Name: Video: Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth
Uploaded: 2010-05-20T17:00:00
Description: 12.7K Views. University of California. Video bioinformatica è l'elaborazione automatizzata, l'analisi, la comprensione e il data mining di biologico spazio-temporali di dati estratti da video microscopiche. Lo scopo di questo articolo è di dimostrare un metodo per misurare la crescita delle cellule umane embrionali staminali colonia utilizzando un metodo video di bioinformatica.

Lo sviluppo di questo metodo è stato reso possibile da un finanziamento della tabacco-correlate California Programma di ricerca sulle malattie, l&#39;Istituto di Medicina Rigenerativa della California, e NSF IGERT concedere su Video Bioinformatica (# 0903667) a UCR ( <a href="http://www.cris.ucr.edu/IGERT/index.php">http://www.cris.ucr .edu / IGERT / index.php</a> ). Sabrina Lin è supportato da una borsa di studio Tesi della Divisione Graduate, Shawn Forteno è supportata da un MARC NIH Fellowship, e Shruthi Satish è supportato da una borsa di studio Graduate Division. Siamo grati ad Anna Trtchounian per il suo aiuto la preparazione delle figure. Ringraziamo anche Sam Alworth e Ned Jastromb per averci insegnato come utilizzare il CL-Quant software.

Parte 1: Procedura sperimentale Dati video contengono un&#39;abbondanza di informazioni. Tuttavia, queste informazioni sono spesso difficili da estrarre e quando è fatto manualmente da esseri umani e può richiedere molte ore di tempo per completare il personale. Analisi manuale da parte dell&#39;uomo è anche soggetto a variazioni d&#39;interpretazione e di errore. Video bioinformatica prevede l&#39;utilizzo di software per estrarre dati specifici da immagini video. Questo metodo di analisi è rapida e può eliminare l&#39;errore che si verifica quando l&#39;analisi viene effettuata manualmente dagli esseri umani. Lo scopo di questo articolo è di dimostrare un metodo per quantificare la crescita delle cellule umane embrionali staminali colonia utilizzando un metodo video di bioinformatica. In questo lavoro, lasso di tempo le immagini video sono stati raccolti utilizzando una Nikon BioStation unità di incubazione TC, che consente più campi di cellule per essere ripreso nel corso del tempo (Fig. 1). I metodi descritti in questo rapporto sono applicabili ai dati video raccolti da qualsiasi video microscopiche costituito. Nel nostro disegno sperimentale, abbiamo placcato H9 hESC in lastre di tessuto di 12 e cultura per 48 ore. Durante questo intervallo, le colonie sono stati autorizzati a fissare pienamente e diffusione su Matrigel. Poi, le piastre con colonie hESC allegato sono stati trasferiti al CT BioStation e incubate per altre 48 ore. Mentre nel BioStation, le immagini delle colonie sono stati raccolti a 7 intervalli di un minuto e successivamente sono state utilizzate per creare time-lapse sequenze video. Video per ogni colonia sono stati poi analizzati per quantificare la crescita colonia utilizzando video ricette bioinformatica sviluppata con il CL-Quant software. L&#39;analisi effettuata utilizzando ricette create con la CL-Quant software sono stati controllati per veridicità manualmente utilizzando Adobe Photoshop. Parte 2: Preparazione delle colonie hESC allegato <ol><li> Crescere hESC su Matrigel rivestito da 6 pozzetti, e una volta confluenza del 70% è raggiunto, replate un pozzetto del 6 pozzetti in 5 pozzetti di una 12-pozzetti Matrigel rivestito come segue. </li><li> Aspirare il terreno da un pozzetto contenente hESC. </li><li> Sciacquare bene 2x con 1 ml di PBS. </li><li> Aggiungere 1ml di Accutase e incubare per 1 minuto a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Aggiungere 10-12 perle di vetro nel pozzo e agitare delicatamente la piastra fino colonie completamente staccare dal fondo del pozzo. </li><li> Neutralizzare Accutase utilizzando 1ml di mTeSR medio o medio MEF condizionata. </li><li> Centrifugare la sospensione di cellule in una provetta 15 ml conica a 200g per 3 minuti. </li><li> Decantare il surnatante e il pellet rottura con 500μl di media mTeSR fresca. </li><li> Piastra 100μl goccia a goccia della sospensione hESC in ciascun pozzetto in un 12-pozzetti. </li><li> Piastra oscillare avanti e indietro con delicatezza e osservare le culture sotto un microscopio ottico. Assicurarsi che grumi di cellule sono distribuite uniformemente in tutto il piatto. </li><li> Posizionare il 12-e piastra posteriore in incubatrice. </li><li> Lasciare hESC per collegare e far crescere per 48 ore (un tempo più breve può essere utilizzato). </li><li> Dopo 48 ore, pozzi decantare il supporto e lavare con 500ul di PBS per rimuovere le cellule senza legami. </li><li> Aggiungere 1 ml di medium mTeSR in ciascun pozzetto. </li><li> Commento: Collocare immediatamente la piastra nell&#39;incubatore / microscopio per le immagini video. </li><li> Iniziare a raccogliere le immagini time-lapse. Provare a selezionare i campi con discrete singole colonie che non sono suscettibili di trasformarsi in altre colonie. </li><li> Altri metodi per la coltura e la creazione di hESC può essere usato al posto del protocollo di cui sopra. </li></ol> Parte 3: Video Bioinformatica CL-Quant software è stato utilizzato per creare tre &quot;ricette&quot; che se eseguito in sequenza determinerà il numero di pixel o area in micron per ogni colonia nel tempo. Le tre ricette sono costruiti in sequenza e per questa applicazione sono segmentazione, la valorizzazione e la misurazione. Analizzando colonia crescita hESC con il CL-Quant software / sviluppo ricetta: <ol><li> La ricetta segmentazione è creato per primo. </li><li> Scansione l&#39;intero video per assicurarsi che il video è utilizzabile. Verificare che l&#39;intera colonia rimane nel campo di vista e che altre colonie non entrare nel campo. </li><li> Aprire la procedura guidata di segmentazione e cliccare sul pulsante &quot;Avanti&quot;. </li><li> Selezionare il canale corretto immagine (cioè, la fase, verde, rosso, ecc) e cliccare sul pulsante &quot;Avanti&quot;. </li><li> Pick &quot;corrispondenza soft&quot; dei 3 scelte e fare clic su &quot;Avanti&quot;. </li><li> Selezionare &quot;vogliono&quot; regioni cerchiando regioni sull&#39;immagine tipicamente il bordo esterno della colonia per la zona centrale della colonia. <ul><li> Questa zona dovrebbe essere il più piccolo possibile, ma deve essere rappresentativo dell&#39;intera colonia. </li><li> Quando si usa il microscopio a contrasto di fase, essere sicuri di includere l&#39;alone intorno alla colonia per la selezione colonia preciso dal software. </li><li> Scegli 1 o 2 regioni di interesse che possono mostrare diversimodelli di pixel all&#39;interno della colonia, ma non prendere troppi &quot;vuole&quot; che può comportare l&#39;applicazione della maschera inesatte. </li></ul></li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Avanti&quot;. </li><li> Selezionare &quot;Non voglio&quot; regioni cerchiando regioni sull&#39;immagine che non fanno parte della colonia e non fanno parte dello sfondo. Si tratta di regioni che hanno modelli che si desidera eliminare e comprendono pixel di artefatti come detriti e cellule morte. Fare clic su &quot;Avanti&quot;. </li><li> Selezionare &quot;sfondo&quot; cerchiando regioni si vuole sopprimere. <ul><li> Il &quot;non vogliono&quot; e &quot;sfondo&quot; delle regioni che si differenziano per sfondo deve essere uniforme e probabilità di presentarsi in ogni fotogramma. </li><li> Di solito ci selezionare lo sfondo grigio intorno alla colonia. </li></ul></li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Avanti&quot;. </li><li> Una maschera colorata deve essere visualizzato sopra la vostra regione di interesse (Fig. 2A). </li><li> Se la maschera non copre con precisione la regione di interesse, la gamma soglia di segmentazione (che si trova nell&#39;angolo inferiore destro del display del software) può essere aumentata o diminuita. </li><li> La procedura guidata di segmentazione richiede un&#39;ulteriore messa a punto della maschera bene, se necessario. </li><li> Se si desidera cambiare la maschera, selezionare &quot;aggiornamento morbido regioni corrispondenti&quot;. Questo consente di modificare il &quot;voglio&quot;, &quot;non vogliono&quot;, o &quot;fondo&quot; aree. </li><li> Se la maschera è soddisfacente, selezionare &quot;soglia di applicare e salvare la mia maschera&quot;, e cliccare sul pulsante &quot;Avanti&quot;. </li><li> La maschera verrà quindi visualizzato in un colore diverso. </li><li> Selezionare &quot;Fine&quot;. </li><li> La ricetta dovrebbe essere visualizzata nell&#39;angolo superiore destro del software, e dovrebbe essere chiamato &quot;ricetta segmentazione&quot;. </li><li> Rinominare la ricetta se volete facendo clic destro e &quot;rinomina&quot;. </li><li> Per la verifica in loco, fare clic destro e posizionare il mouse su &quot;applica ricetta&quot;. </li><li> Un menu mostrerà che consente di selezionare il numero di fotogrammi che si desidera utilizzare quando si macchia il controllo della ricetta. Eseguire la ricetta per ogni 10 fotogrammi al controllo in loco l&#39;accuratezza del posizionamento maschera. </li><li> Se la maschera prende le parti di piccole regioni indesiderate o detriti, è possibile creare una &quot;ricetta miglioramento&quot; per migliorare montaggio della maschera per la regione di interesse. </li><li> Per creare una ricetta di miglioramento, fate clic destro la &quot;ricetta valorizzazione&quot; cartella, quindi fare clic su &quot;nuovo&quot;. Una ricetta nuova valorizzazione dovrebbe essere visualizzato. </li><li> Dal campo di vista originale (FOV), fare clic sul &quot;miglioramento alterna modulo&quot; pulsante che si trova alla destra dell&#39;immagine. Il mouse sulle icone nella barra degli strumenti per identificare quello corretto. </li><li> Selezionare il menu a discesa &quot;etichettatura&quot;. </li><li> Selezionare &quot;4 etichettatura connessi&quot;. </li><li> Selezionare &quot;etichettatura 4 connected2&quot;. </li><li> Una nuova barra delle applicazioni dovrebbe essere visualizzata. </li><li> Prendete la maschera iniziale (mask0) dalla ricetta segmentazione e trascinarlo nella casella &quot;input&quot;. </li><li> La barra dovrebbe ora visualizzare &quot;maschera di input #&quot;. </li><li> Trascinare l&#39;icona con la &quot;maschera di input #&quot; per l&#39;icona della maschera 0. </li><li> Trova &quot;dimensione min&quot; nella barra delle applicazioni e regolare fino a quando il numero unica regione di interesse visualizzati. Assicurati di cliccare su &quot;Esegui&quot; in ogni prova di montaggio. </li><li> Quando si è soddisfatti con il vostro regolazione dimensioni minime, clicca su &quot;ricetta valorizzazione&quot; che hai creato in precedenza. (Fig. 2B) </li><li> Nella parte inferiore dello schermo, selezionare &quot;salva di ricetta&quot;. </li><li> Il software richiede ora a &quot;sovrascrivere ricetta selezionata?&quot;, Selezionare &quot;sì&quot; </li><li> Controllo in loco la ricetta valorizzazione utilizzando le stesse procedure di cui sopra per la segmentazione posto di controllo. </li><li> Se sei soddisfatto delle segmentazione e le ricette degli accessori, selezionare &#39;creare modelli di misurazione&#39; sulla barra degli strumenti di destra. </li><li> Rinominare il modello, se volete. </li><li> Nella finestra modello di misurazione, spostare il cursore sopra la figura di cellule clipart. Tenere premuto il tasto Ctrl e selezionare la cella. </li><li> Deseleziona &#39;default il parametro&#39; e &#39;il parametro area&#39; sotto controllo &#39;morfologia&#39;. </li><li> Exit &#39;modello&#39; finestra. </li><li> Selezionare l&#39;icona creata nella ricetta di misura. </li><li> Rinominare la ricetta. </li><li> Spostarsi e selezionare la scheda &#39;modello&#39; in alto a destra. </li><li> Trascinate e rilasciate il modello di misura creato in precedenza nella finestra di misura. </li><li> Fare clic su &#39;Sì&#39; per continuare. </li><li> Nella finestra ricetta di misura, selezionare &#39;Canale mappature&#39;, &#39;cellula intera&#39; allora. </li><li> Selezionare &#39;Maschera mappature&#39;. </li><li> Poi &#39;cellula intera&#39; selezionare l&#39;opzione per la maschera avanzata. </li><li> Selezionare la &#39;ricetta di misura&#39; sotto la scheda ricetta nella finestra principale. </li><li> Selezionare l&#39;icona &#39;Salva&#39; all&#39;interno della finestra ricetta di misura. </li><li> Quindi chiudere la finestra. </li><li> Ora, chiudere e riaprire il &#39;FOV&#39;. </li><li> Fare clic destro sull&#39;icona &#39;ricetta&#39;, selezionare &#39;ricetta lista Lock&#39; ed eseguire le ricette in sequenza sui vostri dati video. </li></ol> Parte 4: Controllo di precisione ricetta utilizzando il software Photoshop Al fine di validare la ricetta creata con (CL-Quant softwsono), gli stessi dati possono essere analizzati manualmente con Adobe Photoshop. Per questa analisi, ogni fotogramma 10 (ogni 70 punti Tempo min) è stato analizzato per misurare le dimensioni della colonia nell&#39;arco di 48 ore. <ol><li> Aprire una cornice di un&#39;immagine colonia in Adobe Photoshop. </li><li> Clicca sulla bacchetta magica nella barra degli strumenti. </li><li> Clicca sulla zona intorno alla colonia modo che il campo è coperto, tranne la regione colonia. </li><li> Fare clic su &#39;Modifica in modalità maschera veloce&#39; nella barra degli strumenti e fare clic sulla colonia così la colonia è stata selezionata. </li><li> Assicurarsi che la linea tratteggiata attorno alla colonia si adatta a destra intorno alla periferia della colonia, e non dentro. Se la linea tratteggiata non è intorno alla periferia, modificare il valore di tolleranza nella barra degli strumenti superiore di conseguenza. </li><li> Vai alla &#39;Finestra&#39; menu a tendina e cliccare su &#39;Istogramma&#39;. </li><li> Annotare il valore dei pixel quando la cache = 1. Se la cache è di 2, fare clic sul &#39;!&#39; per passare alla cache di 1, e prendere nota del valore del pixel. </li><li> Ripetere la procedura per ogni fotogramma 10. Un minor numero di frames totali può essere utilizzato se lo si desidera. </li><li> I dati raccolti con Photoshop e CL-Quant software può quindi essere tracciata insieme. Se il CL-Quant ricette sono veritiere, le curve di Photoshop per l&#39;analisi e CL-Quant dovrebbe essere molto simile (fig. 3-5). </li><li> Se le ricette sviluppato con CL-Quant sono veritiere, possono essere applicati affidabile ai dati video. </li><li> Il valore in uso di video bioinformatica in questa analisi è che una volta la segmentazione, la valorizzazione, e le ricette di misura sono stati sviluppati e validati, si esibiranno l&#39;analisi molto più rapidamente e più accuratamente di quanto un essere umano con Photoshop. </li></ol> Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Film strip di una colonia hESC rappresentare i frame in diversi momenti durante le 48 ore di crescita in un CT BioStation. Cornici sono state prese a 7 ​​minuti. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: (A) Immagine di un hESC con una maschera posta sulla colonia dalla ricetta segmentazione. Aree di detriti e lo sfondo sono mascherati anche indicare che una ricetta potenziamento è necessario per migliorare l&#39;accuratezza della valutazione. (B) Immagine della colonia stessa, come indicato in &quot;A&quot; dopo il miglioramento è stato eseguito. La maschera seleziona ora solo la colonia e il rumore è stato eliminato dalla selezione. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Il grafico che mostra aumento delle dimensioni della colonia (in pixel) nell&#39;arco di 48 ore come determinati con CL-Quant software e Photoshop. Questo grafico grafici i dati grezzi e mostra che le colonie partono da diverse dimensioni. Dimostra anche che entrambi i metodi di misura sono in buon accordo. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: Il grafico che mostra gli stessi dati come nella figura 3 dopo la normalizzazione di mostrare l&#39;aumento di dimensioni della colonia per cento in più di 48 ore. Questo dimostra che i tassi di crescita sono simili indipendentemente dalla dimensione colonia di partenza e che entrambe le misure di analisi danno risultati simili. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: Il grafico che mostra i mezzi per i dati normalizzati in Figura 4. Questo grafico mostra chiaramente un buon accordo tra l&#39;analisi fatta utilizzando video bioinformatica (CL-Quant software) e Photoshop e stabilisce che la ricetta è veritiero. La leggera flessione in area per i dati di Photoshop a telaio 325 è dovuto a diversi video non essere inclusi nell&#39;analisi Photoshop.

Video sono potenti strumenti bioinformatici per la rapida estrazione dei dati da immagini video. Il nostro protocollo per quantificare colonia crescita hESC dimostra una applicazione di video bioinformatica a un problema biologico. Questo metodo è quantitativo e ha la caratteristica interessante di dati idonei a rivelare dalle colonie hESC individuali. Video ricette bioinformatica può essere sviluppato per il monitoraggio di altri processi cellulari come la proliferazione, la migrazione, l&#39;apoptosi, e l&#39;attacc...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>mTeSR1 Human Embryonic Stem Cell Maintenance Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>05850</td>
<td>or any suitable medium for hESC culture.</td>
</tr>
<tr>
<td>BD Matrigel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>356234</td>
<td>or other suitable substrate.</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12 Basal Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-032</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Accutase Enzyme Cell Detachment Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>eBioscience</td>
<td>00-4555-56</td>
<td>or other suitable detachment enzyme.</td>
</tr>
<tr>
<td>3mm Glass beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>11-312A</td>
<td>optional.</td>
</tr>
<tr>
<td>12-well Tissue Culture Plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353043</td>
<td>or any other plate format.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nikon BioStation CT/IM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or other incubator/microscope suitable for collecting video data.</td>
</tr>
<tr>
<td>CL-Quant software (Nikon) and/or Photoshop (Adobe).</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

video bioinformatics analysis of human embryonic stem cell colony growth

Poiché i dati video sono complessi e sono composti da molte immagini, informazioni di data mining da materiale video è difficile da fare senza l&#39;aiuto di software per computer. Video bioinformatica è un approccio quantitativo per l&#39;estrazione di potente spazio-temporale dei dati da immagini video utilizzando il software per computer per eseguire minerario datazione e l&#39;analisi. In questo articolo introduciamo un metodo video di bioinformatica per quantificare la crescita delle cellule staminali embrionali umane (hESC) attraverso l&#39;analisi time-lapse dei video raccolti in un BioStation Nikon CT incubatore dotato di una fotocamera per le immagini video. Nei nostri esperimenti, colonie hESC che erano attaccati alla Matrigel sono stati filmati per 48 ore nel CT BioStation. Per determinare il tasso di crescita di queste colonie, le ricette sono state sviluppate utilizzando CL-Quant software che permette agli utenti di estrarre vari tipi di dati da immagini video. Per valutare con precisione la crescita colonia, tre ricette sono state create. Il primo segmentato l&#39;immagine nella colonia e lo sfondo, la seconda maggiore l&#39;immagine per definire le colonie per tutta la sequenza video con precisione, e il terzo misurato il numero di pixel nella colonia nel tempo. Le tre ricette sono state eseguite in sequenza sui dati video raccolti in una CT BioStation per analizzare il tasso di crescita di colonie hESC individuali oltre 48 ore. Per verificare la veridicità delle CL-Quant ricette, gli stessi dati sono stati analizzati manualmente utilizzando il software Adobe Photoshop. Quando i dati ottenuti utilizzando il CL-Quant ricette e Photoshop sono stati confrontati i risultati erano praticamente identici, indicando il CL-Quant ricette sono state veritiere. Il metodo qui descritto potrebbe essere applicata a tutti i dati video per misurare i tassi di crescita delle hESC o di altre cellule che crescono in colonie. Inoltre, altri video di ricette bioinformatica possono essere sviluppate in futuro per altri processi cellulari quali la migrazione, l&#39;apoptosi e adesione cellulare.

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Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video bioinformatica è l&#39;elaborazione automatizzata, l&#39;analisi, la comprensione e il data mining di biologico spazio-temporali di dati estratti da video microscopiche. Lo scopo di questo articolo è di dimostrare un metodo per misurare la crescita delle cellule umane embrionali staminali colonia utilizzando un metodo video di bioinformatica.

Video Bioinformatica Analisi delle embrionali umane crescita Colony cellule staminali

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Views.  University of California. Video bioinformatica è l'elaborazione automatizzata, l'analisi, la comprensione e il data mining di biologico spazio-temporali di dati estratti da video microscopiche. Lo scopo di questo articolo è di dimostrare un metodo per misurare la crescita delle cellule umane embrionali staminali colonia utilizzando un metodo video di bioinformatica.

Video: Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts of cell culture, and tend to acquire karyotypic abnormalities with high population doublings.  Proper passaging is essential for maintaining a healthy, undifferentiated, karyotypically normal HuES human embryonic stem cell culture.  First, an expanding culture is washed in PBS to remove residual media and cell debris, then cells are overlaid with a minimal volume of warm 0.05% Trypsin-EDTA.  Trypsin is left on the cells for up to five minutes, then cells are gently dislodged with a 2mL serological pipette.  The cell suspension is collected and mixed with a large volume of HuES media, then cells are collected by gentle centrifugation.  The inactivated trypsin media mixture is removed, and cells resuspended in pre-warmed HuES media.  An appropriate split ratio is calculated (generally 1:10 to 1:20), and cells re-plated onto a 1-2 day old plate containing a monolayer of irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells.  The newly seeded HuES culture plate is left undisturbed for 48 hrs, then media is changed every day thereafter.  It is important not to trpsinize down to a single cell suspension, as this increases the risk of introducing karyotypic abnormalities.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin. Brought to you by JoVE.

RIFLESSI Passaging sulle cellule staminali embrionali umane-linee con tripsina

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

Ricerca

Biologia

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagazione di staminali embrionali umane (ES) Cellule

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivazione di cellule staminali embrionali umane da Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Immunoprecipitazione della cromatina di cellule staminali embrionali umane

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

Cultura e manutenzione di cellule staminali embrionali umane

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolamento e di espansione su vasta scala di umano adulto cellule progenitrici endoteliali che formano colonie

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

Isolamento e di espansione degli animali siero gratuito di cordone ombelicale umano derivato cellule stromali mesenchimali (MSC) e cellule endoteliali progenitrici formanti colonia (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congelamento e scongelamento cellule staminali embrionali umane

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali in precursori degli oligodendrociti

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...