Ringraziamo il Dott. T. Otis, Dipartimento di Neurobiologia, UCLA, per condividere l&#39;impianto TPLSM con noi, il Dr. C. Fahlke, Istituto di Fisiologia, RWTH Aachen, in Germania, per la donazione del tipo pEYFP-ClC1 plasmide, e il signor . R. Serrano per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti NIH / NIAMS concede AR047664 e AR54816.

Le procedure sperimentali per elettroporazione in vivo dei muscoli FDB e IO <ol><li> Prima di avviare il protocollo di elettroporazione in vivo, i plasmidi di espressione mammifero deve essere amplificato per produrre la concentrazione nel range di 2-5 mg al Nota plasmide / l di TE:. Rotazione abbiamo utilizzare i kit di amplificazione commerciale e seguire le procedure del produttore &#39;. Plasmidi di espressione commerciale portando il lavoro di promotore CMV, molto bene nel muscolo scheletrico in trasfezioni vivo. </li><li> Aliquota il volume necessario (10-20 mL) della soluzione di plasmide e salvarlo in due provette Eppendorf da 0,5 ml (una per ogni piede del mouse). </li><li> Preparare una soluzione contenente 2 mg / ml di ialuronidasi in Tyrode sterile. </li><li> Utilizzando una scatola anestetizzare, profondamente anestetizzare un mouse utilizzando 4% isoflurano in O2 con una macchina approvata gas anestetico. Mettere l&#39;animale su una piastra elettrica (37 ° C) e mantenere l&#39;anestesia utilizzando una maschera di roditori. Monitorare la profondità dell&#39;anestesia per riflesso dito pizzico. </li><li> Sotto osservazione con un microscopio dissezione, iniettare 10 ml di soluzione ialuronidasi sotto pastiglie dei piedi di un piede del mouse utilizzando un 1 &quot;lungo 33 ago sterile calibro. Penetrare la pelle in un punto vicino al tallone del piede e far avanzare l&#39;ago per via sottocutanea verso la base delle dita dei piedi per ~ 1 / 4 &quot;. </li><li> Ripetere la procedura con l&#39;altro piede, se lo si desidera. </li><li> Scollegare l&#39;anestesia e posizionare il mouse in una gabbia. Permettergli di recuperare pienamente l&#39;anestesia. </li><li> Dopo un&#39;ora, anestetizzare l&#39;animale per la seconda volta e mettetelo sulla rampa di riscaldamento. Seguendo la stessa procedura descritta per la soluzione ialuronidasi, iniettare un totale di 20-50 mg di DNA plasmidico (a seconda delle dimensioni del costrutto plasmide). Il volume di iniezione totale dovrebbe essere inferiore a 20 microlitri / piedi. Nota: quando L μ 15-20 è necessario, è consigliabile chiudere la pelle nel punto di entrata dell&#39;ago con il tessuto-colla. </li><li> Scollegare l&#39;anestesia e posizionare il mouse in una gabbia. Permettergli di recuperare pienamente da anestesia e attendere per 10-15 minuti. </li><li> Anestetizzare l&#39;animale per la terza volta e posizionarlo sulla rampa di riscaldamento. </li><li> Seleziona un piede dell&#39;animale. Posizionare un placcati in oro aghi dell&#39;agopuntura sotto la pelle al tallone, ed un secondo alla base delle dita dei piedi. Gli elettrodi sono orientate parallelamente tra loro e perpendicolari all&#39;asse lungo del piede. </li><li> Collegare il capo degli aghi (elettrodi) allo stimolatore elettrico utilizzando micro-clip connettori. Electroporate i muscoli mediante l&#39;applicazione di 20 impulsi, 20 ms di durata / cad, a 1Hz. A seconda della distanza degli elettrodi, gli impulsi di ampiezza della tensione &#39;è regolata (attraverso il monitoraggio con un oscilloscopio) per generare un campo elettrico di circa 100 Nota V / cm. Nessun contrazioni in risposta agli stimoli devono essere osservate se il livello di l&#39;anestesia è adeguata. </li><li> Se lo si desidera, ripetere le procedure sopra nel piede controlaterale dell&#39;animale. </li><li> Rispedire l&#39;animale verso la sua gabbia e una volta completamente ripreso dall&#39;anestesia mantenerlo sotto osservazione. Nota: se il procedimento è andato normalmente, l&#39;animale deve riacquistare la piena mobilità entro 30 minuti e poi è pronto per essere inviato di nuovo alla stanza animale presso il vivaio. Le iniezioni di ialuronidasi e del DNA in pastiglie dei piedi non hanno evidenti effetti negativi sugli animali. Una volta recuperato l&#39;anestesia, i topi sono in grado di passeggiare normalmente intorno alla gabbia. Come precauzione aggiuntiva, aggiungere l&#39;acqua potabile del Carprofen animale a 0,0027 mg / ml per 2 giorni come analgesico. </li><li> Espressione della proteina possono essere analizzati 2-8 giorni dopo la transfezione. Tuttavia, l&#39;espressione costante di molte proteine ​​è stato osservato per mesi. </li></ol> NOTA: Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal Comitato degli animali del Cancelliere UCLA di ricerca come previsto dalla legge sulla protezione degli animali e la politica PHS sulla cura umanitaria ed uso di animali da laboratorio. Rappresentante dei risultati: La corretta attuazione delle procedure di elettroporazione in vivo sopra descritto dovrebbe comportare la trasfezione di plasmidi efficace nei muscoli FDB e IO. Tuttavia, l&#39;efficienza di espressione di proteine ​​transgeniche varianti dipenderà il plasmide, la dimensione e la complessità delle proteine, le proprietà funzionali della proteina, e una serie di altre variabili fuori dal nostro controllo. Come illustrato nella figura 1 per un muscolo FDB elettroporate in presenza di un plasmide commerciale (PMR-mCherry) che codifica per la proteina mCherry, la maggior parte delle fibre muscolari sono transfettate con il nostro protocollo, come illustrato dal fatto che la maggior parte di loro mostra fluorescenza rossa. Questo non esclude la possibilità che le singole fibre presentano diversi gradi di espressione della proteina, o che le fibre non sono pochi transfettate in tutti e 3. Dovrebbe be ha osservato che l&#39;espressione efficiente di grandi quantità di proteine ​​fluorescenti come mCherry, EGFP, ECFP e EYFP, non mettere in pericolo l&#39;eccitabilità delle fibre muscolari &#39;ed eccitazione-contrazione proprietà di accoppiamento. In realtà, essi sono indistinguibili da quelli nei muscoli farsa transfettate (risultati non mostrati). Approcci pratici utilizzati per verificare l&#39;espressione di proteine ​​localizzate fluorescente-tag nelle fibre muscolari scheletriche. La localizzazione intracellulare del novo di proteine ​​espresse transgenici è regolarmente valutata dal simultanea acquisizione, utilizzando la, le immagini TPLSM fluorescente dei tag rispettivi e le immagini dei marcatori ben identificato di strutture cellulari. Il più tipico di questi ultimi sono: a) generazione di seconda armonica (SHG) immagini, che nascono dalla anisotropia miosina del sarcomero A bande (centrata sulla M-linee) e 9,10, b) di-8-ANEPPS fluorescenza immagini, che può essere ottenuta con l&#39;etichettatura e la superficie trasversale tubolare (T-tubulo) sistema delle membrane delle fibre muscolari con questo dye11 impermeant potenziometrica. Nelle immagini a fluorescenza delle fibre muscolari colorati con di-8-ANEPPS, il T-tubuli appaiono come bande strette di fluorescenza orientata circa ortogonale all&#39;asse lungo della fibra. Queste bande sono inegualmente distanziati gli uni dagli altri: sono separate da una distanza lunga che si estende in tutto il M-linee e uno corto che si estende in tutta la linea Z-11. Espressione e localizzazione di α-actinina-EGFP nelle fibre muscolari scheletriche. Un esempio di espressione di una variante tag della proteina strutturale del muscolo α-actinina è illustrato nella figura 2. Questa proteina è nota per essere una componente importante della Z-line e, come tale, è normalmente utilizzato come marcatore di questa structure12. Noi transfettate muscoli FDB e IO con il plasmide pEGFPN1-α-actinin1 codifica per l&#39;uomo (non-muscolare) α-actinina tag al terminal C con EGFP. Sei giorni dopo la transfezione, abbiamo scoperto che, valutata dalla distribuzione EGFP fluorescenza, α-actinina è in gran parte espressa a bande strette equidistanti lungo l&#39;asse della fibra. Una banda per singolo sarcomero è visto (figure 2A e 2D). La colocalizzazione di queste bande con la Z-linee è dimostrato dal confronto tra la distribuzione della fluorescenza EGFP con l&#39;SHG (Figura 2B) e di-8-ANEPPS (Figura 2E) immagini. Come mostrato dall&#39;immagine sovrapposizione (Figura 2C), α-actinina-EGFP band si alternano con le bande SHG, indicando che si trovano a metà strada tra due consecutivi M-band, in coincidenza con la posizione di Z-linee. Nelle fibre muscolari transfettate colorati con di-8-ANEPPS, α-actinina-EGFP bande sono visti centrate tra ogni coppia di T-tubuli (fig. 2F) che sono noti a fianco le linee Z (cioè separati da una distanza più breve), indicando così che transgenico α-actinina è rivolto a Z-line. Espressione di DHPRα1s tag al N-terminale con EGFP L&#39;efficienza di trasfezione muscolari con pEGFPC1.1 DHPR α-1s è verificata nelle immagini TPLSM (ad esempio Figura 3A) che mostra che la maggior parte delle fibre esprimere EGFP-DHPRα1s (una proteina transmembrana). La caratteristica più importante di fibre trasfettate è il doppio fasciato pattern di fluorescenza EGFP (Figure 3A e 3B), come ci si aspetterebbe se questa proteina è stato mirato al T-tubuli. Può anche essere osservato in Figura 3 che, mentre le fibre diverse visualizzare diversi livelli di intensità di fluorescenza, il modello a bande di fluorescenza di una singola fibra sembra essere mantenuta omogenea lungo la fibra. A maggiore ingrandimento (Figura 3B), si può chiaramente vedere che la spaziatura irregolare tra bande è simile a quello osservato in fibre colorate di-8-ANEPPS (es. Figura 2E). Le immagini sovrapposte (Figura 3B e 3E) mostrano che le bande SHG si trovano all&#39;interno della più ampia spaziatura tra EGFP-DHPRα1s band, che conferma che questa proteina è al T-tubuli. Ulteriori misure di FRET con la non-fluorescenti anione lipofili DPA-(dati non riportati) dimostrano inoltre che la porzione EGFP si trova pochi nanometri del foglietto interno della membrana del T-tubuli &#39;. Localizzazione e valutazione funzionale dell&#39;espressione di EYFP-ClC1 Fibre transfettate con pEYFP-ClC1, che codifica per una costruzione EYFP-tag (al N-terminale) del canale cloruro muscolo scheletrico (ClC1), display EYFP bande di fluorescenza (Figura 4A) con un modello simile a quello osservato per EGFP-DHPRα1s &#39;espressione (Figura 3A) e corrispondente al T-tubulo intese come illustrato con colorazione di-8-ANEPPS (2E Figura). Come previsto, la sovrapposizione di EYFP-ClC1 (Figura 4A) e le immagini SHG (Figura 4B), come mostrato nella sovrapposizione (Figura 4C), mostrano che le bande SHG sono centrati, alle distanze o di grandi dimensionif EYFP tra bande di fluorescenza. Al fine di valutare se l&#39;espressione di EYFP-ClC1 si traduce in un significativo aumento della conduttanza di riposo delle fibre muscolari, come previsto dalla sovraespressione di canali del cloro funzionale, abbiamo fibre muscolari enzimaticamente dissociato dal muscolo FDB transfettate e studiato le loro proprietà elettrofisiologiche utilizzando due microelettrodi sperimentale descritto in precedenza 6,11,13. La Figura 5 mostra i risultati di due fibre: uno che esprime una grande quantità di EYFP-ClC1 come valutato da misure globali intensità di fluorescenza in un microscopio a fluorescenza normale (non mostrato), e l&#39;altro è un non-transfettate controllo. Il record di tensione a 5A Figura (ottenuto dalla fibre muscolari che esprimono EYFP-ClC1) dimostra che a causa della conduttanza eccessivo di riposo, la fibra è quasi non-eccitabili. Impulsi di stimolo di corrente fino a 400nA (0,5 ms) necessario per essere utilizzato in modo da ottenere una risposta molto piccolo attivo (no, 5A Figura overshoot). Dopo la sostituzione della soluzione Tyrode esterno su uno contenente 500 mM del bloccante dei canali del cloruro 9-ACA, 200 impulsi nA di corrente sono stati sufficienti a provocare un potenziale d&#39;azione (Figura 5B), anche se molto più lento e più ampio rispetto a quelli registrati in fibra di controllo ( Figura 5C). Come previsto, l&#39;aggiunta di 9-ACA aveva effetti minimi su questa fibra di controllo (Figura 5D). <img src="/files/ftp_upload/1520/1520fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /> Figura 1. Efficienza Transfection delle in-vivo metodo di elettroporazione. Brightfield (A) e di fluorescenza (B) le immagini di un muscolo FDB transfettate con PMR-mCherry. Giorni dopo il protocollo di elettroporazione: 12 giorni. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1520/1520fig1.jpg">cliccare qui</a> per una versione più grande della figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Espressione e targeting di α-actinina-EGFP in fibre FDB. Pannelli A e B sono fluorescenza EGFP e immagini SHG, rispettivamente, di una fibra che esprimono α-actinina-EGFP. Panel C è una sovrapposizione delle immagini in A e B. I pannelli D ed E sono immagini di fluorescenza di un&#39;altra fibra che esprimono α-actinina-EGFP e colorati con di-8-ANEPPS, rispettivamente. Pannello F è la sovrapposizione di immagini in D ed E. giorni dopo l&#39;elettroporazione protocollo: 6 giorni. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Espressione e targeting di EGFP-DHPRα1s in fibre FDB. Un pannello, immagine EGFP fluorescenza di un gruppo di fibre che esprimono EGFP-DHPRα1s. Pannello B è un ampliamento della piazza in un pannello per mostrare meglio il modello a bande di espressione della proteina. Panel C è l&#39;immagine SHG corrispondente all&#39;immagine in pannello A. Pannello di D è la sovrapposizione delle immagini A e C. Pannello di E è un allargamento della zona indicata nel pannello di D. Giorni dopo il protocollo di elettroporazione: 20 giorni. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Espressione e targeting di EYFP-ClC1 in fibre FDB. Pannelli A e B sono fluorescenza EYFP e immagini SHG, rispettivamente, di fibre che esprimono EYFP-ClC1. Pannello C è la sovrapposizione delle immagini in pannelli A e B. Pannello di D è un profilo di intensità misurata lungo la linea bianca evidenziata nell&#39;immagine in pannello Giorni C. dopo il protocollo di elettroporazione: 7 giorni. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Fibre valutazione elettrofisiologici esprimere transgenici EYFP-ClC1. Pannelli A e B sono record tensione da una fibra che esprime EYFP-ClC1 in risposta ad impulsi di corrente, prima e dopo il trattamento con 9-ACA, rispettivamente. Pannelli C e D sono i record di tensione (potenziali di azione) ha provocato in risposta ad impulsi di corrente in modo non transfettate fibra prima e dopo il trattamento con 9-ACA, rispettivamente.

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The authors have nothing to disclose.

Descriviamo qui la procedura dettagliata da seguire per raggiungere trasfezioni efficace di plasmidi DNA in fibre muscolari scheletriche di elettroporazione in vivo. I principali vantaggi del nostro approccio sono la semplicità di implementazione, e la sua minima invasività che si traduce in rischio per la salute trascurabile per gli animali. In realtà, i protocolli sopra descritti elettroporazione non implicano molto di più di due iniezioni sottocutanee per piede, seguito da un protocollo di stimolazione e...

dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation

Un crescente interesse per la biologia delle cellule è quello di esprimere forme transgenically modificato di proteine ​​essenziali (ad esempio, costruisce fluorescente tag e / o varianti mutanti) al fine di indagare la loro distribuzione endogene e rilevanza funzionale. Un approccio interessante che è stato implementato per soddisfare questo obiettivo in cellule altamente differenziate è il<em&gt; In vivo</emTrasfezione&gt; di plasmidi con vari metodi in tessuti specifici, come il fegato<sup&gt; 1</sup&gt;, Muscolo scheletrico<sup&gt; 2,3</sup&gt;, E anche il cervello<sup&gt; 4</sup&gt;. Vi presentiamo qui una descrizione dettagliata dei passi che devono essere seguite per trasfezione efficiente materiale genetico nelle fibre del<em&gt; Flessore breve delle dita</em&gt; (FDB) e<em&gt; Interassea</em&gt; (IO) i muscoli di topi adulti con un<em&gt; In vivo</emElettroporazione&gt; approccio. I parametri sperimentali sono stati ottimizzati in modo da massimizzare il numero di fibre muscolari transfettate, riducendo al minimo i danni dei tessuti che possano compromettere la qualità e la quantità delle proteine ​​espresse in singole fibre. Abbiamo verificato che l&#39;attuazione della metodologia descritta in questo documento si traduce in un rendimento elevato di proteine ​​solubili, cioè EGFP e ECFP<sup&gt; 3</sup&gt;, Calpaina, FKBP12, β2a-DHPR, ecc proteine ​​strutturali, cioè minidystrophin e α-actinina, e proteine ​​di membrana, cioè α1s-DHPR, RyR1, cardiaco Na / Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Scambiatore Na NaV1.4 canale, SERCA1, ecc, se applicato a FDB, IO e altri muscoli di topi e ratti. L&#39;espressione efficace di alcune di queste proteine ​​è stata verificata con biochimiche<sup&gt; 3</sup&gt; E prove funzionali<sup&gt; 5</sup&gt;. Tuttavia, di gran lunga l&#39;approccio più comune di conferma da noi utilizzati sono standard microscopia a fluorescenza e 2-fotone microscopia a scansione laser (TPLSM), che permettono di identificare non solo l&#39;espressione generale, ma anche la localizzazione dettagliata intracellulare, di costrutti proteina fluorescente tag. Il metodo potrebbe essere ugualmente usato per trasfettare plasmidi che codificano per l&#39;espressione di proteine ​​di rilevanza fisiologica (come mostrato qui), o per interferenza RNA (siRNA), volto a sopprimere l&#39;espressione di proteine ​​normalmente espresse (non ancora testato da noi). Va notato che la transfezione delle fibre muscolari e FDB IO è particolarmente rilevante per lo studio della fisiologia dei mammiferi in quanto le fibre muscolari enzimaticamente dissociato da questi muscoli sono attualmente uno dei modelli più adatti per indagare i meccanismi di base di accoppiamento eccitabilità e di eccitazione-contrazione sotto condizioni di pinza di corrente o tensione<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

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DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Si descrivono le modalità dettagliate per la trasfezione efficiente di DNA plasmidico nelle fibre dei muscoli piedi di topi dal vivo utilizzando elettroporazione e la successiva visualizzazione di espressione della proteina usando la microscopia a fluorescenza.

Transfection DNA dei mammiferi muscoli scheletrici con In Vivo Elettroporazione

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

dna-transfection-mammalian-skeletal-muscles-using-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

17.7K Views.  David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles. Si descrivono le modalità dettagliate per la trasfezione efficiente di DNA plasmidico nelle fibre dei muscoli piedi di topi dal vivo utilizzando elettroporazione e la successiva visualizzazione di espressione della proteina usando la microscopia a fluorescenza.

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Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

Cella singola elettroporazione in vivo all&#39;interno del cervello intatto in via di sviluppo

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Ricerca

Biologia

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

Microiniezione intranucleari di DNA in dissociato neuroni dei mammiferi adulti

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Analisi del DNA doppio filamento Break (DSB) di riparazione in cellule di mammifero

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In elettroporazione in vivo dei Morpholinos nella retina Zebrafish per adulti

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Vivo Valutazione Ex della contrattilità, affaticabilità e alternanza in isolati muscoli scheletrici

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

In tempo reale Imaging del singolo Engineered RNA trascritti in cellule viventi Utilizzando Ratiometric bimolecolari Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo Microiniezione e Elettroporazione di mouse Testicolo

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Rilevamento e analisi del danno al DNA nel muscolo scheletrico mouse<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzo del metodo TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

Elettroporazione DNA, isolamento e imaging di miofibre

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic knockdown system, we showed novel functions for HDAC1,2 in replication fork progression and nascent chromatin maintenance in mammalian cells. Additionally, we used a BrdU-ChIP-Slot-Western technique that combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) of bromo-deoxyuridine (BrdU)-labeled DNA with slot blot and Western analyses to quantitatively measure proteins or histone modification associated with nascent DNA.
Actively dividing cells were treated with HDAC1,2 selective inhibitor or transfected with siRNAs against Hdac1 and Hdac2 and then newly synthesized DNA was labeled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU). The BrdU labeling was done at a time point when there was no significant cell cycle arrest or apoptosis due to the loss of HDAC1,2 functions. Following labeling of cells with BrdU, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone acetylation marks or the chromatin-remodeler was performed with specific antibodies. BrdU-labeled input DNA and the immunoprecipitated (or ChIPed) DNA was then spotted onto a membrane using the slot blot technique and immobilized using UV. The amount of nascent DNA in each slot was then quantitatively assessed using Western analysis with an anti-BrdU antibody. The effect of loss of HDAC1,2 functions on the levels of newly synthesized DNA-associated histone acetylation marks and chromatin remodeler was then determined by normalizing the BrdU-ChIP signal obtained from the treated samples to the control samples.

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.