Per l'isolamento della cripta intestinale tenue murina, utilizzare frammenti di cinque millimetri per cinque millimetri dell'intestino tenue murino isolato. Incubare i pezzi in antibiotici PBS contenenti due millimolari EDTA per 30 minuti su ghiaccio senza agitare. Per facilitare la solidificazione della matrice extracellulare, o ECM, incubare preventivamente una piastra a 24 pozzetti in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius.
Dopo aver aspirato la soluzione EDTA dai frammenti di tessuto, aggiungere 25 millilitri di antibiotici PBS freddi freschi. Quindi agitare vigorosamente il contenitore a mano, da 30 a 40 volte. Filtrare la sospensione una volta attraverso un filtro da 70 micron.
Prima di passare al passaggio successivo, confermare la presenza delle cripte al microscopio. Quindi, centrifugare la sospensione a 390 G e quattro gradi Celsius per tre minuti. Quindi, risospendere il pellet della cripta in 20 millilitri di DMEM contenente il 2% di sorbitolo, d'ora in poi indicato come sorbitolo DMEM.
Trasferire 10 millilitri della sospensione della cripta in ciascuno dei due nuovi tubi da 15 millilitri. Questa volta, centrifugare i due tubi ad una velocità inferiore di 80 G per tre minuti a quattro gradi Celsius per separare le grandi masse cellulari dalle cellule o dai detriti. Aspirare delicatamente il surnatante lasciando circa due millilitri di surnatante in ciascun tubo.
Quindi, aggiungere 10 millilitri di sorbitolo DMEM a ciascun tubo. Centrifugare nuovamente la sospensione a 80 G e quattro gradi Celsius per tre minuti. Aspirare il surnatante come dimostrato in precedenza e aggiungere 10 millilitri di sorbitolo DMEM per la ri-sospensione.
Dopo aver aspirato il surnatante, aggiungere 10 millilitri di DMEM completo e risospendere il pellet mediante pipettaggio su e giù. Lasciare riposare la sospensione per un minuto per ottenere le cripte galleggianti in modo efficiente. Dopo un minuto, filtrare la sospensione da entrambi i tubi in un tubo nuovo attraverso un filtro cellulare da 70 micron per purificare le cripte.
Per contare le cripte pure prima della semina, gocciolare goccioline da 25 microlitri in un piatto di sei centimetri in tre punti. Conta il numero di cripte al microscopio con un ingrandimento 4X e calcola la concentrazione di cripte per 25 microlitri. Quindi, centrifugare l'intero filtrato a 290 G per tre minuti a quattro gradi Celsius.
Per la semina, sospendere le cripte in ECM ad una concentrazione di 100 cripte per 40 microlitri di ECM. Pipettarlo su e giù da cinque a 10 volte delicatamente evitando bolle d'aria per ottenere una sospensione omogenea. Quindi, seminare 40 microlitri della sospensione della cripta per pozzetto nella piastra preriscaldata da 24 pozzetti.
Incubare la piastra a 24 pozzetti per 15 minuti a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per la polimerizzazione dell'ECM. Coprire l'ECM per pozzetto con 500 microlitri di terreno di coltura contenente fattore di crescita epidermico di topo, topo ricombinante R-Spondin 1 e noggin di topo ricombinante. La concentrazione finale di materiali per pozzo è mostrata qui.
Coltiva le cripte incubando a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Esegui immagini dal vivo per registrare la morfogenesi organoide utilizzando un microscopio a immagine Timelapse ogni tre ore per un massimo di sette giorni e ottieni immagini seriali Z impilate. Quasi tutte le cripte isolate furono immediatamente sigillate e apparivano a forma di cono una volta spremute dalle nicchie epiteliali.
Inoltre, le cripte nella frazione finale sono state integrate e adatte per l'uso in coltura. Le immagini timelapse della crescita organoide hanno rivelato che la proliferazione attiva e la differenziazione delle cellule staminali intestinali si sono verificate nella regione della cripta con il germogliamento. Il germogliamento è stato accoppiato con la migrazione cellulare, la proliferazione e la differenziazione delle cellule di Paneth.
