Rendendo Patch-pipette e Elettrodi Sharp con un estrattore programmabile

Riepilogo

Questo video mostra come utilizzare un estrattore programmabile per rendere pipette cerotto e gli elettrodi taglienti per elettrofisiologia. La stessa procedura può essere usato per fare una varietà di strumenti in vetro, tra cui aghi da iniezione.

Abstract

Microelettrodi di vetro (chiamato anche pipette) sono state un cavallo di lavoro di elettrofisiologia per decenni. Oggi, pipette quali sono realizzati in vetro capillari con un estrattore programmabile. Tali strumenti di calore il capillare utilizzando un filamento di metallo o di un laser e tirare fuori il vetro con la gravità, un motore o entrambi. Pipette per il patch-clamp registrazione si formano con il calore e solo la gravità, mentre gli elettrodi taglienti per la registrazione intracellulare utilizzare una combinazione di calore, la gravità, e un motore. La procedura utilizzata per rendere pipette di registrazione intracellulare è simile a quello usato per fare aghi da iniezione per una varietà di applicazioni, tra cui l'iniezione cRNA in ovociti di Xenopus. In generale, capillare di vetro <1,2 mm di diametro è usato per fare pipette per la registrazione di patch clamp, mentre la stretta di vetro è utilizzato per la registrazione intracellulare (diametro esterno = 1,0 mm). Per ogni strumento, l'estrattore è programmato in modo leggermente diverso. Questo video mostra come fare entrambi i tipi di pipette di registrazione con programmi prestabiliti estrattore.

Protocollo

Pipette tirando

Utilizzando un microelettrodo estrattore come il P-97 Sutter Flaming / Brown, tirare un insieme di circa 10-20 pipette.

1. Selezionare il capillare di vetro. Noi usiamo borosilicato capillari (Sutter BF150-110-10, 1,5 millimetri di diametro esterno, diametro interno 1,1 millimetri, 10cm di lunghezza). Conservare con cura il vetro in modo che rimane pulito e senza polvere.
2. Progettare un programma di trazione. Usiamo un programma STEP 5, con il calore discendente e velocità ad ogni passo, e un divano piccolo il passo finale. Ricettario pipetta Sutter è un riferimento eccellente per lo sviluppo di programmi adatti.
3. Esaminare i puntali al microscopio per determinare diametro di apertura e morbidezza. Eliminare ruvido, consigli irregolare, o irregolari. Un protocollo dovrebbe garantire una buona trazione questi sono rari. Per standard di patch-clamp registrazione, aperture punta dovrebbe essere del diametro di 1-3 micron. Un cono ripido (punta smussata) porta ad una minore resistenza per il diametro dell'apertura stessa. Forma e dimensioni possono essere modificate con la lucidatura di pressione.

Fuoco lucidatura pipette

1. Impostare un impianto di lucidatura (microforge) con un filamento di platino riscaldamento controllato da un pedale. Un kit utile è disponibile da ALA scientifico (CPM-2) o di un apparecchio simile può essere assemblato pezzo per pezzo.
2. Opzionale: Cappotto la pipetta con un isolante per ridurre capacità e migliorare le caratteristiche del rumore. Noi usiamo per impronte dentarie. Sylgard 184 ™ (poli-dimetil silossani elastomero noto anche come PDMS) è anche un'opzione.
3. Se si utilizza la cera, tenere una piccola scorta fuso nelle vicinanze. Con la pressione dell'aria sul retro della pipetta per mantenere cera di entrare nella pipetta, immergere brevemente punta nella cera liquida e rimuovere. Con Sylgard, elastomeri negozio preparato in aliquote e congelati dipingere la punta della pipetta al microscopio. Di calore per curare l'elastomero.
4. Posizionare la pipetta (patinata o meno) l'apparato lucidatura e portare la punta ~ 50 micron dal filamento. Tieni presente che il filamento si espande quando riscaldato.
5. Consigliato: Seguire il protocollo separato per "lucidare pressione" per cambiare la forma della pipetta per la resistenza ottimale e diametro della punta.
6. Un impulso di calore breve (1-2 secondi) è sufficiente a rimuovere la cera dalla punta della pipetta e liscia del vetro.
7. Posizionare la pipetta finito in una scatola chiusa per proteggere dalla polvere, ripetere per 10 pipette di successo.

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Discussione

Il protocollo è illustrato qui di uso quotidiano nei laboratori di elettrofisiologia ed è anche usato per fare aghi da iniezione di cellule e animali. Con un estrattore programmabile, è facile fare pipette per una varietà di usi. Con attenzione e cura, il filamento sul vostro estrattore durerà per un anno o più. Buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	P-97	Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries	Reagent	Sutter Instrument Co.	BF150-86-10	Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.