Name: Video: Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth
Uploaded: 2010-05-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: 12.7K Görüntüleme. University of California. Video biyoinformatik otomatik işleme, analiz, anlayış ve mikroskobik videos çıkarılan biyolojik uzay-zamansal veri veri madenciliği. Bu makalenin amacı, bir video biyoinformatik yöntemi kullanarak insan embriyonik kök hücre koloni gelişimini ölçmek için bir yöntem göstermektir.

Bu yöntemin gelişimi Kaliforniya Tütün İlgili Hastalıkları Araştırma Programı, video Biyoinformatik UCR California Rejeneratif Tıp Enstitüsü, ve NSF IGERT hibe (0.903.667) (fon tarafından mümkün olmuştur <a href="http://www.cris.ucr.edu/IGERT/index.php">http://www.cris.ucr .edu / IGERT / index.php</a> ). Sabrina Lin, Yüksek Lisans Bölümü Tez Bursu tarafından desteklenen, Shawn Forteno bir NIH MARC Bursu tarafından desteklenen ve Shruthi Satish, Yüksek Lisans Bölümü Bursu tarafından desteklenmektedir. Biz rakamlar hazırlarken ona yardım için Anna Trtchounian minnettar. Ayrıca Sam Alworth ve Ned Jastromb CL-Quant yazılım nasıl kullanabileceğimizi bize öğretmek için teşekkür ederiz.

Bölüm 1: Deney Prosedürü Video verileri bir bilgi zenginliği içeren. Ancak, bu bilgiler genellikle ayıklamak zor ve insanlar tarafından elle yapılması ve tamamlanması için personel kaç saat zaman gerekebilir. Insanlar tarafından Manuel analizi, yorumlanması ve hata değişimi tabi. Video biyoinformatik, video görüntüleri belirli bir veri benim için bilgisayar yazılım kullanımını içerir. Bu analiz metodu hızlı ve analiz insanlar tarafından elle yapılır oluşur hata ortadan kaldırabilir. Bu makalenin amacı, bir video biyoinformatik yöntemi kullanarak insan embriyonik kök hücre kolonisi büyüme miktarının belirlenmesi için bir yöntem göstermektir. Bu çalışmada, zaman atlamalı video görüntüleri hücre birden çok alan (Şekil 1) zamanla imaged sağlayan Nikon BioStation CT kuluçka ünitesi kullanılarak toplanmıştır. Bu raporda açıklanan yöntemler kurmak mikroskobik herhangi bir video tarafından toplanan video verilere uygulanabilir. Bizim deney tasarımı, biz 48 saat için 12-iyi doku kültürü plakaları H9 hESC kaplamalı. Bu süre zarfında, koloniler Matrigel üzerinde tam olarak takın ve yaymak için izin verildi. Sonra, plakaları takılı hESC koloniler BioStation CT aktarılır ve ek bir 48 saat süreyle inkübe edildi. BioStation iken, koloniler görüntüleri 7 dakikalık aralıklarla toplanan ve daha sonra time-lapse video sekansları yaratmak için kullanıldı. Daha sonra her bir koloni için videolar CL-Quant yazılımı ile geliştirilen video biyoinformatik tarifleri kullanarak koloni gelişimini ölçmek için analiz edildi. CL-Quant yazılımı Adobe Photoshop kullanarak elle doğruluğuna kontrol edildi yaratılmış tarifleri kullanılarak analizler yapılır. Bölüm 2: ekli hESC kolonilerinin hazırlanması <ol><li> Matrigel kaplı 6-kuyucuğu hESC büyür ve bir kez% 70 confluency ulaşıldığında, aşağıdaki gibi bir 12-iyi Matrigel kaplı plaka 5 kuyu içine 6-iyi plaka iyi bir replate. </li><li> De içeren bir hESC orta aspire. </li><li> 1 ml PBS ile 2x iyice durulayın. </li><li> 37 1 dakika boyunca Accutase ve inkübe 1ml ekle ° C ve% 5 CO 2. </li><li> 10-12 cam boncuklar kuyunun içine ekleyin ve plaka koloniler tamamen kuyunun dibinden ayırmak kadar yavaşça sallayın. </li><li> MTeSR orta veya MEF klimalı ortamda 1ml kullanarak Accutase nötralize. </li><li> 3 dakika için 200 gr 15ml konik bir tüp içinde hücre süspansiyonu santrifüjleyin. </li><li> 500μl taze mTeSR orta süpernatantı ve break pelet Durusu. </li><li> 12 plaka her kuyuya hESC süspansiyon Plaka damla bilge 100μl. </li><li> Kaya levhası, ileri geri yavaşça ve hafif bir mikroskop altında kültürleri gözlemlemek. Hücre kümeleri eşit plaka boyunca dağıtılan emin olun. </li><li> 12 plaka kuvöz içine geri yerleştirin. </li><li> HESC 48 saat (kısa bir süre olabilir) takın ve büyümeye izin verin. </li><li> 48 saat sonra, PBS 500ul ile süzün orta ve yıkama kuyu unattached hücreleri çıkarmak için. </li><li> Her bir kuyu için mTeSR orta 1 ml ekleyin. </li><li> Yorum: Derhal inkübatör / video görüntüleme için mikroskop plaka koyun. </li><li> Zaman atlamalı görüntüleri toplamaya başlar. Diğer koloniler halinde büyümesini olası değildir ayrık tek koloniler alanları seçmek için çalışın. </li><li> Kültür ve hESC kurmak için başka yöntemler de yukarıdaki protokolün yerde kullanılabilir. </li></ol> Bölüm 3: video Biyoinformatik CL-Quant yazılım sırayla çalıştırdığınızda zamanla her koloni için mikron piksel sayısı veya alan belirleyecek üç &quot;tarifler&quot; oluşturmak için kullanılır oldu. Segmentasyon, iyileştirme ve ölçme, üç yemek tarifleri, sırası ve bu uygulama için inşa edilmiştir. CL-Quant yazılım / reçete geliştirme kullanarak hESC koloni büyüme analizi: <ol><li> Segmentasyon tarifi ilk oluşturulur. </li><li> Video kullanılabilir olduğundan emin olmak için tüm video tarayın. Tüm koloni görüş alanında ve diğer koloniler alanında girmeyin kalır emin olmak için kontrol edin. </li><li> Segmentasyon sihirbazını açın ve &quot;next&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> Doğru görüntü kanal (yani, faz, yeşil, kırmızı, vb.) Seçin ve &quot;next&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> 3 seçenek &quot;yumuşak eşleşen&quot; Pick ve &quot;next&quot; butonuna tıklayınız. </li><li> Genellikle görüntü koloninin merkezi bir bölgede koloni dış kenarı bölgelerde çizerek &quot;istiyorum&quot; bölgeleri seçin. <ul><li> Bu alan mümkün olduğunca küçük olmalıdır ancak tüm koloni temsilcisi olmalıdır. </li><li> Faz kontrast mikroskobu kullanırken, yazılım tarafından hassas bir koloni seçimi için koloni etrafında halo eklemeyi unutmayın. </li><li> Farklı gösterebilir faiz 1 veya 2 bölge haberleripiksel koloni içinde desenleri, ancak yanlış maske uygulaması neden olabilir çok fazla istiyor &quot;almak gerekmez. </li></ul></li><li> &quot;Next&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> Arka planın parçası koloninin bir parçası değildir ve görüntü çizerek bölgelerde bölge &quot;istemiyorum&quot; seçeneğini seçin. Bunlar, enkaz ve ölü hücreleri gibi eserler piksel bastırmak ve eklemek istediğiniz desenler var bölgelerdir. &quot;Next&quot; tuşuna basın. </li><li> Bastırmak için istediğiniz bölgelerde çizerek &quot;background&quot; seçeneğini seçin. <ul><li> &quot;Istemiyorum&quot; ve &quot;arka plan&quot; bölgeleri o arka planda farklı üniforma ve muhtemelen her karede göstermek olmalıdır. </li><li> Tipik koloni çevresinde gri bir arka plan seçin. </li></ul></li><li> &quot;Next&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> Renkli bir maske ilgi bölgesi (Şekil 2A) üzerinde görüntülenmesi gerekir. </li><li> Maske ilgi bölge doğru değilse, segmentasyon eşik aralığı (yazılım ekranın sağ alt köşesinde bulunan) artmış veya azalmış olabilir. </li><li> Segmentasyon sihirbaz, daha fazla maske alana ince ayar gerekirse ister. </li><li> Maske değiştirmek isterseniz, &quot;yumuşak uyan bölgelerde güncelleyin&quot; seçeneğini seçin. Bu, &quot;istemiyorum&quot;, &quot;istiyorum&quot; ya da &quot;arka plan&quot; alanları değiştirmenize olanak verir. </li><li> Maske tatmin edici ise, &quot;eşik uygulamak ve benim maske kaydetmek&quot;, ve &quot;next&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> Maskesi, daha sonra farklı bir renk gözükecektir. </li><li> &quot;Finish&quot; i seçin. </li><li> Tarifi yazılımın sağ üst köşesinde görüntülenir ve &quot;segmentasyon tarifi&quot; aranmalıdır. </li><li> Sağ tıklayıp &quot;adını&quot; isterseniz tarifi yeniden adlandırın. </li><li> Yerinde kontrol etmek için, sağ tıklayıp &quot;tarifi geçerlidir&quot; üzerine fare yerleştirin. </li><li> Istediğiniz kare sayısını seçin nokta tarifi kontrol ederken kullanmak için izin veren bir menü görünecektir. Maske yerleştirme doğruluğunu kontrol nokta her 10 kare için reçete çalıştırın. </li><li> Maske, istenmeyen küçük bölgeler ya da enkaz parçaları alır, bölgeye ilgi maske uydurma iyileştirmek için bir &quot;geliştirme tarifi&quot; oluşturabilirsiniz. </li><li> Bir donanım tarifi oluşturmak için, &quot;geliştirme tarifi&quot; klasörünü sağ tıklatın ve sonra &quot;yeni&quot; butonuna tıklayınız. Yeni bir geliştirme tarifi görüntülenmesi gerekir. </li><li> View (FOV) özgün alan, görüntünün sağ tarafında yer alan &quot;geçiş geliştirme modülü&quot; butonuna tıklayın. Doğru olanı belirlemek için araç çubuğundaki simgelerin üzerine fare. </li><li> &quot;Etiketleme&quot; açılır menüsünden seçin. </li><li> &quot;Etiketleme 4 bağlı&quot; seçin. </li><li> Seç &quot;etiketleme 4 connected2&quot;. </li><li> Yeni bir görev çubuğu görüntülenir olmalıdır. </li><li> Segmentasyon tarifi ilk maskesi (mask0) alın ve &quot;giriş&quot; kutusuna sürükleyin. </li><li> Çubuğu artık &quot;# giriş maskesi&quot; göstermesi gerekir. </li><li> Maske 0 simgesi &quot;# giriş maskesi&quot; simgesini sürükleyin. </li><li> Görev çubuğunda &quot;min boyutu&quot; ve faiz tek bölge görüntülenene kadar sayısını ayarlamak. Her uydurma deneme yoluyla &quot;execute&quot; tıklayın emin olun. </li><li> Minimum boyutu ayarı memnun, önceden yaratmış olduğunuz &quot;geliştirme tarifi&quot; tıklatın. (Şekil 2B) </li><li> Ekranın alt kısmında, &quot;reçeteye kaydet&quot; seçeneğini işaretleyin. </li><li> Yazılım şimdi seçilen tarifi üzerine yazılsın mı? &quot;,&quot; Evet &quot;seçin ister </li><li> Nokta nokta kontrol segmentasyon için yukarıdaki gibi aynı prosedürleri kullanarak geliştirme reçete kontrol. </li><li> Segmentasyon ve geliştirme tarifleri memnun varsa, sağ taraftaki araç çubuğunda &#39;ölçüm şablon oluşturmak&#39; seçin. </li><li> İsterseniz şablonu yeniden adlandırın. </li><li> Ölçüm şablonu penceresinde, klip art hücre rakam üzerinden götür. Ctrl tuşunu basılı tutun ve hücreyi seçin. </li><li> Işaretini kaldırın &#39;varsayılan parametre&#39; ve &#39;onay&#39; morfolojisi &#39;başlığı altında alan parametresi&#39;. </li><li> Çıkış &#39;şablon&#39; penceresi. </li><li> Ölçüm tarifi oluşturulan simgesini seçin. </li><li> Tarifi yeniden adlandırın. </li><li> Gidin ve sağ üst köşedeki &#39;şablon&#39; sekmesini seçin. </li><li> Ölçüm penceresinin üzerine, önceden oluşturulmuş bir ölçüm şablonu Sürükle ve bırak. </li><li> &#39;Evet&#39;i devam etmek. </li><li> Ölçüm tarifi penceresinde seçin, sonra &#39;Tüm hücre&#39;, &#39;Kanal eşlemeleri&#39;. </li><li> &#39;Maske seçin eşlemeleri&#39;. </li><li> Geliştirilmiş maske Sonra &#39;Tüm hücre&#39; seçeneği. </li><li> Ana pencerede Reçete sekmesi altında &#39;Ölçüm tarifi&#39; seçin. </li><li> Ölçüm tarifi pencere içinde &#39;Kaydet&#39; simgesini seçin. </li><li> Daha sonra pencereyi kapatın. </li><li> Şimdi, yakın ve &#39;FOV&#39; yeniden. </li><li> &#39;Reçete&#39; simgesini, &#39;Kilit reçete listesi&#39; sağ tıklayın ve video verilerini tarifleri sırayla çalıştırın. </li></ol> Bölüm 4: Photoshop yazılımı kullanarak tarifi hassasiyet kontrolü (CL-Quant yazılımı ile oluşturulmuş tarifi doğrulamak için) vardır, Adobe Photoshop ile aynı veriyi elle analiz edilebilir. Bu analiz için, her 10. kare (her 70 dakikada bir zaman noktasında) 48 saatten fazla koloni boyutunu ölçmek için analiz edildi. <ol><li> Adobe Photoshop bir koloni resmi bir çerçeve açın. </li><li> Magic Wand Tool araç çubuğunu tıklatın. </li><li> Koloni bölgesi hariç tüm alan kaplıdır ve bu alan üzerinde koloni çevresinde tıklayın. </li><li> Araç çubuğunda &#39;Quick Mask Mode Düzenle&#39; ve koloni seçilir, böylece koloni tıklayın tıklayın. </li><li> Koloninin çevresinde noktalı çizgi koloninin çevre etrafında oturur ve içindeki emin olun. Noktalı çizgi çevre etrafında değilse, buna göre üst araç çubuğunda tolerans değeri değiştirin. </li><li> &#39;Pencere&#39; Git menüsünde aşağı çekme ve &#39;Histogram&#39; seçeneğini tıklayın. </li><li> Cache = 1 piksel değeri bir yere yazın. Önbellek 2 ise, &#39;!&#39; önbellek 1 olarak değiştirin ve sonra piksel değeri not edin. </li><li> 10. her çerçeve için yukarıdaki işlemi tekrarlayın. Daha az toplam çerçeve, istenirse kullanılabilir. </li><li> Veri Photoshop ve CL-Quant yazılım kullanılarak toplanan birlikte çizilebilir. CL-Quant tarifleri dürüst iseniz, Photoshop ve CL-Quant analizi için eğrileri çok benzer (Şekil 3-5) olmalıdır. </li><li> CL-Quant ile geliştirilen tarifleri dürüst iseniz, diğer video verilerini güvenle uygulanabilir. </li><li> Bu analizin video biyoinformatik kullanarak değeri, segmentasyon, iyileştirme ve ölçme tarifleri geliştirilen ve doğrulandıktan sonra, onlar çok daha hızlı ve daha doğru bir insan daha Photoshop kullanarak analiz yapmak olacağını. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: hESC koloninin BioStation BT büyüme 48 saat boyunca çeşitli zamanlarda çerçeveler gösteren bir film şeridi. Çerçeveler 7 dakikalık aralıklarla alınmıştır. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: (A) Görüntü segmentasyonu tarifi kolonisi üzerinde yerleştirilen bir maske ile hESC. Enkaz ve arka alanları da bir donanım tarifi değerlendirmenin doğruluğu artırmak için gerekli olduğunu belirten maskelenir. (B) artışından sonra &quot;A&quot; gösterildiği gibi aynı koloni resmi yapılmıştır. Maske artık sadece koloni seçer ve gürültü seçim ortadan kalkmıştır. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3: 48 saat içinde koloni boyutu (piksel) artış gösteren Grafik CL-Quant yazılım ve Photoshop kullanılarak belirlenir. Bu grafik araziler ham veriler ve koloniler farklı boyutlarda başlamak olduğunu göstermektedir. Bu ölçüm her iki yöntem de iyi bir anlaşma olduğunu gösterir. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4: normalleştirme sonrası 48 saat içinde koloni boyutu yüzde göstermek için Grafik gösteren Şekil 3&#39;te aynı veri. Bu büyüme oranları başlangıç ​​koloni boyutu ne olursa olsun ve analiz iki önlemleri benzer sonuçlar veren benzer olduğunu gösterir. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5: Şekil 4 normalize veriler için araç gösteren grafiği Bu grafikte açıkça Video biyoinformatik (CL-Quant yazılım) ve Photoshop kullanarak ve tarifi dürüst olduğunu kurar yapılan analizler arasında iyi bir uyum gösterir. Çerçeve 325 Photoshop veri alanı hafif kriz Photoshop analizi dahil olmayan çeşitli videolar nedeniyle.

Video biyoinformatik araçlar, video görüntüleri hızlı bir şekilde veri ayıklamak için güçlüdür. HESC koloni büyüme miktarının belirlenmesi için protokol biyolojik bir sorun video biyoenformatik bir uygulama göstermektedir. Bu yöntem, kantitatif ve bireysel hESC koloniler ifşa veri ilginç bir özelliği vardır. Video biyoinformatik tarifleri, proliferasyon, göç, apoptozis ve substrat hücre eklenti ve komşu hücrelere hücre eklenti gibi diğer hücresel işlemlerini izlemek için geliştirilebi...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>mTeSR1 Human Embryonic Stem Cell Maintenance Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>05850</td>
<td>or any suitable medium for hESC culture.</td>
</tr>
<tr>
<td>BD Matrigel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>356234</td>
<td>or other suitable substrate.</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12 Basal Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-032</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Accutase Enzyme Cell Detachment Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>eBioscience</td>
<td>00-4555-56</td>
<td>or other suitable detachment enzyme.</td>
</tr>
<tr>
<td>3mm Glass beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>11-312A</td>
<td>optional.</td>
</tr>
<tr>
<td>12-well Tissue Culture Plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353043</td>
<td>or any other plate format.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nikon BioStation CT/IM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or other incubator/microscope suitable for collecting video data.</td>
</tr>
<tr>
<td>CL-Quant software (Nikon) and/or Photoshop (Adobe).</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

video bioinformatics analysis of human embryonic stem cell colony growth

Video veri karmaşık ve çok sayıda resim, video malzeme madencilik bilgileri oluşan Çünkü bilgisayar yazılım yardımı olmadan yapmak zor. Video biyoinformatik kalma madencilik ve analiz gerçekleştirmek için bilgisayar yazılımı kullanarak video görüntüleri uzay-zamansal veri ayıklamak için güçlü bir kantitatif bir yaklaşımdır. Bu makalede, zaman atlamalı video, video görüntüleme için bir kamera ile donatılmış bir Nikon BioStation CT inkübatör toplanan analiz ederek insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyüme ölçülmesi için bir video biyoinformatik yöntemi tanıtmak. Deneylerde, Matrigel için bağlıydık hESC koloniler BioStation CT 48 saat için çekildi. Bu kolonilerin büyüme oranını belirlemek için, yemek tarifleri, kullanıcıların video görüntüleri çeşitli veri türlerini ayıklamak için sağlayan CL-Quant yazılımı kullanılarak geliştirilmiştir. Doğru koloni gelişimini değerlendirmek için, üç yemek tarifleri oluşturuldu. Zamanla koloni koloni ve arka plan, video dizisi boyunca koloniler doğru tanımlamak için ikinci gelişmiş görüntü, ve üçüncü içine ilk bölümlenmiş görüntü piksel sayısı ölçülür. 48 saat içinde bireysel hESC kolonilerin büyüme oranını analiz için bir BioStation BT toplanan video veri sırayla üç tarifleri koşmak vardı. CL-Quant tarifleri doğruluğuna doğrulamak için, aynı veri Adobe Photoshop yazılımı kullanarak manuel olarak analiz edildi. CL-Quant tarifleri ve Photoshop karşılaştırıldı elde edilen veriler, sonuçlar, CL-Quant tarifleri dürüst gösteren hemen hemen aynıydı. Burada açıklanan yöntem hESC veya koloniler halinde yetişen diğer hücrelere büyüme oranlarını ölçmek için herhangi bir video verilere uygulanabilir. Buna ek olarak, diğer video biyoinformatik tarifleri, göç, apoptozis ve hücre yapışması gibi diğer hücre süreçleri için gelecekte geliştirilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth at JoVE.com

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video biyoinformatik otomatik işleme, analiz, anlayış ve mikroskobik videos çıkarılan biyolojik uzay-zamansal veri veri madenciliği. Bu makalenin amacı, bir video biyoinformatik yöntemi kullanarak insan embriyonik kök hücre koloni gelişimini ölçmek için bir yöntem göstermektir.

Video Biyoinformatik İnsan Embriyonik Kök Hücre Colony Büyüme Analizi

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

video-bioinformatics-analysis-human-embryonic-stem-cell-colony

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Görüntüleme.  University of California. Video biyoinformatik otomatik işleme, analiz, anlayış ve mikroskobik videos çıkarılan biyolojik uzay-zamansal veri veri madenciliği. Bu makalenin amacı, bir video biyoinformatik yöntemi kullanarak insan embriyonik kök hücre koloni gelişimini ölçmek için bir yöntem göstermektir.

Video: Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts of cell culture, and tend to acquire karyotypic abnormalities with high population doublings.  Proper passaging is essential for maintaining a healthy, undifferentiated, karyotypically normal HuES human embryonic stem cell culture.  First, an expanding culture is washed in PBS to remove residual media and cell debris, then cells are overlaid with a minimal volume of warm 0.05% Trypsin-EDTA.  Trypsin is left on the cells for up to five minutes, then cells are gently dislodged with a 2mL serological pipette.  The cell suspension is collected and mixed with a large volume of HuES media, then cells are collected by gentle centrifugation.  The inactivated trypsin media mixture is removed, and cells resuspended in pre-warmed HuES media.  An appropriate split ratio is calculated (generally 1:10 to 1:20), and cells re-plated onto a 1-2 day old plate containing a monolayer of irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells.  The newly seeded HuES culture plate is left undisturbed for 48 hrs, then media is changed every day thereafter.  It is important not to trpsinize down to a single cell suspension, as this increases the risk of introducing karyotypic abnormalities.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin. Brought to you by JoVE.

Tripsin ile Pasajlanması tonlar İnsan Embriyonik Kök Hücre hatları

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

Biyoloji

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

İnsan Embriyonik Kök Hücre (ES) yayılması

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Immunosurgery İnsan Embriyonik Kök Hücreleri türetilmesi

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

İzolasyon ve Büyük Ölçekli Genişleme Yetişkin İnsan Endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

İnsan Embriyonik Kök Hücreler Donma ve Çözülme

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.