Etichettatura in vitro di cellule staminali embrionali umane per la Risonanza Magnetica

Riepilogo

In questo video, ci mostra come etichetta cellule staminali embrionali umane (hESC) con cloruro di manganese (MnCl ₂), Che possono entrare nelle cellule attraverso i canali voltaggio-dipendenti del calcio quando le cellule sono biologicamente attivi. Inoltre, ci mostrano l'uso di MnCl ₂ Cellulare come agente di contrasto per risonanza magnetica per determinare la fattibilità in vitro di hESC.

Abstract

Cellule staminali embrionali umane (hESC) hanno dimostrato la capacità di ripristinare i feriti miocardio. Risonanza magnetica (MRI) è emerso come una delle modalità di imaging predominante per valutare il restauro dei feriti miocardio. Inoltre, ex-vivo agenti etichettatura, come ad esempio nanoparticelle di ossido di ferro, sono stati impiegati per tracciare e localizzare le cellule staminali trapiantate. Tuttavia, questo metodo non controlla una proprietà fondamentale della biologia cellulare per quanto riguarda la vitalità delle cellule trapiantate. È noto che il cloruro di manganese (MnCl ₂₎ entra nelle cellule attraverso voltaggio-dipendenti del calcio (Ca ^{2 +)} canali quando le cellule sono biologicamente attivi e si accumula nelle cellule per generare T ¹ effetto accorciamento. Pertanto, si consiglia di manganese-guidata risonanza magnetica può essere utile per monitorare la vitalità cellulare dopo il trapianto di hESC nel miocardio.

In questo video, ci mostrerà come etichetta hESC con MnCl ₂ e come queste cellule può essere vista chiaramente utilizzando la risonanza magnetica in vitro. Allo stesso tempo, l'attività biologica di Ca ^{2 +-canali} saranno modulati utilizzando sia Ca ^{2 +} canali agonista e antagonista per valutare le variazioni del segnale concomitanti.

Protocollo

Etichettatura di manganese di cellule staminali embrionali umane

1. Trypsinize i gambi embrionali umane che sono state coltivate in alimentazione priva di condizioni per 5 minuti. Neutralizzare la tripsina aggiungendo terreni di coltura.
2. Spin giù le cellule per centrifugazione a 800 rpm per 5 minuti a 20 ° Celsius. Dopo aver ri-sospendere il pellet di cellule, contare il numero di celle trypan colorazione blu. Sulla base della conta delle cellule ottenute, dividere le cellule in quattro aliquote di 3 milioni di cellule in provette coniche. Agglomerare le cellule di nuovo per centrifugazione.
3. Appena prima di iniziare l'etichettatura manganese, sciogliere fresco con una soluzione di cloruro di manganese, sodio cloruro 0,9% per ottenere una soluzione di cloruro di manganese 0,1 mm.
4. Al fine di osservare l'attività dei canali del calcio, quattro campioni sono stati preparati. Il primo esempio è il nostro controllo che contiene le cellule incubate nello 0,9% di cloruro di sodio da solo. Il secondo campione contiene cellule incubate in 0,1 mM MnCl _2. Esempio 3 e 4 contengono cellule incubate in mM MnCl 0,1 ₂ sia con 5 micron di Ca ^{2 +} canali agonista, (s )-(-)- Bay K8644, o 250 mM di Ca ^{2 +} canali antagonista, verapamil. Incubare i quattro campioni a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 30 minuti.
5. Dopo 30 minuti, centrifugare le cellule a 800 rpm per 5 minuti a 20 ° Celsius. Poi aspirare il surnatante e lavare le cellule marcate due volte con PBS. Dopo il lavaggio, risospendere ogni pellet con 200 l di PBS e trasferimento in provette PCR. Questi granuli sono generalmente bianchi.

Etichettatura di ferro di cellule staminali embrionali umane

1. Mix clinico-grade solfato di protamina con acqua distillata per ottenere un 1 mg / ml soluzione madre.
2. In una provetta contenente staminali embrionali umane terreni di coltura di cellule, aggiungere ferumoxides a 100 mg / ml seguito da aggiunta di 12 mg / ml di solfato di protamina. Miscelare la soluzione vigorosamente per cinque minuti.
3. Aggiungi soluzione mista alla quantità uguale di terreni di coltura della cellula di raggiungere una concentrazione finale di 50 mg / ml di ferumoxides e 6 mg / mL di solfato di protamina alle cellule etichetta. Incubare le cellule in questa soluzione per 12 ore.
4. Lavare le cellule due volte con PBS, con l'ultimo lavaggio contenenti eparina 10U/ml di sciogliere la extracellulare ferumoxides-protamina solfato complesso. Dopo il lavaggio, trypsinize cellule per ottenere una sospensione singola cellula.
5. Contare le celle e aliquota nel numero di campioni. Dopo il lavaggio, risospendere ogni pellet con 200 l di PBS e trasferimento in provette PCR. Questi pellet dovrebbe essere arancione scuro di colore marrone.

Esecuzione di Cellular risonanza magnetica

1. Fai un fantasma al fine di stabilizzare i tubi contenenti il ​​pellet cellulare e anche per evitare artefatti da l'aria circostante durante la scansione. Per farlo, mescolare 0,8% di agar e l'1% di solfato di rame in acqua distillata e portare ad ebollizione per microonde per 5-7 minuti. Raffreddare il composto per almeno 1 ora prima della scansione per ottenere un gel.
2. I tubi contenenti i pellet cella etichettata vengono inseriti nella fantasma per la scansione. In vitro cellulare risonanza magnetica viene eseguita a 3T MRI Signa HDx (GE Medical Systems) utilizzando bobina clinico del ginocchio.
3. Scansione le cellule manganese etichettati per ciascuno dei tre campioni utilizzando una sequenza spin echo: TR, tempo di ripetizione = 800 msec. TE; tempo Echo = minimo, FOV, campo di vista = 12 x 12 cm; matrice = 256x256, NEX 1.
4. Scansione le cellule ferro etichettati utilizzando un gradiente-echo. Noi utilizzare i seguenti parametri per questo l'imaging: TR = 100 msec; = 30 ° angolo di vibrazione;; FOV = 12 x 12 cm; matrice = 256 x 256, NEX 1 TE = 10 msec, FA.

Analisi dei risultati MRI

1. Analizzare le immagini di risonanza magnetica da 4 diversi campioni di cellule manganese marcato:
   • Esempio # 1 è il nostro controllo che contiene cellule incubate nello 0,9% di cloruro di sodio da solo.
   • Esempio # 2 contiene cellule incubate in 0,1 mM MnCl _2.
   • Esempio # 3 contiene cellule incubate in mM MnCl 0,1 ₂ con 5 mM di Ca ^{2 +} canali agonista, (s )-(-)- Bay K8644.
   • Esempio # 4 contiene cellule incubate in mM MnCl 0,1 ₂ con 250 mM di Ca ^{2 +} canali antagonista, verapamil.
2. Come previsto, le differenze di intensità di segnale da manganese cellule marcate sono visibili. Rispetto alle cellule etichettate esclusivamente con manganese, l'intensità del segnale aumenta chiaramente in presenza di agonisti dei canali del calcio e diminuisce in presenza di antagonista dei canali del calcio. L'area in cui l'intensità del segnale è aumentata per il manganese cellule marcate sono misurati utilizzando immagini J (NIH, Bethesda, MD, USA). Lo stesso software viene utilizzato per analizzare la zona di buio fuori risonanza segnale dal ferro cellule marcate. La dimensione del segnale scuro dal ferro marcato le cellule dipende dal numero di cellule o il numero di particelle di ferro contenuta da parte delle cellule. In questo caso, Un milione di cellule mostra un'area più piccola di segnale scuro rispetto al segnale dai tre milioni di celle.

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Discussione

Questi risultati indicano che il manganese si entra attraverso il voltaggio-dipendente dei canali del calcio, manganese e può essere usato come agente di contrasto per risonanza magnetica, che può anche mostrare la vitalità cellulare. Pertanto, si consiglia di manganese-guidata risonanza magnetica può essere utile per monitorare la vitalità cellulare dopo il trapianto di cellule staminali embrionali umane nel miocardio.

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese chloride tetrahydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	M8054
(S)-(-)-Bay K8644	Reagent	Sigma-Aldrich	B133
(+)-Verapamil hydrochloride, minimum 99.0% titration	Reagent	Sigma-Aldrich	V4629
Sodium Chloride 0.85-0.90% W/V	Reagent	VWR international	VW 3257-1
Feridex I.V.	Reagent	Berlex Laboratories	NDC 59338-7035-5	ferumoxides injectable solution 11.2mg iron/mL
Protamine sulfate	Reagent	American Pharmaceutical Partners	NDC 63323-229-05	50 mg (10 mg/mL)
Knockout SR (Serum replacement for ES cells)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828
DMEM/F12 (1:1)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11330
2- mercapt–thanol 98+%	Reagent	Sigma-Aldrich	M 3148
L-Glutamine 200mM 100x	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030
Penicillin-Streptomyocin 10,000 units/ml	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
MEM Non-Essential Amino Acids 100x solution	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140
Signa HDx 3T MRI	Tool	GE Healthcare
clinical Knee coil	Tool	GE Healthcare
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190