punto orario di partenza, in h. Questo valore è impostato su un valore predefinito di 0; Tendere_unt: Punto temporale finale per la condizione non trattata, in h.
   3. Simula tutte le possibili perturbazioni del tasso di NPG. Utilizzare un ciclo for per valutare un intervallo di possibili valori NPG. Per ogni tasso di crescita relativo, calcolare il log2 (variazione) che verrebbe osservato all'endpoint del saggio.
   4. Per ogni sgRNA sperimentale nel passaggio 4.1.5, identificare il fold-change simulato più vicino ai dati osservati. Assegna il tasso di crescita relativo che ha portato al cambio di piega simulato a quell'sgRNA.
3. Caratterizzare la coordinazione tra crescita e morte come descritto di seguito.
   NOTA: I parametri richiesti per MEDUSA possono essere estratti da dati in stile FLICK se analizzati con il metodo di analisi GRADE¹⁴. A tale scopo è possibile utilizzare i dati di (1) e (2) oppure eseguire un ulteriore esperimento di parametrizzazione.
   1. MEDUSA utilizza quattro parametri per caratterizzare la coordinazione tra crescita e morte in presenza di farmaci: GR_drug1: Tasso di crescita indotto dal farmaco prima dell'insorgenza della morte, in raddoppi/h; D_O: Tempo di insorgenza della morte, in h; GR_drug2: Tasso di crescita indotto da farmaci dopo l'insorgenza della morte, in raddoppiamenti/h; _Droga DR: Tasso di mortalità indotta da farmaci, in unità di frazione letale/h. Per parametrizzare il D_O, utilizzare la cinetica LF. Estrarre il tempo di insorgenza della morte dall'adattamento del LED.
4. Determinare_{il farmaco} DR utilizzando la cinetica LF. Determinare il tasso medio di mortalità dividendo il LF finale per il tempo successivo all'insorgenza della morte (in h).
5. Determinare il_{farmaco GR1} dai dati di conteggio delle cellule vive nel passaggio 3. Prima dell'insorgenza della morte, determinare il tasso di crescita indotto dal farmaco adattando i dati a una semplice equazione esponenziale.
   1. Determinare il_{farmaco GR2} utilizzando una combinazione di dati della fase 3 e del farmaco GRADO¹⁴. Calcolare e tracciare il GRADE per la dose di farmaco selezionata su un grafico GRADE. Se GRADO = 0, assumere che GR_drug2 sia 0; Se GRADE > 0, utilizzare GRADE per determinare il tasso di crescita medio della popolazione. Sulla base del valore determinato sperimentalmente per il_{farmaco GR1}, determinare il valore per il_{farmaco GR2} che risulta nel tasso di crescita medio osservato.
      NOTA: Il tasso di crescita medio indotto da un farmaco può essere dedotto da un grafico GRADE calcolando la distanza a coppie tra il punto dati osservato (cioè una coppia di dati GR e FV per un farmaco) e ciascun punto che compone lo spazio GRADE e identificando il punto più vicino. Per istruzioni dettagliate, vedere il riferimento¹⁴. I tassi di crescita e di mortalità indotti dai farmaci non sono valori fissi per farmaco e sono specifici per un farmaco a una data dose in un dato contesto cellulare.
6. Genera cambi di piega simulati per tutte le possibili combinazioni di tasso di crescita e tasso di mortalità, come descritto di seguito.
   1. Utilizzando il coordinamento determinato sperimentalmente del tasso di crescita indotto da farmaci e del tasso di mortalità, costruire un modello che simuli le dimensioni della popolazione indotta da farmaci nel tempo (Figura 1D). Questo modello può essere costruito come una funzione a tratti che combina due fasi indipendenti della risposta al farmaco (tempo di insorgenza pre e post-morte).
   2. Per un modello MEDUSA completo, includere questi otto parametri: NPG: Tasso di crescita netto della popolazione, in raddoppi/h; GR_drug1: Tasso di crescita indotto da farmaci prima dell'insorgenza della morte, in raddoppiamenti/h; D_O: Tempo di insorgenza della morte, in h; GR_drug2: Tasso di crescita indotto da farmaci dopo l'insorgenza della morte, in raddoppiamenti/h; _Droga DR: Tasso di mortalità indotta da farmaci, in unità di frazione letale/h; T_start: Punto orario di partenza, in h. Questo valore è impostato su un valore predefinito di 0; Tendere_unt: Punto temporale finale per la condizione non trattata, in h; Tend_tr: Punto temporale finale per la condizione trattata, in h.
   3. Per il modello di base, simulare tutte le possibili perturbazioni della crescita e del tasso di mortalità. Per ogni combinazione, calcolare il log2 (cambio di piega) che verrebbe osservato.
      NOTA: In MEDUSA, si assume che le perturbazioni del tasso di crescita siano proporzionali tra NPG, GR_drug1 e GR_drug2. Ad esempio, una riduzione dell'80% del tasso di NPG si traduce anche in una riduzione dell'80% di entrambi i tassi di crescita indotti dai farmaci.
7. Dedurre il tasso di mortalità di ogni knockout (Figura 1D-E) come descritto di seguito.
   1. Per ogni sgRNA, triangolare il tasso di mortalità indotto dal farmaco che avrebbe prodotto il cambiamento di piega osservato. Innanzitutto, estrarre il tasso di crescita relativo determinato al passo (4.2.4).
   2. Determinare i tassi per_{il farmaco GR1} e il_{farmaco GR2}. Applicare il tasso di crescita relativo da NPG per calcolare un tasso di crescita proporzionale per_{il farmaco GR1}/farmaco_GR2.
   3. Utilizzando i vincoli di NPG,_{GR drug1} e GR_drug2, identificare il fold-change simulato più vicino al fold change osservato per ciascun sgRNA (trattato/non trattato). Utilizza una combinazione di queste osservazioni per calcolare a ritroso il tasso di mortalità indotta da farmaci.
8. Calcola i tassi di crescita a livello genico e i tassi di mortalità come descritto di seguito.
   1. Determinare i tassi a livello di gene per ogni gene nella libreria. Calcola la media per ogni tasso di crescita e il tasso di mortalità per tutti gli sgRNA associati a un dato gene (tipicamente 4-10).
   2. Per calcolare i valori p empirici, avviare i dati a livello di sgRNA. Eseguire una correzione FDR con la procedura di Benjamini-Hochberg.
      NOTA: Le istruzioni complementari, così come i dati di esempio per l'analisi dei dati di screening CRISPR utilizzando MEDUSA, sono inclusi nel nostro repository GitHub (https://github.com/MJLee-Lab/MEDUSA).

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Risultati

Utilizzando questo protocollo, abbiamo esplorato le dipendenze genetiche della morte indotta da etoposide nelle cellule U2OS. L'etoposide è una chemioterapia comunemente usata che danneggia il DNA¹⁵. Questo esperimento di profilazione chemio-genetica è stato eseguito utilizzando la libreria GeCKOv2¹⁶ in Cas9 che esprime cellule U2OS⁵. In questi tipi di esperimenti, la funzione genica è tipicamente dedotta dall'abb...

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Discussione

In questo protocollo, descriviamo l'uso del metodo analitico MEDUSA per quantificare i dati di profilazione chemio-genetica per valutare come le perturbazioni genetiche alterano i tassi di crescita e mortalità indotti dai farmaci. Poiché l'output primario di un esperimento di profilazione chemio-genetica è correlato alla dimensione della popolazione, non ai tassi, i tassi sottostanti vengono dedotti utilizzando simulazioni. Pertanto, le fasi critiche del metodo sono l'accurata paramet...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mm Fisherbrand TC Dishes	Fisher Scientific	FB012924	For growing cells and optimizing population size
150mm Fisherbrand TC Dishes	Fisher Scientific	FB012925	For growing cells and optimizing population size
DESeq2	R Package	v1.44.0	For calculating fold-change
DMEM	Corning	10017CV	For seeding and drugging cells
DMSO	Fisher Scientific	MT-25950CQC	For seeding and drugging cells
Fisherbrand 96-Well, Cell Culture-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Fisher Scientific	FB012932	For seeding and drugging cells (pin plate)
Greiner Bio-One CELLSTAR μClear 96-well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate	Greiner	655090	For seeding and drugging cells
MATLAB	Mathworks	R2024a	For performing FLICK, GRADE, and MEDUSA
Microplate fluorescence reader	Tecan	Spark	For dead cell measurements
Sytox Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	For dead cell measurements
TKOV3 CRISPR library	Addgene	125517	For performing CRISPR screen
Triton-X 100	Thermo Fisher Scientific	J66624-AP	For permeabilizing cells
Trypan blue	Corning	MT25900CI	For measure live/dead cells