Questa ricerca è stata finanziata dal numero di sovvenzione PID2019-105128RB-I00 a RSA, JMB e AA e PGC2018-095795-B-I00 a PFS e RML, entrambi finanziati da MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 e numeri di sovvenzione B31_20R (RSA, JMA e AA) e E35_17R (PFS e RML) e finanziato da Gobierno de Aragón. Il lavoro di RSA è stato sostenuto da una sovvenzione della Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. Gli autori desiderano riconoscere l'uso di Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.

NOTA: tutti i terreni di coltura e le composizioni buffer sono specificati nella tabella 1. Prima della generazione del cibride, entrambi i profili del DNA mitocondriale e nucleare delle cellule donatrici e riceventi devono essere tipizzati per confermare la presenza di differenze genetiche in entrambi i genomi tra le linee cellulari. In questo studio, sono state utilizzate una linea cellulare L929 disponibile in commercio e la sua linea cellulare derivata, L929dt, che è stata generata spontaneamente nel nostro laboratorio (vedi13 per maggiori informazioni). Queste linee cellulari presentano due differenze nella sequenza del loro gene mt-Nd2 che possono essere utilizzate per confermare la purezza del mtDNA una volta terminato il processo di cibridizzazione13. In questo caso, la purezza dello sfondo nucleare è stata confermata dalla sensibilità agli antibiotici, poiché, contrariamente alle cellule L929dt, L929 era resistente alla geneticina.
1. Deplezione mitocondriale mediante trattamento con rodamina 6G (cellule riceventi)
NOTA: Il primo passo per una generazione di cybrid di successo è quello di abolire completamente e irreversibilmente le funzioni mitocondriali nelle cellule riceventi. A tal fine, è necessario determinare in precedenza, per ciascuna linea cellulare, la concentrazione appropriata e la durata del trattamento con rodamina 6G. Questa concentrazione adeguata dovrebbe essere appena al di sotto della morte cellulare indotta dal farmaco (la più alta che non uccide le cellule durante il trattamento). Eseguire le seguenti operazioni una volta definite le condizioni ottimali.
<ol><li>Seminare 10 6 cellule in una piastra a6 pozzetti utilizzando terreno di coltura completo (vedere Tabella 1 per i dettagli) e trattarle quotidianamente con la concentrazione ottimale di rodamina 6G per 3-10 giorni, a seconda della linea cellulare. Le concentrazioni tradizionali variano da 2 a 5 μg/ml per 3-10 giorni20,21. In questo studio, per le cellule derivate da L929, 2,5 μg/mL di rodamina 6G per 7 giorni è stato il trattamento selezionato 13,22.</li>
	<li>Per mantenere in vita le cellule, integrare il terreno di coltura cellulare con 50 μg/mL di uridina e 100 μg/mL di piruvato e rinnovarlo ogni 24 ore.</li>
	<li>Dopo il trattamento e prima della fusione, cambiare il terreno di coltura delle cellule trattate con rodamina 6G per completare il terreno di coltura cellulare senza rodamina 6G e lasciarle in questo mezzo per 3-4 ore in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2. NOTA: L'effetto tossico della rodamina 6G è irreversibile e le cellule con mitocondri non funzionali non dovrebbero recuperare20. Pertanto, dopo il trattamento, le cellule che non ricevono mitocondri funzionali dovrebbero morire anche nel terreno di coltura integrato con uridina. Pertanto, non dovrebbe essere necessaria alcuna selezione nucleare. Tuttavia, si raccomanda una fusione di controllo delle cellule trattate con rodamina 6G senza mitocondri.</li>
</ol>2. Espansione e isolamento mitocondriale (cellule donatrici)
<ol><li>Espandere le cellule donatrici dei mitocondri durante il lasso di tempo del trattamento con rodamina 6G per ottenere circa 25 x 106 cellule.</li>
	<li>Il giorno 7, raccogliere le cellule in crescita esponenziale in una provetta da 50 ml e raccoglierle mediante centrifugazione a 520 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Lavare le cellule 3 volte con soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS) e sedimentarle mediante centrifugazione a 520 x g per 5 minuti a RT. D'ora in poi, eseguire tutte le fasi di estrazione mitocondriale a 4 °C, utilizzando reagenti freddi e mantenendo le provette con cellule o mitocondri sul ghiaccio.</li>
	<li>Dopo la terza centrifugazione, scartare il surnatante mediante aspirazione utilizzando una pipetta di vetro accoppiata ad una pompa per vuoto e risospendere le celle imballate in un volume di tampone ipotonico pari a 7x il volume del pellet cellulare. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in un tubo omogeneizzatore e lasciare che le cellule si gonfino incubandole sul ghiaccio per 2 minuti.</li>
	<li>Rompere le membrane cellulari eseguendo da 8 a 10 colpi nell'omogeneizzatore accoppiato a un pestello motorizzato che ruota a 600 giri / min. NOTA: La fase di rottura della membrana cellulare può variare tra i tipi di cellule; Pertanto, deve essere ottimizzato per ogni tipo di cella.</li>
	<li>Aggiungere lo stesso volume di tampone ipertonico alla sospensione cellulare (7 volte il volume del pellet cellulare) per generare un ambiente isotonico.</li>
	<li>Trasferire l'omogenato in una provetta da 15 mL e centrifugarlo in un rotore fisso a 1.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Quindi, raccogliere solo 3/4 del surnatante lasciando un ampio margine dal pellet, per evitare la contaminazione con nuclei o cellule intatte, e trasferirlo in un altro tubo. Ripeti lo stesso processo due volte. Si noti che il surnatante deve essere conservato e il pellet scartato.</li>
	<li>Salvare la frazione mitocondriale (supernatante). Trasferirlo in provette da 1,5 ml e centrifugare alla massima velocità (18.000 x g) per 2 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Eliminare il surnatante e lavare il pellet arricchito di mitocondri con tampone A, combinando il contenuto delle due provette in uno e centrifugando nelle stesse condizioni descritte al punto 2.7. Ripetere lo stesso processo fino a quando tutto il materiale è in un solo tubo.</li>
	<li>Effettuare un ulteriore lavaggio con 300 μL di tampone A e quantificare la concentrazione di proteine mitocondriali utilizzando il saggio Bradford23. Per ogni test di cibridizzazione, deve essere determinata la quantità ottimale di mitocondri per la procedura di trasferimento (nel nostro caso, una concentrazione compresa tra 10-40 μg di proteina mitocondriale per 106 cellule).</li>
	<li>Contemporaneamente, preparare le cellule pretrattate con rodamina 6G per la fusione raccogliendole in un tubo da 15 ml e centrifugando a 520 x g per 5 minuti a RT. Si noti che il pellet acquisisce un colore rosa neon a causa del trattamento con rodamina 6G.</li>
	<li>Per garantire che sia l'abolizione della funzione mitocondriale nelle cellule recettoriali che la purificazione degli organelli dai donatori siano state eseguite correttamente, seminare un piccolo numero di cellule trattate con rodamina 6G e mitocondri isolati utilizzando il terreno di coltura completo in una piastra a 6 pozzetti e coltivarli per un mese per verificare che nessuna cellula sopravvissuta rimanga in nessuno dei pozzetti (Figura 2).</li>
	<li>In parallelo, valutare l'assenza di contaminanti nucleici nella frazione mitocondriale mediante immunorilevazione di proteine nucleari (ad esempio, lamina beta, istone H3, ecc.) o mediante amplificazione quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR) di un gene nucleare (SDH, rRNA 18S, ecc.). NOTA: Per evitare contaminazioni, si consiglia di eseguire tutti i passaggi in condizioni asettiche lavorando sotto una cappa a flusso laminare.</li>
</ol>3. Fusione e generazione di cibridi
<ol><li>Per procedere con la fusione, aggiungere con attenzione 106 delle cellule trattate con rodamina 6G al pellet mitocondriale isolato (10-40 μg di proteina mitocondriale) e centrifugare a 520 x g per 5 minuti per consentire alle cellule di mescolarsi con i mitocondri.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di glicole polietilenico (PEG, 50%) e risospendere delicatamente il pellet per 30 s. Quindi, lasciare riposare intatto per altri 30 secondi.</li>
	<li>Infine, trasferire la miscela in una piastra a 6 pozzetti con terreno di coltura cellulare completo fresco e porla nell'incubatore a 37 °C con CO2 al 5%. Dopo alcuni giorni (di solito 1 settimana), i cibridi transmitocondriali dovrebbero iniziare a crescere (Figura 2), dando origine a cloni che possono essere selezionati individualmente o miscelati in un pool prima della loro analisi.</li>
</ol>4. Verifica del background mitocondriale e nucleare
NOTA: Una volta che la nuova linea cellulare è stata stabilita e le cellule iniziano a crescere in modo esponenziale, la purezza del loro DNA mitocondriale e nucleare deve essere verificata. Pertanto, le linee cellulari originali dovrebbero ospitare diverse mutazioni o polimorfismi all'interno dei loro genomi per renderli riconoscibili.
<ol><li>Isolamento totale del DNA<ol><li>Isolare il DNA genomico di tutte le linee cellulari utilizzate per la generazione di cibridi utilizzando un kit commerciale di estrazione del DNA genomico (vedi Tabella dei materiali) o eseguendo un protocollo standard utilizzando l'estrazione di alcol fenolo-cloroformio-isoamilico e la precipitazione dell'alcol24.</li>
	</ol></li>
	<li>valutazione del mtDNA (Figura 3) NOTA: Diverse tecniche, come il sequenziamento, l'analisi del polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione (RFLP) o la qPCR allele-specifica, possono essere eseguite per analizzare la purezza del mtDNA. Per confermare la presenza di variazioni della sequenza del mtDNA mediante RFLP, seguire i passaggi successivi del protocollo.<ol><li>Amplificare un frammento di mtDNA contenente il cambiamento nucleotidico mediante PCR.<ol><li>Qui, le cellule L929dt presentano una mutazione del mtDNA in posizione 4206, all'interno di un gene mt-Nd2 (m.4206C>T) che è assente nelle cellule L929. Per confermare la presenza di questa sostituzione nei cibridi transmitocondriali, amplificare un frammento di 397 bp mediante PCR utilizzando un protocollo standard e i seguenti primer: 1) 5'-AAGCTATCGGG CCCATACCCCG-3' (posizioni 3862-3884) e 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (posizioni 4236-4258).</li>
		</ol></li>
		<li>Analizzare la presenza della sostituzione nucleotidica desiderata mediante RFLP, utilizzando un'endonucleasi specifica che riconosce il cambiamento di sequenza e genera un diverso schema di taglio per entrambe le linee cellulari. NOTA: Quando è presente la variante del mtDNA L929dt (4206T), l'amplicone ottenuto al punto 4.2.1 contiene due siti di restrizione per SspI (vedere Tabella dei materiali) che producono tre frammenti di DNA di 306 bp, 52 bp e 39 bp. Il sito di restrizione che genera le bande 52 e 39 viene interrotto quando è presente la versione wild-type (WT) C4206 e viene visualizzata una nuova banda di 91 bp. Pertanto, nell'analisi è incluso un controllo interno per la digestione completa per SspI. La reazione di digestione viene eseguita a 37 °C, seguendo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Separare i frammenti di restrizione mediante elettroforesi e confrontare il modello di bande.<ol><li>Una volta eseguita la digestione, analizzare i frammenti di restrizione ottenuti mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide-tris-borato-EDTA (TBE) al 10% (vedere Tabella 1 per la composizione di 1x TBE). Eseguire l'elettroforesi a 80 V per 1 ora a RT. Visualizzare i frammenti di DNA dopo la colorazione del gel in una soluzione di bromuro di etidio in 1x TBE per 15 minuti a RT (vedere Tabella 1 per la composizione della soluzione colorante con gel).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Genotipizzazione del DNA nucleare NOTA: La genotipizzazione del DNA nucleare deve essere eseguita utilizzando il precedente campione di estrazione del DNA utilizzato per l'analisi RFLP.<ol><li>Amplificare 16 loci (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 e AMEL) utilizzando un pool di oligonucleotidi specifici per uso commerciale (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Eseguire l'elettroforesi utilizzando un analizzatore genetico per separare i frammenti precedentemente ottenuti. NOTA: Una volta amplificati, i diversi loci vengono analizzati mediante elettroforesi utilizzando un sistema capilare (vedi Tabella dei materiali). I frammenti sono separati in un capile lungo 50 cm riempito con un polimero commerciale. Anche i tamponi catodici e anodici sono disponibili in commercio, come mostrato nella tabella dei materiali. L'elettroforesi viene eseguita a 19,5 kV per 20 minuti a 60 °C.</li>
		<li>Utilizzare strumenti bioinformatici per determinare gli alleli corrispondenti a ciascun locus amplificato (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Confrontare i dati ottenuti nella fase 4.3.3 con il database del profilo del DNA nucleare (Tabella 1), per verificare se il profilo del DNA nucleare corrisponde al profilo della linea cellulare del recettore dei mitocondri (Figura 4).</li>
	</ol></li>
</ol>

Generazione di cibridi trasmettitocondriali da cellule tumorali in sospensione

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Da quando Otto Warburg ha riferito che le cellule tumorali spostano il loro metabolismo e potenziano la "glicolisi aerobica"3,4 riducendo la respirazione mitocondriale, l'interesse per il ruolo dei mitocondri nella trasformazione e nella progressione del cancro è cresciuto esponenzialmente. Negli ultimi anni, le mutazioni nel mtDNA e la disfunzione mitocondriale sono state postulate come segni distintivi di molti tipi di cancro25. Ad oggi...

Riprogrammare il metabolismo energetico è un segno distintivo del cancro1 che è stato osservato per la prima volta da Otto Warburg nel 19302. In condizioni aerobiche, le cellule normali convertono il glucosio in piruvato, che poi genera acetil-coA, alimentando il macchinario mitocondriale e promuovendo la respirazione cellulare. Tuttavia, Warburg ha dimostrato che, anche in condizioni normossiche, la maggior parte delle cellule tumorali converte il piruvato ottenuto dal processo di glicolisi in lattato, spostando il loro modo di ottenere energia. Questo aggiustamento metabolico è noto come "effetto Warburg" e consente ad alcune cellule tumorali di soddisfare le loro richieste energetiche di crescita rapida e divisione, nonostante generino ATP in modo meno efficiente rispetto al processo aerobico 3,4,5. Negli ultimi decenni, numerosi lavori hanno supportato l'implicazione della riprogrammazione del metabolismo nella progressione del cancro. Quindi, l'energetica del tumore è considerata un obiettivo interessante contro il cancro1. Come hub centrale nel metabolismo energetico e nella fornitura di precursori essenziali, i mitocondri svolgono un ruolo chiave in questi adattamenti cellulari che, ad oggi, comprendiamo solo parzialmente.
In linea con quanto sopra, le mutazioni del DNA mitocondriale (mtDNA) sono state proposte come una delle possibili cause di questa riprogrammazione metabolica, che potrebbe portare a una ridotta prestazione della catena di trasporto degli elettroni (ETC)6 e spiegherebbe perché alcune cellule tumorali migliorano il loro metabolismo glicolitico per sopravvivere. Infatti, è stato riportato che il mtDNA accumula mutazioni all'interno delle cellule tumorali, essendo presente in almeno il 50% dei tumori7. Ad esempio, un recente studio condotto da Yuan et al. ha riportato la presenza di molecole di mtDNA ipermutate e troncate nei tumori del rene, del colon-retto e della tiroide8. Inoltre, molti lavori hanno dimostrato che alcune mutazioni del mtDNA sono associate ad un fenotipo tumorale più aggressivo e ad un aumento del potenziale metastatico delle cellule tumorali 9,10,11,12,13,14,15,16.
Nonostante l'apparente rilevanza del genoma mitocondriale nella progressione del cancro, lo studio di queste mutazioni e il loro contributo alla malattia sono stati difficili a causa delle limitazioni nei modelli sperimentali e nelle tecnologie attualmente disponibili17. Pertanto, sono necessarie nuove tecniche per comprendere il reale impatto del DNA dei mitocondri nello sviluppo e nella progressione della malattia del cancro. In questo lavoro, introduciamo un protocollo per la generazione di cibridi transmitocondriali da cellule tumorali in crescita in sospensione, basato sul ripopolamento di cellule pretrattate con rodamina 6G con mitocondri isolati, che supera le principali sfide dei metodi tradizionali di cibridizzazione18,19. Questa metodologia consente l'utilizzo di qualsiasi nucleo donatore indipendentemente dalla disponibilità della corrispondente linea cellulare ρ0 e il trasferimento di mitocondri da cellule che, seguendo le tecniche tradizionali, sarebbero difficili da enucleare (cioè linee cellulari non aderenti).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3500XL Genetic Analyzer&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4406016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4427368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anode Buffer Container 3500 Series</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4393927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>131015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathode Buffer Container 3500 Series</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4408256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>131026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10131027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Teflon pestle</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>196102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniProtean Tetra4 Gel System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Custom products</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide Solution 30%</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>A3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POP-7</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4393714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAmp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum Fetal Bovine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SspI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin/penicillin</td>
			<td>PAN biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>P14030b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transmitochondrial cybrid generation using cancer cell lines

Negli ultimi anni, il numero di studi dedicati ad accertare la connessione tra mitocondri e cancro è aumentato in modo significativo. Tuttavia, sono ancora necessari ulteriori sforzi per comprendere appieno il legame che coinvolge le alterazioni nei mitocondri e nella tumorigenesi, nonché per identificare i fenotipi mitocondriali associati al tumore. Ad esempio, per valutare il contributo dei mitocondri nei processi di tumorigenesi e metastasi, è essenziale comprendere l'influenza dei mitocondri dalle cellule tumorali in diversi ambienti nucleari. A tal fine, un possibile approccio consiste nel trasferire i mitocondri in un diverso background nucleare per ottenere le cosiddette cellule cibridi. Nelle tecniche tradizionali di cibridizzazione, una linea cellulare priva di mtDNA (ρ0, cellula donatrice nucleare) viene ripopolata con mitocondri derivati da cellule enucleate o piastrine. Tuttavia, il processo di enucleazione richiede una buona adesione cellulare alla piastra di coltura, una caratteristica che viene parzialmente o completamente persa in molti casi nelle cellule invasive. Inoltre, un'altra difficoltà riscontrata nei metodi tradizionali è quella di ottenere la completa rimozione del mtDNA endogeno dalla linea cellulare mitocondriale-ricevente per ottenere sfondi di DNA nucleare e mitocondriale puro, evitando la presenza di due diverse specie di mtDNA nel cibride generato. In questo lavoro, presentiamo un protocollo di scambio mitocondriale applicato alle cellule tumorali in sospensione in crescita basato sul ripopolamento di cellule pretrattate con rodamina 6G con mitocondri isolati. Questa metodologia ci consente di superare i limiti degli approcci tradizionali e quindi può essere utilizzata come strumento per espandere la comprensione del ruolo mitocondriale nella progressione del cancro e nelle metastasi.

Reprogramming energy metabolism is a hallmark of cancer1 that was observed for the first time by Otto Warburg in the 1930s2. Under aerobic conditions, normal cells convert glucose into pyruvate, that then generates acetyl-coA, fuelling the mitochondrial machinery and promoting cellular respiration. Nevertheless, Warburg demonstrated that, even under normoxic conditions, most cancer cells convert pyruvate obtained from the glycolysis process into lactate, shifting their way to obtain energy. This metabolic adjustment is known as the &#34;Warburg effect&#34; and enables some cancer cells to supply their energetic demands for rapid growth and division, despite generating ATP less efficiently than the aerobic process3,4,5. In recent decades, numerous works have supported the implication of metabolism reprogramming in cancer progression. Hence, tumor energetics is considered an interesting target against cancer1. As a central hub in energetic metabolism and in the supply of essential precursors, mitochondria play a key role in these cell adaptations that, to date, we only partially understand.
In line with the above, mitochondrial DNA (mtDNA) mutations have been proposed as one of the possible causes of this metabolic reprogramming, which could lead to an impaired electron transport chain (ETC) performance6 and would explain why some cancer cells enhance their glycolytic metabolism to survive. Indeed, it has been reported that mtDNA accumulates mutations within cancer cells, being present in at least 50% of tumors7. For example, a recent study carried out by Yuan et al. reported the presence of hypermutated and truncated mtDNA molecules in kidney, colorectal, and thyroid cancers8.&#160;Moreover, many works have demonstrated that certain mtDNA mutations are associated with a more aggressive tumor phenotype and with an increase in the metastatic potential of cancer cells9,10,11,12,13,14,15,16.
Despite the apparent relevance of the mitochondrial genome in cancer progression, the study of these mutations and their contribution to the disease have been challenging due to limitations in the experimental models and technologies currently available17. Thus, new techniques to understand the real impact of mitochondria DNA in cancer disease development and progression are needed. In this work, we introduce a protocol for transmitochondrial cybrid generation from suspension-growing cancer cells, based on the repopulation of rhodamine 6G-pretreated cells with isolated mitochondria, that overcomes the main challenges of traditional cybridization methods18,19. This methodology allows the use of any nuclei donor regardless of the availability of their corresponding &#961;0 cell line and the transfer of mitochondria from cells that, following the traditional techniques, would be difficult to enucleate (i.e., non-adherent cell lines).

Autore in primo piano: Generazione di cibridi trasmissocondriali utilizzando linee cellulari tumorali  

Generazione di cibridi transmitocondriali utilizzando linee cellulari tumorali

This research aims to better understand the contribution of mitochondrion in cancer progression and metastasis. The transmitochondrial cybrid generation can help us to elucidate how and at what level mitochondrial genotypes are involved in the aggressiveness of a tumor cell. One of the technologies to obtain information on mitochondrial role in cancer is cybrid generation.We combine this tool with a variety of other methods that include donative electrophoresis, respiration analysis and other mitochondrial functional assays, flow cytometry, proteomics, et cetera. The plasticity of cancer cells together with the interaction networks between nuclear and mitochondrial genes, increases the complexity of our experiments and data interpretation. This is one of the reasons why is necessary to develop a new experimental approaches.One of the most exciting findings from our research has been the discovery of two mitochondrial DNA mutations associated with detachment of cells from the play dish resembling metastasis generation and making the cells completely dependent on aerobic glycolysis, and also making them more tumorigenic and metastatic in in vivo models. This mitochondria exchange protocol can be applied to suspension growing cancer cells. The chronology can overcome the limitations of traditional approaches where the nucleation process and the complete removal of mitochondrial DNA from mitochondrial recipient cell lines often become a real challenge.

Dopo aver seguito il protocollo sopra presentato, dovrebbe essere ottenuta una linea cellulare di cibride omoplasmatico con un background nucleare conservato ma con un nuovo genotipo mitocondriale, come rappresentato negli schemi in Figura 1 e Figura 2. La purezza del DNA mitocondriale e nucleare presente nei cibridi può essere confermata dalla RFLP, come mostrato nella Figura 3, e dall'analisi di genotipizzazione del DNA nucleare,...

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Questo protocollo descrive una tecnica per la generazione di cibridi da cellule tumorali in sospensione come strumento per studiare il ruolo dei mitocondri nel processo tumorigenico.

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...

Questa ricerca mira a comprendere meglio il contributo del mitocondrio nella progressione del cancro e nelle metastasi. La generazione di cibridi transmitocondriali può aiutarci a chiarire come e a quale livello i genotipi mitocondriali sono coinvolti nell'aggressività di una cellula tumorale. Una delle tecnologie per ottenere informazioni sul ruolo mitocondriale nel cancro è la generazione di cibridi.Combiniamo questo strumento con una varietà di altri metodi che includono elettroforesi donativa, analisi della respirazione e altri saggi funzionali mitocondriali, citometria a flusso, proteomica, eccetera. La plasticità delle cellule tumorali insieme alle reti di interazione tra geni nucleari e mitocondriali, aumenta la complessità dei nostri esperimenti e l'interpretazione dei dati. Questo è uno dei motivi per cui è necessario sviluppare nuovi approcci sperimentali.Uno dei risultati più interessanti della nostra ricerca è stata la scoperta di due mutazioni del DNA mitocondriale associate al distacco delle cellule dal piatto di gioco che assomigliano alla generazione di metastasi e rendono le cellule completamente dipendenti dalla glicolisi aerobica, e le rendono anche più tumorigeniche e metastatiche in modelli in vivo. Questo protocollo di scambio mitocondriale può essere applicato alle cellule tumorali in crescita in sospensione. La cronologia può superare i limiti degli approcci tradizionali in cui il processo di nucleazione e la completa rimozione del DNA mitocondriale dalle linee cellulari riceventi mitocondriali diventano spesso una vera sfida.

transmitochondrial-cybrid-generation-using-cancer-cell-lines

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

1.6K Views.  University of Zaragoza. Questa ricerca mira a comprendere meglio il contributo del mitocondrio nella progressione del cancro e nelle metastasi. La generazione di cibridi transmitocondriali può aiutarci a chiarire come e a quale livello i genotipi mitocondriali sono coinvolti nell'aggressività di una cellula tumorale. Una delle tecnologie per ottenere informazioni sul ruolo mitocondriale nel cancro è la generazione di cibridi.Combiniamo questo strumento con una varietà di altri metodi che includono elettro...

Video: Autore in primo piano: Generazione di cibridi trasmissocondriali utilizzando linee cellulari tumorali  

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more efforts are still needed to fully understand the link involving alterations in mitochondria and tumorigenesis, as well as to identify tumor-associated mitochondrial phenotypes. For instance, to evaluate the contribution of mitochondria in tumorigenesis and metastasis processes, it is essential to understand the influence of mitochondria from tumor cells in different nuclear environments. For this purpose, one possible approach consists of transferring mitochondria into a different nuclear background to obtain the so-called cybrid cells. In the traditional cybridization techniques, a cell line lacking mtDNA (&#961;0, nuclear donor cell) is repopulated with mitochondria derived from either enucleated cells or platelets. However, the enucleation process requires good cell adhesion to the culture plate, a feature that is partially or completely lost in many cases in invasive cells. In addition, another difficulty found in the traditional methods is achieving complete removal of the endogenous mtDNA from the mitochondrial-recipient cell line to obtain pure nuclear and mitochondrial DNA backgrounds, avoiding the presence of two different mtDNA species in the generated cybrid. In this work, we present a mitochondrial exchange protocol applied to suspension-growing cancer cells based on the repopulation of rhodamine 6G-pretreated cells with isolated mitochondria. This methodology allows us to overcome the limitations of the traditional approaches, and thus can be used as a tool to expand the comprehension of the mitochondrial role in cancer progression and metastasis.

This protocol describes a technique for cybrid generation from suspension-growing cancer cells as a tool to study the role of mitochondria in the tumorigenic process.

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Mitochondrial Depletion by Rhodamine 6G for Transmitochondrial Cybrid Generation

To perform mitochondrial depletion of the mitochondrial recipient cell line, seed 1 million cells in a six-well plate using complete culture medium containing 10%FBS and Penicillin-Streptomycin. Treat the cells daily with the optimal concentration of Rhodamine 6G for three to seven days, depending on the type of cell line. To keep the cells alive, supplement the cell culture medium with 50 micrograms per milliliter of uridine and 100 micrograms per milliliter of pyruvate.After treatment and prior to fusion with a mitochondria isolated from the donor cell line, remove the medium of Rhodamine 6G treated cells and add complete cell culture medium without Rhodamine 6G. Incubate the cells at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for three to four hours. Finally, to prepare the Rhodamine 6G pretreated cells for the fusion, collect them in a 15-milliliter tube, and centrifuge the tube at room temperature and 520G for five minutes.Note that the pellet acquires a neon pink color due to Rhodamine 6G treatment.

Deplezione mitocondriale da Rhodamine 6G per la generazione di Cybrid transmitocondriale

Mitochondrial Isolation for Transmitochondrial Cybrid Generation

Once around 25 million mitochondria donor cells are obtained on day seven, harvest the exponentially grown cells in a 50-milliliter tube and collect them by centrifuging at room temperature and 520g for five minutes. Wash the cells with cold phosphate-buffered saline and sediment them by centrifugation at room temperature in 520g for five minutes. Now onwards, perform the whole mitochondrial extraction at four degrees Celsius using cold reagents and keep the cells or mitochondria on ice.After the third centrifugation, discard the supernatant by aspiration using a glass pipette coupled to a vacuum pump and resuspend the packed cells in a volume of hypotonic buffer equal to seven times the cell pellet volume. Then transfer the cell suspension into a homogenizer tube and let the cells swell by incubating them on ice for two minutes. Break the cell membranes by performing 8 to 10 strokes in the homogenizer coupled to a motor-driven pestle rotating at 600 rotations per minute.Into the cell homogenate, add the hypotonic buffer equal to seven times the volume of the initial pellet to generate an isotonic environment. Transfer the homogenate into a 15-milliliter tube and centrifuge it in a fixed rotor at 1, 000g and four degrees Celsius for five minutes. Then collect only 3/4 of the supernatant, leaving a large margin from the pellet to avoid contamination with nuclei or intact cells and transfer it to another tube.After repeating the process twice, transfer the supernatant containing the mitochondrial fraction into 1.5-milliliter tubes. Centrifuge the tubes at the maximum speed of 18, 000g for two minutes at four degrees Celsius. Discard the supernatant and wash the mitochondria-enriched pellet with buffer A.Combine the content of the two tubes into one and centrifuge as demonstrated before.Repeat the process until all the material is in only one tube. Wash the pellet obtained from the last centrifugation using 300 microliters of buffer A.Quantify the mitochondrial protein concentration using the Bradford assay. Before fusion with the mitochondrial recipient cell line, evaluate the absence of nuclei contaminants in the mitochondrial fraction by immunodetection of nuclear proteins.Alternatively perform quantitative polymerase chain reaction or QPCR amplification of a nuclear gene.

Isolamento mitocondriale per la generazione di cibridi transmitocondriali

Fusion and Transmitochondrial Cybrid Generation

For transmitochondrial cybrid generation, use the mitochondrial recipient cells that have been depleted to mitochondria by Rhodamine 6G treatment, and perform fusion with mitochondria isolated from the mitochondria donor cells. Ensure proper mitochondrial function abolishment in recipient cells and organelle purification from donor cells by seeding a small number of Rhodamine 6G-treated cells and isolated mitochondria in complete culture medium in a six-well plate. Check for no surviving cells remaining in the wells after one month of culture.To proceed with the fusion, carefully add the Rhodamine 6G-treated cells to the isolated mitochondria pellet. Then centrifuge at 520g for five minutes to allow the cells to mix with the mitochondria. Add 100 microliters of 50%polyethylene glycol and gently resuspend the pellet for 30 seconds Then allow the suspension to rest untouched for another 30 seconds.Finally, transfer the mix into a six-well plate with fresh complete cell culture medium, and place it in the incubator at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide. Usually, after about one week, transmitochondrial cybrids should start growing, giving rise to clones that can be individually selected or mixed in a pool prior to their analysis. The restriction fragments obtained from the restriction fragment length polymorphism, or RFLP, analysis of wild-type mitochondria differed from the mutant one.The RFLP analysis of the new transmitochondrial cell lines indicated that restriction fragments were identical to those obtained in their respective mitochondrial donors and different from those generated with the recipient cell lines. Further, the difference in a typical DNA nuclear genotyping profile of the two cell lines used in the hybridization process could also be used to confirm nuclear DNA purity.