Per iniziare, lavare le iPSC coltivate con PBS o DPBS di Dulbecco. E aggiungere un millilitro di miscela proteolitica e collagenolitica. Incubare il piatto a 37 gradi Celsius per due minuti per staccare le cellule.
Quindi, aggiungere 1,5 millilitri di terreno di coltura iPSC preriscaldato per fermare la reazione. Dissociare le cellule dal piatto di coltura cellulare pipettando su e giù da sette a 10 volte per ottenere una sospensione unicellulare. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da centrifuga conica da 15 millilitri.
Pellettare le celle a 200xg per cinque minuti a temperatura ambiente. E aspirare il surnatante. Risospendere il pellet in due millilitri di terreno di coltura iPSC integrato con 50 micromolari Y27632.
Ora, utilizzare 10 microlitri della sospensione cellulare per contare le cellule utilizzando una camera Neubauer. Regolare la concentrazione della sospensione cellulare a 9.000 cellule per 150 microlitri utilizzando terreno di coltura iPSC integrato con 50 micromolari Y27632. Per generare corpi embrioidi o EB, agitare il tubo di sospensione cellulare per prevenire la sedimentazione cellulare prima di seminare 150 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra ultra-bassa di attacco a 96 pozzetti.
Coltivare gli EB in un'atmosfera umificata per 48 ore. Alla fine dell'incubazione, rimuovere 100 microlitri di terreno per pozzetto. E aggiungere 150 microlitri di mezzo fresco preriscaldato senza Y27632.
Creare una griglia di fossette quattro per quattro sul parafilm posizionando la griglia del parafilm sul rack del tubo da 0,2 millilitri con il lato avvolto verso l'alto. E premere delicatamente un dito guantato contro ciascun foro del rack per incorporare gli EB nella matrice della membrana basale. Quindi rimuovere la carta e tagliare la griglia della fossetta dal quadrato del parafilm usando le forbici per regolarne le dimensioni per adattarla a un piatto di coltura cellulare da 60 millilitri.
Riposizionare il parafilm con fossette sul rack del tubo da 0,2 millilitri per fornire una base per la generazione di goccioline della matrice della membrana basale. Trasferire con cautela gli EB uno dopo l'altro dal pozzetto del piatto di coltura alle fossette del parafilm usando una pipetta con una punta di pipetta da 200 microlitri tagliata. Dopo aver spostato 16 EB sulla rete, prendere una nuova punta per pipetta da 200 microlitri e rimuovere il mezzo rimanente dalle fossette.
Ora, pipettare una goccia di matrice di membrana basale su ciascuna fossetta contenente un EB. Prendi una punta di pipetta da 10 microlitri e sposta rapidamente gli EB al centro di ogni goccia senza disturbare i bordi delle goccioline. Posizionare il parafilm con fossette con le gocce di matrice della membrana basale in un piatto di coltura cellulare da 60 millimetri. E incubare per 15-30 minuti a 37 gradi Celsius per consentire alla matrice di polimerizzare.
Inoltre, per staccare gli EB incorporati nella matrice dal parafilm, aggiungere cinque millilitri di mezzo di differenziazione senza vitamina A al piatto. E capovolgere il parafilm con una pinza in modo che il lato con gli EB sia rivolto verso il fondo del piatto. Agitare con cautela il piatto per staccare dal parafilm le gocce di matrice della membrana basale contenenti gli EB.
Se alcuni di essi sono ancora attaccati, prendi un bordo del quadrato del parafilm usando una pinza e arrotolalo rapidamente verso il centro del piatto più volte. Quindi coltivare gli organoidi cerebrali su uno shaker orbitale a 55 giri / min in un'atmosfera umidificata con il 5% di anidride carbonica e il 95% di aria a 37 gradi Celsius. Mantenere gli organoidi in DM senza vitamina A con cambiamenti medi a giorni alterni.
Viene mostrata un'immagine in campo chiaro di un organoide cerebrale umano post-semina di 32 giorni con strutture simili a ventricole alla periferia e una morfologia compatta e sana.
