Una volta ottenuti circa 25 milioni di cellule donatrici di mitocondri il settimo giorno, raccogliere le cellule cresciute esponenzialmente in un tubo da 50 millilitri e raccoglierle centrifugando a temperatura ambiente e 520 g per cinque minuti. Lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato freddo e sedimentarle mediante centrifugazione a temperatura ambiente in 520g per cinque minuti. Ora in poi, eseguire l'intera estrazione mitocondriale a quattro gradi Celsius usando reagenti freddi e mantenere le cellule o i mitocondri sul ghiaccio.
Dopo la terza centrifugazione, scartare il surnatante mediante aspirazione utilizzando una pipetta di vetro accoppiata ad una pompa per vuoto e risospendere le celle imballate in un volume di tampone ipotonico pari a sette volte il volume del pellet cellulare. Quindi trasferire la sospensione cellulare in un tubo omogeneizzatore e lasciare che le cellule si gonfino incubandole sul ghiaccio per due minuti. Rompere le membrane cellulari eseguendo da 8 a 10 colpi nell'omogeneizzatore accoppiato a un pestello motorizzato che ruota a 600 rotazioni al minuto.
Nell'omogenato cellulare, aggiungere il tampone ipotonico pari a sette volte il volume del pellet iniziale per generare un ambiente isotonico. Trasferire l'omogenato in un tubo da 15 millilitri e centrifugarlo in un rotore fisso a 1.000 g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi raccogliere solo 3/4 del surnatante, lasciando un ampio margine dal pellet per evitare la contaminazione con nuclei o cellule intatte e trasferirlo in un altro tubo.
Dopo aver ripetuto il processo due volte, trasferire il surnatante contenente la frazione mitocondriale in tubi da 1,5 millilitri. Centrifugare i tubi alla velocità massima di 18.000 g per due minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e lavare il pellet arricchito di mitocondri con tampone A.Unire il contenuto dei due tubi in uno e centrifugare come dimostrato in precedenza.
Ripetere il processo fino a quando tutto il materiale è in un solo tubo. Lavare il pellet ottenuto dall'ultima centrifugazione utilizzando 300 microlitri di tampone A.Quantificare la concentrazione proteica mitocondriale utilizzando il saggio Bradford. Prima della fusione con la linea cellulare ricevente mitocondriale, valutare l'assenza di contaminanti nucleici nella frazione mitocondriale mediante immunorilevazione di proteine nucleari.
In alternativa eseguire la reazione a catena della polimerasi quantitativa o l'amplificazione QPCR di un gene nucleare.
