Spettroscopia ultravioletta/visibile (UV-VIs)

Panoramica

Fonte: Laboratorio del Dr.B. Jill Venton - Università della Virginia

La spettroscopia ultravioletto-visibile (UV-Vis) è una delle tecniche analitiche più popolari perché è molto versatile e in grado di rilevare quasi tutte le molecole. Con la spettroscopia UV-Vis, la luce UV-Vis viene fatta passare attraverso un campione e viene misurata la trasmittanza della luce da parte di un campione. Dalla trasmittanza (T), l'assorbanza può essere calcolata come A=-log (T). Si ottiene uno spettro di assorbanza che mostra l'assorbanza di un composto a diverse lunghezze d'onda. La quantità di assorbanza a qualsiasi lunghezza d'onda è dovuta alla struttura chimica della molecola.

UV-Vis può essere utilizzato in modo qualitativo, per identificare gruppi funzionali o confermare l'identità di un composto abbinando lo spettro di assorbanza. Può anche essere usato in modo quantitativo, poiché la concentrazione dell'analita è correlata all'assorbanza usando la legge di Beer. La spettroscopia UV-Vis viene utilizzata per quantificare la quantità di DNA o proteine in un campione, per l'analisi dell'acqua e come rivelatore per molti tipi di cromatografia. La cinetica delle reazioni chimiche viene misurata anche con la spettroscopia UV-Vis prendendo ripetute misurazioni UV-Vis nel tempo. Le misurazioni UV-Vis sono generalmente prese con uno spettrofotometro. UV-Vis è anche un rivelatore molto popolare per altre tecniche analitiche, come la cromatografia, perché può rilevare molti composti.

Tipicamente, UV-Vis non è la tecnica di spettroscopia più sensibile, perché non molta luce viene assorbita su una breve lunghezza del percorso. Altre tecniche di spettroscopia come la fluorescenza hanno una sensibilità più elevata, ma non sono così generalmente applicabili, poiché la maggior parte delle molecole non sono fluorescenti. UV-Vis ha una sensibilità simile ad altre misurazioni di assorbanza, come la spettroscopia infrarossa.

Procedura

1. Calibrare lo spettrometro

Accendere lo spettrometro UV-Vis e lasciare che le lampade si riscaldino per un periodo di tempo appropriato (circa 20 minuti) per stabilizzarle.
Riempire una cuvetta con il solvente per il campione e assicurarsi che l'esterno sia pulito. Questo servirà come un bianco e aiuterà a tenere conto delle perdite di luce dovute alla dispersione o all'assorbimento da parte del solvente.
Posizionare la cuvetta nello spettrometro. Assicurati di allineare correttamente la c

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Risultati

UV-Vis può essere utilizzato per ottenere uno spettro di composti colorati. Nella Figura 1Aviene mostrato lo spettro di assorbanza di un colorante blu. Lo sfondo mostra i colori della luce nello spettro visibile. Il colorante blu ha una_{λ massima} assorbanza nell'arancione/rosso. La Figura 1B mostra uno spettro di un colorante rosso, con λ_max in verde.

La cinetica può essere misurata da un grafico di ass...

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Applicazione e Riepilogo

UV-Vis è utilizzato in molte analisi chimiche. Viene utilizzato per quantificare la quantità di proteine in una soluzione, poiché la maggior parte delle proteine assorbe fortemente a 280 nm. La Figura 3 mostra un esempio di spettri del citocromo C, che ha un'elevata assorbanza a 280 e anche a 450 a causa di un gruppo eme. UV-Vis è anche usato come tecnica standard per quantificare la quantità di DNA in un campione, poiché tutte le basi assorbono fortemente a 260 nm. Anche l'RNA e le proteine assorb...

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1. Calibrare lo spettrometro

Accendere lo spettrometro UV-Vis e lasciare che le lampade si riscaldino per un periodo di tempo appropriato (circa 20 minuti) per stabilizzarle.
Riempire una cuvetta con il solvente per il campione e assicurarsi che l'esterno sia pulito. Questo servirà come un bianco e aiuterà a tenere conto delle perdite di luce dovute alla dispersione o all'assorbimento da parte del solvente.
Posizionare la cuvetta nello spettrometro. Assicurati di allineare correttamente la cuvetta, poiché spesso la cuvetta ha due lati, che sono pensati per la manipolazione (possono essere scanalati) e non sono pensati per far brillare la luce.
Prendi una lettura per lo spazio vuoto. L'assorbanza dovrebbe essere minima, ma qualsiasi assorbanza dovrebbe essere sottratta dai campioni futuri. Alcuni strumenti potrebbero memorizzare i dati vuoti ed eseguire automaticamente la sottrazione.

2. Eseguire uno spettro di assorbanza

Riempire la cuvetta con il campione. Per assicurarsi che il trasferimento sia quantitativo, sciacquare la cuvetta due volte con il campione e quindi riempirla di circa 3/4. Assicurati che l'esterno sia pulito da eventuali impronte digitali, ecc.
Posizionare la cuvetta nello spettrometro nella direzione corretta.
Coprire la cuvetta per evitare la luce ambientale.
Raccogliere uno spettro di assorbanza consentendo allo strumento di scansionare diverse lunghezze d'onda e raccogliere l'assorbanza. L'intervallo di lunghezze d'onda può essere impostato con informazioni sul campione specifico, ma un intervallo di 200-800 nm è standard. Uno strumento a matrice di diodi è in grado di raccogliere un intero spettro di assorbanza in un'unica esecuzione.
Dallo spettro di assorbanza raccolto, determinare il massimo di assorbanza (λ_max). Ripetere la raccolta di spettri per ottenere una stima dell'errore in λ_max.
Per creare una curva di calibrazione, raccogliere lo spettro UV-Vis di una varietà di campioni di concentrazione diversi. Gli spettrometri sono spesso limitati nell'intervallo lineare e non saranno in grado di misurare un valore di assorbanza superiore a 1,5. Se i valori di assorbanza per il campione sono al di fuori dell'intervallo lineare dello strumento, diluire il campione per ottenere i valori all'interno dell'intervallo lineare.

3. Esperimenti di cinetica con spettroscopia UV-Vis

UV-Vis può essere utilizzato per esperimenti di cinetica esaminando il cambiamento di assorbanza nel tempo. Per un esperimento di cinetica, prendere una lettura iniziale del campione.
Aggiungere rapidamente il reagente per avviare la reazione chimica.
Mescolare bene per mescolare con il campione. Se viene aggiunta una piccola quantità, questo potrebbe essere fatto in una cuvetta. In alternativa, mescolare il reagente con il campione e versarne rapidamente un po 'in una cuvetta per una misurazione.
Misurare l'assorbanza al_massimo λ per l'analita di interesse nel tempo. Se si utilizza il reagente da misurare(cioè l'assorbanza sta salendo perché c'è meno reagente da assorbire), allora il decadimento indicherà l'ordine della reazione.
Utilizzando una curva di calibrazione, creare un grafico della concentrazione dell'analita rispetto al tempo, convertendo il valore di assorbanza in concentrazione. Da lì, questo grafico può essere adattato con equazioni appropriate per determinare le costanti di velocità di reazione.

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