Imaging di campioni biologici con microscopio elettronico a scansione (SEM)
Panoramica
Fonte: Peiman Shahbeigi-Roodposhti e Sina Shahbazmohamadi, Dipartimento di Ingegneria Biomedica, Università del Connecticut, Storrs, Connecticut
Un microscopio elettronico a scansione (SEM) è uno strumento che utilizza un fascio di elettroni per immagini e caratterizzare in modo non distruttivo i materiali conduttivi nel vuoto. Per analogia, un fascio di elettroni sta al SEM come la luce sta al microscopio ottico. La differenza è che il microscopio elettronico produce immagini di risoluzione e ingrandimento molto più elevati. I migliori microscopi ottici hanno in genere una risoluzione fino a 200 nm, mentre i SEM di solito rivendicano una risoluzione di 0,5 nm. Ciò è dovuto al fatto che i microscopi ottici sono limitati dalla diffrazione delle onde, una funzione della lunghezza d'onda, che è di circa 500 nm per la luce visibile. Al contrario, il SEM utilizza un fascio di elettroni energizzato, che come lunghezza d'onda di 1 nm. Questa caratteristica li rende strumenti molto affidabili per lo studio di nano e microstrutture. I microscopi elettronici consentono anche lo studio di campioni biologici con dimensioni delle caratteristiche troppo piccole per la microscopia ottica.
Questa dimostrazione fornisce un'introduzione alla preparazione del campione e all'acquisizione iniziale dell'immagine di campioni biologici utilizzando un microscopio elettronico a scansione. In questo caso, verrà studiato uno scaffold cellulare di collagene-idrossiapatite (HA). L'ambiente di vuoto del SEM e la carica indotta dal fascio di elettroni su campioni non conduttivi (come la materia organica) creano sfide che saranno affrontate nella preparazione. Verranno inoltre discussi i vantaggi e gli svantaggi dei diversi metodi di imaging in relazione alla risoluzione, alla profondità di messa a fuoco e al tipo di campione. Lo scopo di questa dimostrazione è quello di fornire al partecipante maggiori informazioni sulla SEM per determinare se questo modulo di microscopia è la soluzione migliore per un tipo di campione biologico.
Procedura
1. Preparazione del campione
- Indossare guanti e prendere precauzioni per evitare la contaminazione durante la manipolazione del campione.
- Assicurarsi che il campione sul vetrino sia asciutto e che non vi sia contaminazione sul campione. Questo perché SEM misura la caratterizzazione della superficie e questi difetti possono ostacolare gravemente il segnale.
- Se il campione viene caricato su una slitta di vetro standard, ridurre le dimensioni del campione segnando la diapositiva con una fresa p
Risultati
Le immagini SEM nelle figure 3 e 4 mostrano che la struttura dell'immagine è altamente tridimensionale con caratteristiche su microscala. La qualità dell'immagine è influenzata dalla messa a fuoco e dallo spessore del rivestimento sputter.
Figura 3: Le immagini seguenti illustrano in che modo la messa a fuoco di esempio può influire s...
Applicazione e Riepilogo
Qui abbiamo dimostrato la profondità di messa a fuoco, il campo visivo e la massima risoluzione e ingrandimento di un microscopio elettronico e come queste proprietà possono essere utilizzate per visualizzare campioni biologici. Questa dimostrazione è stata progettata per aiutare gli spettatori a decidere quale modulo di microscopia è il migliore per una determinata applicazione. Come dimostrato, SEM ha una profondità di messa a fuoco molto elevata, una risoluzione molto più elevata e ingrandimenti maggiori. Tuttav...
Riferimenti
- Oatley, C. W., W. C. Nixon, and R. F. W. Pease. "Scanning electron microscopy." Advances in Electronics and Electron Physics 21 (1966): 181-247.
- Goldstein, Joseph, et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis: a text for biologists, materials scientists, and geologists. Springer Science & Business Media, 2012.
- Carol Heckman, et al. Preparation of cultural cells for scanning electron microscope. Nature Protocols Network, 2007, doi:10.1038/nprot.2007.504
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