Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Centre, Polonia (numero di sovvenzione / premio: 2018/31 / D / NZ2/03901).

1. Preparazione della miscela di siRNA
<ol><li>Un giorno prima dell'inizio dell'esperimento, le cellule seme (ad esempio, HeLa) su un piatto di 100 mm in modo che raggiungano il 70% -90% di confluenza il giorno successivo. NOTA: Tutte le operazioni devono essere eseguite in condizioni sterili in una camera a flusso laminare.</li>
	<li>Preparare la quantità appropriata di siRNA diluito ad una concentrazione di 140 nM nel mezzo Opti-MEM (vedere Tabella dei materiali). Una piastra da 96 pozzetti può essere utilizzata come serbatoio.</li>
	<li>Aggiungere 5 μL della soluzione di siRNA (o mezzo Opti-MEM per i campioni di controllo) a ciascun pozzetto di una micropiastra di coltura cellulare nera a 384 pozzetti. NOTA: A seconda del numero di campioni di siRNA testati, è possibile utilizzare una pipetta elettronica o multicanale.</li>
	<li>Preparare la quantità appropriata di soluzione di reagente di trasfezione RNAiMAX (vedere Tabella dei materiali) nel mezzo Opti-MEM. Aggiungere 1 μL di RNAiMAX per ogni 100 μL di terreno.</li>
	<li>Aggiungere 10 μL della soluzione di reagente di trasfezione a ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti. Il modo più conveniente e veloce per farlo è con un distributore di reagenti.</li>
	<li>Incubare il siRNA con il reagente di trasfezione per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
</ol>2. Preparazione delle cellule per la trasfezione
<ol><li>Durante l'incubazione (fase 1.6), aspirare il mezzo utilizzando un dispositivo di aspirazione (vedere Tabella dei materiali) e lavare le celle con 3 ml di PBS.</li>
	<li>Aggiungere 1,5 mL di tripsina diluita 1:2 in PBS e incubare le cellule a 37 °C per 10 minuti.</li>
	<li>Controlla se le celle si sono staccate; in tal caso, aggiungere 3 ml di terreno DMEM con FBS al 10%. Sospendere accuratamente le cellule e trasferirle in un tubo da 15 ml. Prelevare almeno 150 μL della sospensione e contare le celle in una camera per il conteggio delle cellule (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Preparare una sospensione cellulare alla concentrazione appropriata (35.000 / ml per la linea HeLa) in mezzo DMEM con 10% FBS, penicillina e streptomicina.</li>
</ol>3. Trasfezione cellulare
<ol><li>Aggiungere 20 μL della sospensione cellulare a ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti utilizzando il dosatore di reagenti. Ciò si tradurrà in 700 cellule seminate per pozzetto.</li>
	<li>Incubare le cellule per 1 ora a temperatura ambiente, quindi metterle nell'incubatore per 72 ore (37 °C e 5% CO2).</li>
</ol>4. Costituzione di BrdU
<ol><li>Preparare una soluzione da 90 μM di BrdU (vedere Tabella dei materiali) in mezzo DMEM con FBS al 10%.</li>
	<li>A 56 ore dopo la trasfezione di siRNA (16 ore prima della fissazione cellulare), aggiungere 10 μL di soluzione di BrdU a 90 μM a ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti (la concentrazione finale di BrdU è di 20 μM). NOTA: l'azione deve essere eseguita il più velocemente possibile; Pertanto, è meglio utilizzare un distributore di reagenti, una pipetta elettronica o una pipetta multi-dispenser. Ricordarsi di preparare pozzetti di controllo senza l'aggiunta di BrdU.</li>
	<li>Incubare le cellule per 16 ore (37 °C e 5% CO2).</li>
</ol>5. Etichettatura dei mitocondri
<ol><li>Preparare una soluzione da 20 μM di BrdU in DMEM con FBS al 10% e aggiungere ad essa la soluzione di colorante tracciante dei mitocondri (vedi Tabella dei materiali) ad una concentrazione di 1,1 μM.</li>
	<li>A 15 ore dall'inizio dell'incorporazione di BrdU (1 ora prima della fissazione cellulare), aggiungere 10 μL della soluzione di colorante che traccia i mitocondri (vedi Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto della piastra da 384 pozzetti (la concentrazione finale del colorante è 200 nM). NOTA: utilizzare un distributore di reagenti, una pipetta elettronica o una pipetta multi-dispenser. Ricordarsi di conservare i pozzetti di controllo senza l'aggiunta di BrdU ma con l'aggiunta del colorante di tracciamento dei mitocondri.</li>
	<li>Incubare le cellule per 1 ora (37 °C e 5% di CO2).</li>
</ol>6. Fissazione cellulare
NOTA: Tutto il lavaggio viene eseguito più comodamente utilizzando una lavatrice a micropiastre, mentre l'aggiunta di reagenti viene eseguita più rapidamente utilizzando un distributore di reagenti.
<ol><li>Utilizzando la rondella a micropiastre (vedere Tabella dei materiali), sciacquare ogni pozzetto due volte con 100 μL di PBS. Dopo il secondo lavaggio, lasciare 25 μL di PBS nel pozzetto. NOTA: Lasciare PBS nel pozzetto riduce la probabilità di distacco cellulare durante l'aggiunta di liquido nella fase successiva. Tutti i lavaggi sono completati con il PBS lasciato dentro; pertanto, la soluzione aggiunta nel passaggio successivo deve sempre essere preparata a una concentrazione 2x in quanto verrà aggiunta in un volume uguale al PBS rimanente.</li>
	<li>Fissare le cellule aggiungendo 25 μL di una soluzione di formaldeide all'8% in PBS con Triton X-100 allo 0,4% e Hoechst 33342 ad una concentrazione di 4 μg/mL (le concentrazioni finali dei singoli reagenti sono rispettivamente 4%, 0,2% e 2 μg/ml) (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 30 minuti.</li>
</ol>7. Blocco
<ol><li>Risciacquare ogni pozzetto quattro volte con 100 μL di PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare 25 μL di PBS nel pozzetto.</li>
	<li>Aggiungere 25 μL di BSA al 6% in PBS (la concentrazione finale di BSA è del 3%) a ciascun pozzetto.</li>
	<li>Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 30 minuti.</li>
</ol>8. Aggiunta degli anticorpi primari
<ol><li>Aspirare il BSA utilizzando una rondella a micropiastre e lasciare 10 μL di soluzione nel pozzetto.</li>
	<li>Aggiungere 10 μL della soluzione anticorpale primaria preparata in BSA al 3% in PBS. Utilizzare anti-BrdU a 0,8 μg/mL e anti-DNA a 0,4 μg/mL (le concentrazioni finali di anticorpi sono rispettivamente 0,4 μg/mL e 0,2 μg/mL) (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Incubare la piastra al buio a 4 °C durante la notte.</li>
</ol>9. Aggiunta degli anticorpi secondari
<ol><li>Risciacquare ogni pozzetto quattro volte con 100 μL di PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare 10 μL di PBS nel pozzetto.</li>
	<li>Aggiungere 10 μL della soluzione anticorpale secondaria da 4 μg/mL preparata in BSA al 6% in PBS (la concentrazione finale è 2 μg/ml). Utilizzare anticorpi isotipo-specifici (IgG1 anti-topo e IgM anti-topo) coniugati a fluorocromi come Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 555 (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 1 ora.</li>
	<li>Risciacquare ogni pozzetto quattro volte con 100 μL di PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare 50 μL di PBS nel pozzetto.</li>
	<li>Sigillare la piastra con una pellicola sigillante adesiva (vedi Tabella dei materiali) e conservarla al buio a 4 °C. L'imaging deve essere eseguito entro 2 settimane.</li>
</ol>10. Imaging
NOTA: l'imaging deve essere eseguito con un microscopio a campo largo automatizzato; Il microscopio deve essere dotato di uno stadio motore fornito con comandi per visualizzare automaticamente le singole aree della lastra.
<ol><li>Controllare le impostazioni di messa a fuoco automatica nelle aree angolari della piastra (pozzetti A1, A24, P24, P1) e al centro. NOTA: per l'imaging, si consiglia di utilizzare un obiettivo a breve distanza di lavoro 20x (vedere Tabella dei materiali) con la massima apertura numerica possibile.</li>
	<li>In base all'intensità degli istogrammi generati dal software di imaging in modalità live view, selezionare un tempo di esposizione sufficientemente lungo per i singoli canali di fluorescenza in modo che l'immagine risultante non sia sovrasatura.</li>
	<li>Impostare il numero appropriato di piani per l'imaging sull'asse z. NOTA: il campo visivo con ingrandimento 20x è abbastanza grande da non consentire a tutte le celle di trovarsi sullo stesso piano di messa a fuoco, è necessario eseguire la sezione Z per visualizzare tutte le celle nel piano di messa a fuoco corretto. Di solito, cinque aerei sono sufficienti. A seconda della disponibilità di spazio su disco, è possibile salvare singoli z-stack o solo proiezioni di intensità massima. L'analisi delle immagini mostrata nella sezione dei risultati rappresentativi si basa su proiezioni di massima intensità.</li>
	<li>Selezionare il numero appropriato di campi visivi da visualizzare per ogni riotto. NOTA: A seconda della confluenza, è possibile visualizzare circa 60-300 celle in un campo visivo. Tipicamente, per le cellule HeLa con una confluenza del 60% -90%, l'imaging di cinque campi visivi consentirà di analizzare da 500 cellule a oltre 1.000 cellule.</li>
	<li>Seleziona i pozzi da fotografare e inizia l'imaging.</li>
</ol>11. Analisi quantitativa delle immagini
NOTA: L'analisi quantitativa delle immagini acquisite può essere eseguita utilizzando un software open source come Cell Profiler15. Per il presente studio, l'analisi è stata eseguita utilizzando il software ScanR 3.0.0 (vedere la tabella dei materiali).
<ol><li>Avviare l'analisi eseguendo la correzione dello sfondo per tutte le immagini provenienti da tutti i canali di fluorescenza. A seconda delle dimensioni degli oggetti analizzati, selezionare la dimensione del filtro appropriata: 80 pixel per i nuclei cellulari e 4 pixel per le macchie di BrdU e mtDNA.</li>
	<li>Inizia a segmentare l'immagine creando una maschera dell'oggetto principale in base al rapporto tra l'intensità del segnale di fluorescenza e lo sfondo per il canale corrispondente ai nuclei cellulari.</li>
	<li>Creare maschere per i sotto-oggetti che rappresentano rispettivamente le macchie di BrdU e mtDNA, utilizzando i canali di fluorescenza appropriati per le strutture date. NOTA: Ogni oggetto secondario è assegnato all'oggetto principale più vicino (nucleo cellulare).</li>
	<li>Impostare i parametri da misurare durante l'analisi e misurare l'intensità dei singoli pixel all'interno di ciascuna maschera per tutti i canali di fluorescenza. NOTA: È anche necessario calcolare il numero di sotto-oggetti assegnati a un dato nucleo cellulare e l'area di ciascun sotto-oggetto.</li>
	<li>Definire i parametri derivati da calcolare in base ai dati ottenuti. Per ottenere le intensità totali di fluorescenza per il canale BrdU o mtDNA, sommare le intensità di tutti i sotto-oggetti assegnati a un dato nucleo cellulare. Per ottenere l'intensità media di fluorescenza, dividere l'intensità totale della fluorescenza per la somma dell'area dei sotto-oggetti assegnati a un dato nucleo cellulare. NOTA: Per garantire che il sotto-oggetto creato (BrdU o macchia di mtDNA) si trovi effettivamente nei mitocondri, è necessario controllarli in base all'intensità della fluorescenza del colorante di tracciamento dei mitocondri.</li>
	<li>Eseguire ulteriori analisi dei dati ottenuti con il software ScanR utilizzando il software statistico R 4.2.216 insieme ai seguenti pacchetti: dplyr 17, data.table 18, ggplot219 e ggpubr 20. Questo passaggio è facoltativo.</li>
</ol>

Quantificazione ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del mtDNA

<ol>
	<li>Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+respiration+and+ATP+synthesis+in+mammalian+mitochondria+and+cells.">Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells.</a> The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+basis+and+metabolic+interplay+of+redox+regulation).">Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation).</a> Redox Biology. 26, 101284 (2019).</li><li>Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Ca2++homeostasis:+Mechanism,+role,+and+tissue+specificities.">Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).</li><li>Shadel, G. S., Horvath, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ROS+signaling+in+organismal+homeostasis.">Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis.</a> Cell. 163 (3), 560-569 (2015).</li><li>Mart&#237;nez-Reyes, I., Chandel, N. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Storicamente, l'etichettatura del DNA mediante incorporazione BrdU e rilevamento di anticorpi è stata utilizzata nella replicazione del DNA nucleare e nella ricerca sul ciclo cellulare 14,27,28. Finora, tutti i protocolli per rilevare il DNA marcato con BrdU hanno incluso una fase di denaturazione del DNA (acida o termica) o digestione enzimatica (DNasi o proteinasi) per consentire l'esposizione all'epitopo e facilitare la pene...

Per la maggior parte delle cellule eucariotiche i mitocondri sono organelli essenziali, in quanto svolgono un ruolo cruciale in numerosi processi cellulari. Innanzitutto, i mitocondri sono i principali fornitori di energia delle cellule1. I mitocondri sono anche coinvolti nella regolazione dell'omeostasi cellulare (ad esempio, redox intracellulare2 e l'equilibrio del calcio3), segnalazione cellulare4,5, apoptosi6, sintesi di diversi composti biochimici 7,8 e risposta immunitaria innata9. La disfunzione mitocondriale è associata a vari stati patologici e malattie umane10.
Il funzionamento dei mitocondri dipende dall'informazione genetica situata in due genomi separati: il genoma nucleare e mitocondriale. Il genoma mitocondriale codifica per un piccolo numero di geni rispetto al genoma nucleare, ma tutti i geni codificati dal mtDNA sono essenziali per la vita umana. Il meccanismo proteico mitocondriale necessario per mantenere il mtDNA è codificato dall'nDNA. I componenti di base del replisoma mitocondriale, così come alcuni fattori di biogenesi mitocondriale, sono già stati identificati (rivisti nella ricerca precedente11,12). Tuttavia, i meccanismi di replicazione e mantenimento del DNA mitocondriale sono ancora lontani dall'essere compresi. A differenza dell'nDNA, il genoma mitocondriale esiste in più copie, il che fornisce un ulteriore strato per regolare l'espressione genica mitocondriale. Molto meno si sa attualmente sulla distribuzione e la segregazione del mtDNA all'interno degli organelli, in che misura questi processi sono regolati e, se lo sono, quali proteine sono coinvolte13. Il modello di segregazione è cruciale quando le cellule contengono una popolazione mista di mtDNA wild-type e mutato. La loro distribuzione ineguale può portare alla generazione di cellule con una quantità dannosa di mtDNA mutato.
Finora, i fattori proteici necessari per il mantenimento del mtDNA sono stati identificati principalmente con metodi biochimici, analisi bioinformatiche o attraverso studi associati alla malattia. In questo lavoro, al fine di garantire un'alta probabilità di identificare fattori che in precedenza sono sfuggiti all'identificazione, viene descritta una strategia diversa. Il metodo si basa sulla marcatura del mtDNA durante la replicazione o la riparazione con 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU), un analogo nucleosidico della timidina. BrdU è facilmente incorporato nei filamenti di DNA nascente durante la sintesi del DNA e, in generale, viene utilizzato per monitorare la replicazione del DNA nucleare14. Tuttavia, la procedura sviluppata qui è stata ottimizzata per rilevare BrdU incorporato nel mtDNA utilizzando l'immunofluorescenza degli anticorpi anti-BrdU.
L'approccio consente la quantificazione ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del mtDNA in cellule umane coltivate in vitro. È necessaria una strategia ad alto rendimento per condurre test in diverse condizioni sperimentali in un tempo relativamente breve; Pertanto, si propone nel protocollo di utilizzare un formato multi-pozzo per la coltura cellulare e la microscopia a fluorescenza automatizzata per l'imaging. Il protocollo include la trasfezione di cellule HeLa umane con una libreria di siRNA e il successivo monitoraggio della replicazione o riparazione del mtDNA utilizzando la marcatura metabolica del DNA appena sintetizzato con BrdU. Questo approccio è combinato con l'immunocolorazione del DNA con l'aiuto di anticorpi anti-DNA. Entrambi i parametri vengono analizzati utilizzando la microscopia quantitativa a fluorescenza. Inoltre, i mitocondri vengono visualizzati con un colorante specifico. Per dimostrare la specificità del protocollo, la colorazione BrdU è stata testata su cellule prive di mtDNA (cellule rho0), su cellule HeLa dopo il silenziamento di noti fattori di mantenimento del mtDNA e su cellule HeLa dopo trattamento con un inibitore della replicazione del mtDNA. I livelli di mtDNA sono stati misurati anche con un metodo indipendente, vale a dire qPCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,3&#8242;-Dideoxycytidine (ddC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384&#160; Well Cell Culture Microplates, black</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#781946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine (BrdU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002-1G</td>
			<td>Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 &#181;M BrdU solution for labeling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive sealing film</td>
			<td>Nerbe Plus</td>
			<td>04-095-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek 405 LS microplate washer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber Thoma</td>
			<td>Heinz Herenz</td>
			<td>REF:1080339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41965-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1635</td>
			<td>Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>#61014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 System</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red FM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M22426</td>
			<td>Mitochondria tracking dye&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multidrop Combi Reagent Dispenser</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51985-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca-R2 (C10600) CCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer Fw B2M (reference)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CAGGTACTCCAAAGATTCAGG&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer Fw GPI (reference gene)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GACCTTTACTACCCAGGAGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer Fw MT-ND1&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TAGCAGAGACCAACCGAACC&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer Fw POLG</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer Fw TFAM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer Fw TWNK</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCCATGTGACACTGGTCATT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer Rev B2M (reference)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GTCAACTTCAATGTCGGATGG&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer Rev GPI (reference gene)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AGTAGACAGGGCAACAAAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer Rev MT-ND1&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATGAAGAATAGGGCGAAGGG&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer Rev POLG</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer Rev TFAM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GGACTTCTGCCAGCATAATA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer Rev TWNK</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AACATTGTCTGCTTCCTGGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanR microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA Ctrl</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001810-10-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA POLG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>POLGHSS108223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA TFAM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>TFAMHSS144252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA TWNK</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10orf2HSS125597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction device</td>
			<td>NeoLab</td>
			<td>2-9335</td>
			<td>Suction device for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0931-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPlanSApo 20x 0.75 NA objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput image-based quantification of mitochondrial dna synthesis and distribution

La stragrande maggioranza dei processi cellulari richiede una fornitura continua di energia, il cui vettore più comune è la molecola di ATP. Le cellule eucariotiche producono la maggior parte del loro ATP nei mitocondri mediante fosforilazione ossidativa. I mitocondri sono organelli unici perché hanno il loro genoma che viene replicato e trasmesso alla prossima generazione di cellule. In contrasto con il genoma nucleare, ci sono più copie del genoma mitocondriale nella cellula. Lo studio dettagliato dei meccanismi responsabili della replicazione, riparazione e mantenimento del genoma mitocondriale è essenziale per comprendere il corretto funzionamento dei mitocondri e delle cellule intere sia in condizioni normali che di malattia. Qui viene presentato un metodo che consente la quantificazione ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale (mtDNA) in cellule umane coltivate in vitro . Questo approccio si basa sulla rilevazione in immunofluorescenza di molecole di DNA sintetizzate attivamente marcate mediante incorporazione di 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU) e sulla rilevazione simultanea di tutte le molecole di mtDNA con anticorpi anti-DNA. Inoltre, i mitocondri sono visualizzati con coloranti o anticorpi specifici. La coltura di cellule in un formato multi-pozzetto e l'utilizzo di un microscopio a fluorescenza automatizzato rendono più facile studiare la dinamica del mtDNA e la morfologia dei mitocondri in una varietà di condizioni sperimentali in un tempo relativamente breve.

For most eukaryotic cells mitochondria are essential organelles, as they play a crucial role in numerous cellular processes. First and foremost, mitochondria are the key energy suppliers of cells1. Mitochondria are also involved in regulating cellular homeostasis (for instance, intracellular redox2 and the calcium balance3), cell signaling4,5, apoptosis6, the synthesis of different biochemical compounds7,8, and the innate immune response9. Mitochondrial dysfunction is associated with various pathological states and human diseases10. 
The functioning of mitochondria depends on the genetic information located in two separate genomes: the nuclear and mitochondrial genomes. The mitochondrial genome encodes a small number of genes compared to the nuclear genome, but all the mtDNA-encoded genes are essential for human life. The mitochondrial protein machinery necessary to maintain the mtDNA is encoded by nDNA. The basic components of the mitochondrial replisome, as well as some mitochondrial biogenesis factors, have already been identified (reviewed in previous research11,12). However, mitochondrial DNA replication and maintenance mechanisms are still far from being understood. In contrast to nDNA, the mitochondrial genome exists in multiple copies, which provides an additional layer for regulating mitochondrial gene expression. Much less is currently known about the distribution and segregation of mtDNA within organelles, to what extent these processes are regulated, and if they are, which proteins are involved13. The segregation pattern is crucial when cells contain a mixed population of wild-type and mutated mtDNA. Their unequal distribution may lead to the generation of cells with a detrimental amount of mutated mtDNA.
So far, the protein factors necessary for mtDNA maintenance have been identified mainly by biochemical methods, bioinformatic analyses, or through disease-associated studies. In this work, in order to ensure a high chance of identifying factors that have previously escaped identification, a different strategy is described. The method is based on the labeling of mtDNA during replication or repair with 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU), a nucleoside analog of thymidine. BrdU is readily incorporated into nascent DNA strands during DNA synthesis and, in general, is used for monitoring the replication of nuclear DNA14. However, the procedure developed here has been optimized for detecting BrdU incorporated into mtDNA using the immunofluorescence of anti-BrdU antibodies.
The approach allows for the high-throughput quantification of mtDNA synthesis and distribution in human cells cultured in vitro. A high-throughput strategy is necessary to conduct tests under different experimental conditions in a relatively short time; therefore, it is proposed in the protocol to utilize a multi-well format for cell culturing and automated fluorescence microscopy for imaging. The protocol includes the transfection of human HeLa cells with an siRNA library and the subsequent monitoring of mtDNA replication or repair using the metabolic labeling of newly synthesized DNA with BrdU. This approach is combined with immunostaining of the DNA with the help of anti-DNA antibodies. Both parameters are analyzed using quantitative fluorescence microscopy. Additionally, mitochondria are visualized with a specific dye. To demonstrate the specificity of the protocol, BrdU staining was tested on cells devoid of mtDNA (rho0 cells), on HeLa cells upon the silencing of well-known mtDNA maintenance factors, and on HeLa cells after treatment with an mtDNA replication inhibitor. The mtDNA levels were also measured by an independent method, namely qPCR.

Autore in primo piano: Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale  

Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale

The protocol aims to identify proteins with dysfunction leads to changes in the number of mitochondrial DNA molecules. This research may also reveal the factors involving the distribution of mitochondrial DNA within the mitochondria. Mitochondrial replication and maintenance mechanisms are still not fully understood.Much less is known about regulating the distribution of mitochondrial genomes within organoids and the proteins involved in it. As a result, identifying and characterizing some new players will be of great importance. The main advantage of the technique is its high-throughput and high content protocol.We can simultaneously test many experimental conditions and measure various parameters during a single experiment. In genome-wide studies, the proposed protocol provides an opportunity to outline a global picture of how nuclear encoded genetic information regulates its mitochondrial counterpart. Additionally, it has the potential to identify proteins whose dysfunction causes mitochondrial DNA stress and activates the interferon response pathway.

Uno schema della procedura per lo studio ad alto rendimento della dinamica della sintesi e della distribuzione del mtDNA è mostrato nella Figura 1. L'uso di un formato di piastra multi-pozzetto consente l'analisi simultanea di molte condizioni sperimentali diverse, come il silenziamento di diversi geni utilizzando una libreria di siRNA. Le condizioni utilizzate per la marcatura di molecole di DNA di nuova sintesi con BrdU consentono la rilevazione di DNA marcato con BrdU nei mitocondri dell...

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Viene descritta una procedura per studiare la dinamica del metabolismo del DNA mitocondriale (mtDNA) nelle cellule utilizzando un formato di piastra multi-pozzetto e l'imaging automatizzato di immunofluorescenza per rilevare e quantificare la sintesi e la distribuzione del mtDNA. Questo può essere ulteriormente utilizzato per studiare gli effetti di vari inibitori, stress cellulari e silenziamento genico sul metabolismo del mtDNA.

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Il protocollo mira a identificare le proteine con disfunzione che porta a cambiamenti nel numero di molecole di DNA mitocondriale. Questa ricerca può anche rivelare i fattori che coinvolgono la distribuzione del DNA mitocondriale all'interno dei mitocondri. I meccanismi di replicazione e mantenimento mitocondriale non sono ancora completamente compresi.Molto meno si sa sulla regolazione della distribuzione dei genomi mitocondriali all'interno degli organoidi e delle proteine coinvolte in esso. Di conseguenza, identificare e caratterizzare alcuni nuovi giocatori sarà di grande importanza. Il principale vantaggio della tecnica è il suo protocollo ad alto rendimento e alto contenuto.Possiamo testare contemporaneamente molte condizioni sperimentali e misurare vari parametri durante un singolo esperimento. Negli studi sull'intero genoma, il protocollo proposto offre l'opportunità di delineare un quadro globale di come le informazioni genetiche codificate nucleari regolano la sua controparte mitocondriale. Inoltre, ha il potenziale per identificare le proteine la cui disfunzione causa stress del DNA mitocondriale e attiva la via di risposta dell'interferone.

high-throughput-image-based-quantification-mitochondrial-dna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

1.5K Views.  University of Warsaw. Il protocollo mira a identificare le proteine con disfunzione che porta a cambiamenti nel numero di molecole di DNA mitocondriale. Questa ricerca può anche rivelare i fattori che coinvolgono la distribuzione del DNA mitocondriale all'interno dei mitocondri. I meccanismi di replicazione e mantenimento mitocondriale non sono ancora completamente compresi.Molto meno si sa sulla regolazione della distribuzione dei genomi mitocondriali all'interno degli organoidi e delle proteine coinvolte...

Video: Autore in primo piano: Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale  

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells produce most of their ATP in the mitochondria by oxidative phosphorylation. Mitochondria are unique organelles because they have their own genome that is replicated and passed on to the next generation of cells. In contrast to the nuclear genome, there are multiple copies of the mitochondrial genome in the cell. The detailed study of the mechanisms responsible for the replication, repair, and maintenance of the mitochondrial genome is essential for understanding the proper functioning of mitochondria and whole cells under both normal and disease conditions. Here, a method that allows the high-throughput quantification of the synthesis and distribution of mitochondrial DNA (mtDNA) in human cells cultured in vitro is presented. This approach is based on the immunofluorescence detection of actively synthesized DNA molecules labeled by 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) incorporation and the concurrent detection of all the mtDNA molecules with anti-DNA antibodies. Additionally, the mitochondria are visualized with specific dyes or antibodies. The culturing of cells in a multi-well format and the utilization of an automated fluorescence microscope make it easier to study the dynamics of mtDNA and the morphology of mitochondria under a variety of experimental conditions in a relatively short time.

A procedure for studying the dynamics of mitochondrial DNA (mtDNA) metabolism in cells using a multi-well plate format and automated immunofluorescence imaging to detect and quantify mtDNA synthesis and distribution is described. This can be further used to investigate the effects of various inhibitors, cellular stresses, and gene silencing on mtDNA metabolism.

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Preparation of siRNA Mixture for Mitochondrial DNA Synthesis

To begin, prepare a 140 nano molar mix of small interfering RNA or siRNA by diluting the siRNA in optimum medium. Add the five microliters of the diluted mix to the wells of a black 384 well cell culture microplate. Prepare the appropriate amount of RNAiMAX transfection reagent solution in optimum medium and add 10 microliters to each well of the 384 well plate with a reagent dispenser.

Preparazione della miscela di siRNA per la sintesi del DNA mitocondriale

Cell Transfection and 5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine (BrdU) Incorporation in HeLa Cells

Cell Transfection and 5-Bromo-2&#039;-Deoxyuridine (BrdU) Incorporation in HeLa Cells  

To begin the cell transfection, add 20 microliters of the HeLa cell suspension to the 384-well plate wells containing diluted siRNA to seed 700 HeLa cells per well. After one hour of incubation at room temperature, place the well plate in an incubator for 72 hours at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. To incorporate BrdU in the transfected cells, add 10 microliters of 90-micromolar BrdU solution to each well after 56 hours of siRNA transfection.Incubate the cells for 16 hours at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. The specificity of BrdU incorporation into the mitochondrial DNA of HeLa cells was studied using rho0 cells lacking mitochondrial DNA.

Trasfezione cellulare e incorporazione di 5-Bromo-2&#39;-deossiuridina (BrdU) nelle cellule HeLa

5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine (BrdU) Labeling of Mitochondrial DNA in HeLa Cells

5-Bromo-2&#039;-Deoxyuridine (BrdU) Labeling of Mitochondrial DNA in HeLa Cells  

To begin the mitochondria labeling prepare a 20 micromolar solution of BrdU in DMEM with 10%fetal bovine serum or FBS. Then add the mitochondria tracking dye to adjust the final concentration to 1.1 micromolar. After 15 hours add 10 microliters of the mitochondria tracking dye solution to the HeLa cell suspension containing wells.Incubate the cells for one hour. The conditions used to label newly synthesized DNA molecules with BrdU allowed the detection of BrdU labeled DNA in the mitochondria of HeLa cells. The signal obtained with anti-BrdU antibodies was specific and only observed in cells treated with BrdU.Regardless of BrdU treatment no anti-BrdU or anti-DNA antibody signal was detected in the mitochondria of row zero cells. Quantifying the fluorescent signal from the anti-BrdU antibodies indicated that row zero cells treated with BrdU showed the same low level of fluorescence as the BrdU untreated cells, while the signal for the parental lines A549 and HeLa were 50 fold higher.

5-Bromo-2&#39;-deossiuridina (BrdU) marcatura del DNA mitocondriale nelle cellule HeLa

HeLa Cell Fixation with Hoechst 33342 and Blocking

To begin the HeLa cell fixation, rinse the HeLa cell-containing 384-well plate two times with 100 microliters of PBS using the microplate washer. Leave 25 microliters of PBS in the well after the second wash and add 25 microliters of an 8%formaldehyde solution. Incubate the plate in the dark at room temperature for 30 minutes.Then, rinse each well four times with 100 microliters of PBS and leave 25 microliters of PBS in the well after the last wash. Add 25 microliters of 6%bovine serum albumin, or BSA, in PBS to each well and incubate the plate in the dark for 30 minutes.

Fissazione delle cellule HeLa con Hoechst 33342 e blocco

Addition of Primary and Secondary Antibodies to the Transfected HeLa Cells to Monitor the mtDNA Distribution

To begin the addition of the primary antibody, aspirate the bovine serum albumin or BSA from the fixed and blocked transfected HeLa cells leaving 10 microliters of BSA solution in the well. Then add 10 microliters of the primary antibody solution prepared in 3%BSA in PBS and incubate the plate in the dark at four degrees Celsius overnight. After the incubation, rinse each well four times with 100 microliters of PBS, leaving 10 microliters after the last wash.Next, add 10 microliters of secondary antibody solution to the 384 well plate. Use isotype specific antibodies conjugated to fluorochromes, such as Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 555. After incubating the plate in the dark for one hour, rinse each well four times with 100 microliters of PBS and leave 50 microliters of PBS in the well after the last wash.The use of anti-DNA antibodies allowed the monitoring of the mitochondrial DNA distribution in the cell under the given experimental conditions. The downregulation of mitochondrial transcription factor A TFAM led to drastic changes in the mitochondrial DNA distribution with fewer mitochondrial DNA spots than in control cells. Quantifying the mean fluorescent signal from the anti-DNA antibody showed a several fold increase upon TFAM silencing compared to the other conditions tested.

Aggiunta di anticorpi primari e secondari alle cellule HeLa trasfettate per monitorare la distribuzione del mtDNA

Quantitative Image Analysis to Measure the mtDNA and Gene Expression Levels in the Transfected HeLa Cells

To begin the imaging of transfected HeLa cells select a sufficiently long exposure time for the individual fluorescence channels in live view mode based on the intensity histograms generated by the imaging software. Set the appropriate number of planes for imaging on the Z axis. Select the appropriate number of fields of view to display per well.To start the quantitative analysis of acquired images, perform background correction for all the images from all the fluorescence channels. Depending on the size of the analyzed objects, select the appropriate filter size. Next, start the image segmenting by creating a mask of the main object based on the ratio of the intensity of the fluorescent signal to the background for the channel corresponding to the cell nuclei.Create masks for the sub objects representing BrdU and mitochondrial DNA spots using the fluorescence channels appropriate for the given structures. Set the parameters and measure the intensity of the individual pixels within each mask for all the fluorescence channels. To obtain the total fluorescence intensities for the BrdU or mitochondrial DNA channel sum up the intensities of all the sub objects assigned to a given cell nucleus.To obtain the mean fluorescence intensity, divide the total fluorescence intensity by the sum of the area of the sub objects assigned to a given cell nucleus. The imaging results were verified by measuring the mitochondrial DNA and gene expression levels using quantitative real-time PCR. Treatment with dideoxycytidine or DDC resulted in a very strong decrease in the mitochondrial DNA levels.A weaker effect was observed in TFAM and TWINKLE helicase silencing, while the transfection of cells with mitochondrial DNA polymerase gamma or POLG siRNA had a modest effect on the mitochondrial DNA copy number. Quantifying the TFAM and TWINKLE helicase expression confirmed an efficient reduction in their mRNA expression to approximately 15 to 20%of the control levels. In POLG, the mRNA expression was reduced only to 30%which explains the unexpected modest effect on the mitochondrial DNA copy number.