Etichettatura selettiva di proteine ​​della superficie cellulare utilizzando CyDye DIGE Coloranti Fluor Minimal

Riepilogo

Un metodo semplice e specifico è stato dimostrato per la marcatura fluorescente e la rilevazione maggiore di proteine ​​di superficie cellulare, senza un passo di frazionamento. Abbondanza differenziale di proteine ​​della superficie cellulare è stato analizzato mediante elettroforesi bidimensionale (2-D) e Ettan ™ tecnologia DIGE.

Abstract

Proteine ​​di superficie sono fondamentali per la capacità della cellula di reagire al suo ambiente e di interagire con le cellule vicine. Essi sono noti per essere induttori di quasi tutti i segnali intracellulari. Inoltre, essi svolgono un ruolo importante nell'adattamento ambientale e trattamento farmacologico, e spesso sono coinvolti nella patogenesi della malattia e patologia (1). Interazioni proteina-proteina sono intrinseche vie di segnalazione, e per ottenere un quadro più chiaro in questi complessi processi biologici, metodi sensibili e affidabili sono necessari per lo studio delle proteine ​​di superficie delle cellule. Bidimensionale (2-D) elettroforesi è ampiamente utilizzato per il rilevamento dei biomarcatori e altri obiettivi in ​​campioni di proteine ​​complesse per studiare i cambiamenti differenziale. Proteine ​​di superficie cellulare, in parte a causa della loro abbondanza basso (1 2% di proteine ​​cellulari), sono difficili da individuare in un 2-D gel senza frazionamento o qualche altro tipo di arricchimento. Sono anche spesso poco rappresentati in 2-D gel a causa della loro natura idrofobica e ad alto peso molecolare (2). In questo studio, presentiamo un nuovo protocollo per le cellule intatte mediante CyDye DIGE coloranti Fluor minimi specifici per l'etichettatura e la rilevazione di questo importante gruppo di proteine. I risultati hanno mostrato specifici dell'etichettatura di un gran numero di proteine ​​di superficie delle cellule con l'etichettatura minimo di proteine ​​intracellulari. Questo protocollo è rapido, semplice da usare, e tutti CyDye tre DIGE coloranti Fluor minima (Cy 2, 3 e Cy Cy 5) può essere usato per etichettare superficie cellulare delle proteine. Queste caratteristiche consentono di multiplexing utilizzando il 2-D elettroforesi su gel a fluorescenza Differenza (2-D DIGE) con tecnologia DIGE Ettan e l'analisi dei cambiamenti dell'espressione proteica con DeCyder 2-D Software differenziale di analisi. Il livello di superficie cellulare delle proteine ​​è stato seguito durante il digiuno nel siero di cellule CHO per varie lunghezze di tempo (vedi tabella 1). Piccoli cambiamenti in abbondanza sono stati rilevati con elevata precisione, ed i risultati sono supportati da definire metodi statistici.

Protocollo

Coltura cellulare

1. Crescere le cellule ovariche di criceto cinese (CHO-K1) utilizzando le procedure standard di coltura cellulare in F-12 di media Ham con GlutaMAX ho contenente il 10% di siero fetale bovino, 50 U / ml di penicillina, e 50 mg / ml di streptomicina solfato (Invitrogen).
2. Scambio terreno di coltura di siero di supporti liberi. Etichetta proteine ​​di superficie della cellula erano in diversi momenti con CyDye DIGE Fluor Cy3 o Cy5 coloranti minima (vedi cellulare Etichettatura sezione di superficie, sotto).
3. Un numero uguale di cellule piscina da ogni punto di tempo e l'etichetta con CyDye DIGE Fluor Cy2. Utilizzare questi come standard interno per ogni 2-D gel.
4. La maggior parte degli esperimenti può essere effettuata con cellule CHO-K1, ma fibroblasti embrione di topo (L1 3T3) e ascite linfoma di topo linfoblasti (EL4) può anche essere usato (dati non riportati).
5. Crescono i due tipi di cellule quest'ultimo in DMEM media con GlutaMAX II, ma, in caso contrario, l'uso identiche condizioni utilizzate per la cellule CHO-K1.

Superficie cellulare etichettatura

1. Con attenzione staccare cellule aderenti non-enzimaticamente, il conteggio e la divisione in aliquote di 5-10 x 106 cellule. Per le cellule crescono in sospensione, omettere il passaggio distacco.
2. Centrifugare la sospensione cellulare a circa 800 xg per 5 minuti. Rimuovere il surnatante contenente il mezzo.
3. Lavare il pellet da resuspendion in soluzione salina bilanciata 1 ml ghiacciata di Hank (HBSS) pH 8.5. Centrifugato a 800 xg a 4 ° C per 2 minuti.
4. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di buffer etichettatura ghiacciata (HBSS pH 8,5, 1 M urea).
5. Etichetta le cellule intatte con 600 pmol CyDye DIGE coloranti Fluor minimo per 20 minuti in ghiaccio al buio.
6. Placare la reazione aggiungendo 20 l 10 mM lisina. Incubare per 10 minuti.
7. Lavare la superficie marcato le cellule due volte da risospensione in 500 microlitri HBSS pH 7,4, seguita da centrifugazione a 800 xg a 4 ° C per 2 minuti.

Lisi cellulare e frazionamento

1. Lisare la superficie marcata con cellule in 150 microlitri di buffer di lisi freddo (7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 30 mM Tris, 5 mM acetato di magnesio pH 8,5). Lasciare in ghiaccio per almeno 1 h con vortex occasionali.
2. Centrifugare il lisato a 10 000 xga 4 ° C per 5 minuti. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Questo esempio è il non-frazionata campione che contiene tutte le proteine ​​cellulari.
3. In parallelo, lavare pellet cellulari, come sopra, poi frazionare (utilizzando un kit di frazionamento membrana, Pierce) in frazioni di membrana e citosolici prima di 2-D elettroforesi su gel. La frazione membrana interna e contiene proteine ​​di membrana delle cellule di superficie.
4. Per confronto, seguire la procedura standard di Ettan DIGE ³ e lisare, etichetta, e, infine, frazionare le cellule. Determinare la concentrazione di proteine ​​nei campioni con il 2 - D Quant Kit (GE Healthcare).

2-D elettroforesi

1. Reidratare gel DryStrip Immobiline, pH 3-11NL (24 cm) con vassoio Immobiline DryStrip Reswelling, 24 cm in 450 ul di soluzione di reidratazione DeStreak (0,5% IPG buffer) durante la notte.
2. Applicare il CyDye marcato campioni (corrispondenti a 50 mg di proteine ​​totali) per Immobiline gel DryStrip caricando coppa anodica nel collettore ed eseguire focalizzazione isoelettrica (IEF) utilizzando Ettan IPGphor II sistema IEF secondo le istruzioni.
3. Dopo IEF, equilibrare le strisce in due fasi e posto sulla cima di grandi dimensioni (26 x 20 cm) 12,5% gel di poliacrilammide (SDS-PAGE). Sovrapposizione con il 0,5% agarosio (in esecuzione tampone contenente blu di bromofenolo). Run 2-D elettroforesi usando Ettan DALTtwelve grande sistema verticale a 5 W / gel per 30 minuti, e poi a 15 W / gel fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel.

Imaging e analisi dei dati

1. Dopo aver completato 2-D elettroforesi, la scansione del gel per Cy2, Cy3 o Cy5 utilizzando un tifone 9410 Imager Variable Mode.
2. Confrontare le mappe posto da frazioni di membrana, frazioni citosoliche, e non frazionato campioni utilizzando DeCyder 2-D Software differenziale Analisi ^4.

Post-colorazione

1. Dopo l'imaging, l'argento macchia i gel secondo procedura standard ^5.

Identificazione delle proteine

1. Coltivare, raccogliere, lavare e lisare quantità preparativa (circa 1 mg di proteine ​​totali da 10 x 106 cellule CHO) di cellule, come descritto in precedenza per un non-frazionata campione. Utilizzare un Cy5 campione superficie cellulare etichettati (vedi sopra) come una punta, e applicare insieme agli importi senza etichetta preparativo di proteine.
2. Eseguire l'elettroforesi 2-D come sopra descritto, ma questa volta, strofinavano 600 mg di cellule senza etichetta lisato insieme con 50 mg superficie delle cellule etichettate picco con l'applicazione anodica tazza. Usare i marcatori di riferimento per consentire la raccolta corretta posizione, e il luogo esseretra le lastre di vetro prima del getto gel seguendo le raccomandazioni ^3.
3. Scansione il gel in Cy5 canale per ottenere la superficie Cy5 mappa cellula posto, seguita dalla colorazione delle proteine ​​totali con profonda proteine ​​totali macchia viola ^3.
4. Corrispondenza insieme le due mappe spot utilizzando la DeCyder 2-D di software e creare un elenco di tutti i punti corrispondenti ai 5 proteine ​​cellulari Cy etichettati superficie. Scegli le proteine ​​della superficie cellulare utilizzando il punto stazione Ettan manipolazione, estratto le spine gel, e trypsinate utilizzando il digestore Ettan. Identificare con MALDI-TOF spettrometria di massa.

Tabella 1. Un esperimento Ettan DIGE è stata effettuata utilizzando campioni di siero di cellule impoverito etichettati secondo la superficie cellulare protocollo di etichettatura delle proteine ​​in figura 1.

Campione	Tempo di esaurimento siero	Etichettato con CyDye	Gel numero
1	-	Cy 3, Cy 2	1
2	30 minuti	Cy 5, Cy 2	1
3	2 ore	Cy 3, Cy 2	2
4	4 ore	Cy 5, Cy 2	2
5	16 ore	Cy 5, Cy 2	3

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Discussione

Concentrazione di proteine

Una panoramica dei due flussi di lavoro di etichettatura è illustrato nella figura 1. Dal momento che le cellule sono ancora intatte quando etichettati secondo la superficie cellulare protocollo proteina etichettatura, solo le proteine ​​della superficie cellulare sono esposti al colorante. Nello standard Ettan DIGE protocollo, le cellule sono lisate prima di etichettatura e di proteine ​​all'interno e all'esterno della cellula sono etichettati (Fig....

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE Kit, 2 nmol	Reagent	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	Reagent	GE Healthcare	80-6484-51
IPG Buffer pH 3-11NL	Reagent	GE Healthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	Reagent	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Tool	GE Healthcare	28-9334-65
IPGbox kit	Tool	GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak Rehydration solution	Reagent	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid	Reagent	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit	Instrument	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor Manifold	Instrument component	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster	Tool	GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit	Instrument	GE Healthcare	80-6466-46	230 V unit: 80-6466-27
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	Instrument	GE Healthcare	63-0055-81
Ettan Spot Picker	Instrument	GE Healthcare	18-1145-28
Ettan Digester	Instrument	GE Healthcare	18-1142-68
Ettan Spotter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrument	GE Healthcare	18-1142-33
DeCyder 2-D Differential Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-4012-01
ImageQuant Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-9236-62
Urea	Reagent	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	Reagent	GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne Dithiothreitol (DTT)	Reagent	GE Healthcare	17-1318-01
Bromophenol Blue	Reagent	GE Healthcare	17-1329-01
Tris	Reagent	GE Healthcare	17-1321-01
Sodium Dodecylsulfate (SDS)	Reagent	GE Healthcare	17-1313-01
PlusOne Glycerol 87%	Reagent	GE Healthcare	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C	Reagent	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	Reagent	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne Ammonium Persulfate	Reagent	GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne Glycine	Reagent	GE Healthcare	17-1323-01
2-D Sample Prep for membrane proteins	Reagent	Pierce, Thermo Scientific	89864
Streptomycin sulphate	Reagent	Invitrogen	15140-122