Accendere il microscopio confocale a scansione laser e posizionare il vetrino sul supporto del vetrino. Per la visualizzazione e l'acquisizione delle immagini, selezionare l'obiettivo 20X. Dal software confocale, selezionare la modalità di scansione sequenziale per evitare la diafonia tra BODIPY 493/503 e DAPI.
Quindi eccitare il die BODIPY 493/503 utilizzando la linea laser argon a 488 nanometri e la colorazione DAPI utilizzando la linea laser a 405 nanometri. Impostare gli intervalli di emissione da 493 a 589 nanometri per BODIPY e da 410 a 464 nanometri per DAPI. Quindi, configurare le impostazioni del microscopio regolando le dimensioni dei fotogrammi, la velocità di scansione e la media che include il numero due volte la profondità di bit come 12 bit, la direzione come bidirezionale, lo zoom digitale dell'area di scansione meno uno e il foro stenopeico meno un'unità di area.
Regolare le impostazioni di guadagno e guadagno digitale. Assicurati che non ci siano pixel saturi come indicato dall'indicatore di intervallo. Dopo aver identificato accuratamente le goccioline lipidiche, acquisire l'immagine con i canali BODIPY e DAPI.
Per creare immagini ad ampia area, passa a un obiettivo soggettivo 10X. Quindi attivare la modalità di scansione delle tessere e configurarla per generare immagini a mosaico cinque per cinque. Per generare viste 3D e ortogonali, applicare una goccia di olio ad immersione sulla parte superiore del vetro di copertura e cambiare l'obiettivo con un obiettivo 40X.
Selezionare la modalità Z-stack. Regolare il piano Z per definire la prima e l'ultima posizione per l'acquisizione dell'immagine, garantendo uno spessore della fetta ottica di circa 0,5 micron per catturare tutte le goccioline a fuoco. Selezionate il modulo ortogonale e create viste ortogonali.
Acquisire immagini 3D selezionando il modulo 3D seguendo la modalità di rendering della trasparenza. Dopo l'acquisizione delle immagini, iniziare l'elaborazione e l'analisi delle immagini a piano singolo utilizzando CellProfiler. Carica le immagini in formato TIF facendo clic sulla modalità immagini nell'angolo in alto a sinistra dell'interfaccia di CellProfiler.
Utilizzare il modulo nomi e tipi per ordinare tra le immagini colorate di goccioline BODIPY e nuclei DAPI in base ai nomi dei file. Per l'analisi delle gocce lipidiche, utilizzare solo immagini colorate BODIPY. Avviare la costruzione della pipeline facendo clic su Regola moduli e selezionare il modulo da colore a grigio per convertire le immagini in scala di grigi.
Quindi, utilizzando il modulo identifica oggetti primari, definisci goccioline lipidiche tra 6 e 300 pixel e un fattore di correzione della soglia di uno per rilevare le goccioline lipidiche all'interno delle immagini in scala di grigi. Per misurare l'intensità dei pixel delle goccioline lipidiche identificate, aggiungere un modulo di intensità dell'oggetto di misura. Incorporare un modulo aggiuntivo di oggetti filtro per garantire che vengano quantificati solo i segnali più forti mentre i segnali meno intensi siano esclusi dall'analisi finale delle goccioline lipidiche.
Successivamente, per misurare le goccioline lipidiche correlate ai dati di output, aggiungere il modulo di forma delle dimensioni dell'oggetto di misura. Quindi aggiungi un modulo di contorni di sovrapposizione per sovrapporre la goccia identificata sull'immagine originale e quindi assicurarti che la segmentazione appaia accurata anche sull'immagine non elaborata. Una volta fatto, aggiungi un modulo di esportazione nel foglio di calcolo e fai clic sul pulsante analizza immagini nell'angolo in basso a sinistra.
Rispetto al controllo, gli animali alimentati con HFD presentavano un profilo dislipidemico pronunciato e un leggero aumento dei livelli di trigliceridi circolanti. Le immagini ad ampia area hanno rivelato un aumento delle goccioline lipidiche attraverso il fegato degli animali alimentati con HFD. L'analisi con CellProfiler ha rivelato un aumento del numero di goccioline lipidiche epatiche, un'aumentata intensità di fluorescenza BODIPY, un rapporto di area del 360% e diametri maggiori.
La distribuzione delle dimensioni negli animali alimentati con HFD ha rivelato un aumento delle goccioline lipidiche epatiche macro vescicolari di oltre nove micron e una riduzione delle microvescicole inferiori a tre micron.
