Per iniziare l'imaging delle cellule HeLa trasfettate, selezionare un tempo di esposizione sufficientemente lungo per i singoli canali di fluorescenza in modalità live view in base agli istogrammi di intensità generati dal software di imaging. Impostare il numero appropriato di piani per l'imaging sull'asse Z. Selezionare il numero appropriato di campi visivi da visualizzare per ogni riotto.
Per avviare l'analisi quantitativa delle immagini acquisite, eseguire la correzione dello sfondo per tutte le immagini provenienti da tutti i canali di fluorescenza. A seconda delle dimensioni degli oggetti analizzati, selezionare la dimensione del filtro appropriata. Quindi, avvia la segmentazione dell'immagine creando una maschera dell'oggetto principale in base al rapporto tra l'intensità del segnale fluorescente e lo sfondo per il canale corrispondente ai nuclei cellulari.
Creare maschere per i sottooggetti che rappresentano BrdU e macchie di DNA mitocondriale utilizzando i canali di fluorescenza appropriati per le strutture date. Impostare i parametri e misurare l'intensità dei singoli pixel all'interno di ciascuna maschera per tutti i canali di fluorescenza. Per ottenere le intensità totali di fluorescenza per il canale BrdU o del DNA mitocondriale si sommano le intensità di tutti i sub oggetti assegnati ad un dato nucleo cellulare.
Per ottenere l'intensità media di fluorescenza, dividere l'intensità totale della fluorescenza per la somma dell'area dei sub oggetti assegnati a un dato nucleo cellulare. I risultati dell'imaging sono stati verificati misurando il DNA mitocondriale e i livelli di espressione genica utilizzando la PCR quantitativa in tempo reale. Il trattamento con dideossicitidina o DDC ha determinato una forte diminuzione dei livelli di DNA mitocondriale.
Un effetto più debole è stato osservato nel silenziamento dell'elicasi TFAM e TWINKLE, mentre la trasfezione di cellule con DNA polimerasi mitocondriale gamma o POLG siRNA ha avuto un effetto modesto sul numero di copie del DNA mitocondriale. La quantificazione dell'espressione di elicasi TFAM e TWINKLE ha confermato un'efficiente riduzione dell'espressione di mRNA a circa il 15-20% dei livelli di controllo. Nel POLG, l'espressione dell'mRNA è stata ridotta solo al 30%, il che spiega l'inaspettato modesto effetto sul numero di copie del DNA mitocondriale.
