Questa ricerca è stata finanziata da fondi nazionali ed europei attraverso la Fondazione portoghese per la scienza e la tecnologia (FCT), il Fondo europeo di sviluppo regionale (FEDER) e il Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP / 04539/2020 (CIBB) e POCI-01-0145-FEDER-007440. Gli autori desiderano ringraziare il supporto di iLAB - Microscopy and Bioimaging Lab, una struttura della Facoltà di Medicina dell'Università di Coimbra e membro dell'infrastruttura nazionale PPBI-Portuguese Platform of BioImaging (POCI-01-0145-FEDER-022122), nonché il supporto di FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.

Tutte le procedure animali eseguite in questo studio sono state approvate dall'Istituto di Coimbra per la ricerca clinica e biomedica (iCBR) Animal Welfare Body (ORBEA, # 9/2018) e conformi alle direttive nazionali ed europee sulla cura degli animali e alle linee guida ARRIVE.
1. Progettazione sperimentale
<ol><li>Coppia di ratti Wistar maschi di 13 settimane in gabbie ventilate in condizioni ambientali controllate di temperatura (22 °C ± 1 °C), umidità (50%-60%) e luce (ciclo luce-buio 12 ore) e con accesso ad libitum all'acqua del rubinetto e al chow standard per roditori.</li>
	<li>Dopo un periodo di acclimatazione di 2 settimane, assegnare arbitrariamente i ratti in due gruppi.</li>
	<li>Alimentare i gruppi di controllo (CTRL, n = 6) e dieta ricca di grassi (HFD, n = 6) con chow standard e una dieta ricca di grassi (45% kcal / grasso), rispettivamente, per 24 settimane.</li>
	<li>Monitorare il peso corporeo (BW) settimanalmente. Registrare il consumo giornaliero di cibo e bevande per gabbia.</li>
</ol>2. Preparazione del campione di fegato
<ol><li>Dissezione epatica<ol><li>Preparare la pompa peristaltica: far passare il 70% di etanolo attraverso il tubo, collegare un ago da 27 G all'estremità di uscita del tubo e innescare il tubo con soluzione salina ghiacciata (4 °C) tamponata con fosfato (PBS, pH ~ 7,4) (ad esempio, 200 giri / min su una pompa peristaltica con tubo in silicio ID da 1,6 mm, mini set di gocciolamento IV). Regolare il peso corporeo (ad esempio, per un ratto di 100-150 g, utilizzare una portata di circa 10-12 ml / min).</li>
		<li>Anestetizzare il ratto mediante iniezione intraperitoneale utilizzando un protocollo di anestesia (la concentrazione finale di ketamina = 75 mg/kg e la concentrazione finale di medetomidina = 1 mg/kg). NOTA: Assicurarsi che il ratto sia completamente anestetizzato utilizzando il metodo di risposta al pizzico della punta.</li>
		<li>Posizionare il topo sul vassoio di dissezione.</li>
		<li>Disinfettare accuratamente la pelliccia con etanolo al 70% e asciugarla con un tovagliolo di carta.</li>
		<li>Usando le forbici, fai un'incisione a forma di "U" attraverso la pelle e taglia sotto il diaframma. Quindi, tagliare la gabbia toracica rostralmente sui bordi per esporre il cuore.</li>
		<li>Mentre il PBS 1x è in esecuzione, passare l'ago attraverso il ventricolo sinistro nell'aorta ascendente e morsetto. Quindi, l'atrio destro viene tagliato per consentire il drenaggio una volta iniziata la perfusione. NOTA: Il fegato dovrebbe iniziare a sbiancarsi quando il sangue viene sostituito con PBS.</li>
		<li>Usando forbici e pinze Dumont, rimuovere accuratamente il fegato e risciacquare con 1x PBS.</li>
		<li>Trasferire il fegato su una capsula di Petri e pesarlo.</li>
		<li>Utilizzando un bisturi, raccogliere campioni di tessuto epatico di 5 mm di spessore dal lato laterale (1 cm dal bordo) del lobo sinistro del fegato per il processo di incorporazione. NOTA Il tessuto rimanente può essere conservato a -80 °C per la conservazione a lungo termine.</li>
	</ol></li>
	<li>Incorporazione del tessuto epatico<ol><li>Preparare un contenitore di ghiaccio secco ed etichettare correttamente i criostampi con l'ID e l'orientamento del campione.</li>
		<li>Posizionare alcune gocce di matrice di crioincorporazione al centro del criomold per ottenere la temperatura di taglio ottimale (OCT).</li>
		<li>Assicurarsi che il campione di tessuto sia correttamente orientato per una sezione trasversale. NOTA: Assicurarsi che il lato che tocca la parte inferiore del criomold sia il lato che verrà sezionato per primo.</li>
		<li>Rilasciare con cautela più OCT sul criomold fino a quando non è completamente coperto. Cerca di evitare la formazione di bolle d'aria. Se necessario, con una pinza semplice, rimuovere eventuali bolle all'interno dello Pt.</li>
		<li>Posizionare rapidamente il criomold con il campione coperto di OCT in un contenitore di ghiaccio secco. NOTA: I tessuti possono essere conservati a -80 °C per 3 anni.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Sezionamento di tessuti congelati
<ol><li>Regolare la temperatura del criostato (camera: -21 °C; campione: -18 °C) e inserire una nuova lama sterile.</li>
	<li>Posizionare i campioni nel criostato per 30 minuti prima di consentire l'equilibrio della temperatura.</li>
	<li>Creare un singolo strato di OCT sul disco del campione per consentire l'adesione del campione. Lasciare congelare lo Strumento di personalizzazione di Office e montare il campione di tessuto nell'orientamento desiderato. NOTA: la superficie di taglio deve essere parallela alla lama. Per mantenere una buona adesione, posizionare l'estrattore di calore sulla parte superiore del campione. I passaggi precedenti possono anche essere eseguiti in un contenitore di ghiaccio secco con ghiaccio secco.</li>
	<li>Posizionare il campione nella testa del campione e tagliare la superficie del tessuto (alcune sezioni di campione di tessuto da 30 μm).</li>
	<li>Una volta che la regione di interesse è accessibile per il sezionamento, tagliare sezioni spesse 12 μm e posizionarle su vetrini da microscopio etichettati mantenuti a temperatura ambiente (RT). NOTA: per raccogliere la sezione, spostare lentamente il vetrino verso la sezione del tessuto. Ogni vetrino può raccogliere due sezioni di fegato.</li>
	<li>Lasciare asciugare i vetrini per 10 minuti a RT. NOTA: I vetrini possono essere conservati a -20 °C per 6-12 mesi o a -80 °C per un massimo di 3 anni.</li>
</ol>4. Colorazione BODIPY
<ol><li>Scongelare i vetrini in un sistema di colorazione dei vetrini a RT per 30 minuti.</li>
	<li>Lavare con 1x PBS (3x per 5 minuti ciascuno).</li>
	<li>Circondare la sezione con uno strato idrofobo usando una penna barriera.</li>
	<li>Preparare 500 μg/mL di BODIPY 493/503 soluzione madre: sciogliere 1 mg di BODIPY 493/503 in 2 mL di solvente (90% DMSO; 10% 1x PBS). Proteggere dalla luce. Sonicare in un bagno ad ultrasuoni per 1 ora (9,5-10 W) a 37 °C. NOTA: La soluzione può essere conservata a -20 °C per almeno 30 giorni.</li>
	<li>Preparare la soluzione colorante BODIPY (1 μg/ml) aggiungendo 2 μL di soluzione madre BODIPY 493/503 e 0,1 μL di soluzione madre DAPI (5 mg/ml) a 997,9 μL di 1x PBS.</li>
	<li>Incubare i vetrini (75 μL/vetrino) con BODIPY 493/503 (1 μg/mL) e DAPI (0,1 μg/mL) a RT per 40 minuti. NOTA: tenere le diapositive al buio da questo passaggio in poi.</li>
	<li>Lavare i vetrini con 1x PBS (3x per 5 minuti ciascuno).</li>
	<li>Montare i vetrini con vetrini utilizzando un mezzo di montaggio a fluorescenza, lasciarli asciugare per 30 minuti e sigillarli con lo smalto. NOTA: I vetrini possono essere conservati a 4 °C fino all'imaging.</li>
</ol>5. Quantificazione dei lipidi
<ol><li>Misurare i livelli sierici di colesterolo totale e TG utilizzando un metodo e un'apparecchiatura automatici e convalidati.</li>
	<li>Misurare i livelli di TG epatici utilizzando un kit di analisi colorimetrica dei trigliceridi (Table of Materials) secondo il protocollo del produttore.</li>
</ol>6. Acquisizione di immagini
<ol><li>Posizionare il vetrino sul supporto del vetrino del microscopio confocale a scansione laser.</li>
	<li>Per la visualizzazione e l'acquisizione delle immagini, utilizzare un microscopio confocale con obiettivo 20x (planimetria-apocromatica: 20x/0,8).</li>
	<li>Per evitare la diafonia tra BODIPY 493/503 e DAPI, utilizzare la modalità di scansione sequenziale (segnale migliore) sul software confocale.</li>
	<li>Emoziona il BODIPY 593/503 utilizzando la linea laser argon da 488 nm e il DAPI utilizzando la linea laser a 405 nm. Impostare gli intervalli di emissione a 493-589 nm per BODIPY 493/503 e a 410-464 nm per DAPI.</li>
	<li>Utilizzare le seguenti impostazioni: foro stenopeico: 1 UA, risoluzione: 1.024 pixel x 1.024 pixel, profondità di bit: 12, dimensione pixel: 0,415 μm, modalità bidirezionale, velocità di scansione: 7 (~ 1,58 μs/pixel per un obiettivo 20x), media lineare: 2x e zoom digitale: 1. NOTA: I suddetti parametri di scansione devono essere ottimizzati per ogni microscopio confocale e obiettivo utilizzato.</li>
	<li>Impostare il guadagno e il guadagno digitale in modo appropriato in modo che non vengano rilevati pixel saturi sull'indicatore di intervallo. NOTA: correggere il segnale di fondo regolando l'offset.</li>
	<li>Una volta identificati correttamente i LD, acquisire l'immagine con i canali BODIPY e DAPI. NOTA: Tutte le immagini devono essere acquisite nelle stesse condizioni (esposizione e impostazioni generali) per ogni canale colore.</li>
	<li>Per creare immagini ad ampia area (Figura 2), modificare l'obiettivo con obiettivo a10x (plan-neofluar: 10x/0.3).</li>
	<li>Seleziona la modalità Tile Scan e crea mosaici di 5 immagini per 5. NOTA: in questo lavoro, ogni riquadro aveva una sovrapposizione del 10% per unire in modo appropriato le tessere per l'analisi.</li>
	<li>Per creare viste 3D e ortogonali (Figura 3A), posizionare una goccia di olio ad immersione sulla parte superiore del vetro di copertura e modificare l'obiettivo con una lente obiettivo 40x (plan-neofluar: olio 40x/1,30).</li>
	<li>Selezionare la modalità Z-Stack e, regolando il piano Z, definire la prima e l'ultima posizione per l'acquisizione con una fetta ottica a uno spessore ottimale (~0,5 μm) per garantire che tutte le goccioline vengano catturate. NOTA: Per velocizzare l'acquisizione dell'immagine ed evitare lo sbiancamento, la fetta ottica può essere regolata su una dimensione non ottimale, garantendo almeno il 30% di sovracampionamento per una buona ricostruzione 3D.</li>
	<li>Selezionate il modulo Orto e create viste ortogonali.</li>
	<li>Acquisisci immagini 3D selezionando il modulo 3D seguendo la modalità di rendering della trasparenza con il software del microscopio confocale.</li>
</ol>7. Analisi delle immagini
<ol><li>Elaborare e analizzare le immagini single-plane (ingrandimento 20x) con CellProfiler (versione 4.2.5). NOTA: La pipeline utilizzata in questo lavoro è stata adattata da Adomshick et al.45.</li>
	<li>Fare clic sul modulo Immagini nell'angolo in alto a sinistra della finestra di CellProfiler e caricare le immagini come file .tiff.</li>
	<li>Utilizzare il modulo NamesAndTypes per ordinare tra immagini colorate BODIPY- (droplet) e DAPI- (nuclei) in base ai nomi dei file. Eseguire l'analisi LD solo con immagini colorate con BODIPY.</li>
	<li>Per avviare la costruzione della pipeline, fare clic su Regola moduli e selezionare il modulo ColorToGray per convertire le immagini in immagini in scala di grigi. NOTA: per identificare gli oggetti, sono necessarie immagini in scala di grigi.</li>
	<li>Identificare le goccioline utilizzando il modulo IdentifyPrimaryObjects utilizzando l'immagine in scala di grigi. NOTA: i parametri in questo modulo devono essere regolati per ottenere una buona identificazione LD. In questo lavoro, la definizione di LD con una dimensione compresa tra 6 pixel e 300 pixel e un fattore di correzione soglia di 1,0 ha portato all'identificazione più accurata.</li>
	<li>Per misurare l'intensità dei pixel delle goccioline lipidiche identificate, aggiungere un modulo MeasureObjectIntensity .</li>
	<li>Aggiungere un modulo FilterObjects aggiuntivo per garantire che vengano quantificati solo i segnali più forti mentre i segnali meno intensi siano esclusi dall'analisi finale delle goccioline lipidiche (intensità minima: 0,15; intensità massima: 1 unità arbitraria).</li>
	<li>Per misurare i LD correlati ai dati di output, aggiungere il modulo MeasureObjectSizeShape .</li>
	<li>Aggiungi un modulo OverlayOutlines a questo punto per sovrapporre la goccia identificata sull'immagine originale e, quindi, assicurati che la segmentazione appaia accurata anche sull'immagine non elaborata. NOTA: questo è un passaggio facoltativo (controllo qualità).</li>
	<li>Aggiungi un modulo ExportToSpreadsheet alla fine e fai clic sul pulsante Analizza immagini nell'angolo in basso a sinistra.</li>
</ol>8. Analisi statistica
<ol><li>Esprimere i risultati come media ± errore standard della media (S.E.M.) utilizzando qualsiasi applicazione software di analisi statistica. NOTA: In questo studio, il software GraphPad è stato utilizzato per l'analisi statistica.</li>
	<li>Analizzare la distribuzione dei valori utilizzando il test di Kolmogorov-Smirnov per valutare deviazioni significative dalla normalità. Analizzare i dati parametrici utilizzando il t-test spaiato dello studente. NOTA: valori di p < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.</li>
</ol>

Valutazione della steatosi epatica con la ricostruzione di goccioline lipidiche a fluorescenza 3D

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo basato sulla fluorescenza BODIPY 493/503 per la valutazione della LD mirava a sviluppare un nuovo approccio di imaging per la valutazione della steatosi epatica. Data la forte correlazione tra obesità e steatosi epatica, la dieta ricca di grassi in stile occidentale è stata utilizzata per stabilire un modello animale di steatosi epatica26. Un robusto aumento del contenuto di TG epatici è stato confermato da un kit di test colorimetrici quantitativi dei trigliceridi, che ha sug...

Le goccioline lipidiche (LD), classicamente viste come depositi di energia, sono organelli cellulari specializzati che mediano l'accumulo di lipidi e comprendono un nucleo lipidico neutro idrofobico, che contiene principalmente esteri di colesterolo e trigliceridi (TG), incapsulati da un monostrato fosfolipidico 1,2,3.
La biogenesi LD avviene nel reticolo endoplasmatico (ER), iniziando con la sintesi di triacilglicerolo (TAG) ed esteri sterolici. I lipidi neutri sono diffusi tra i lembi del doppio strato ER a basse concentrazioni, ma si fondono in lenti oleose che crescono e germogliano in goccioline quasi sferiche dalla membrana ER quando la loro concentrazione intracellulare aumenta4. Successivamente, le proteine del doppio strato ER e del citosol, in particolare la famiglia delle proteine perilipina (PLIN), traslocano sulle superfici delle LD per facilitare il germogliamentodi 5,6,7,8,9.
Attraverso la nuova sintesi degli acidi grassi e la fusione o la coalescenza delle LD, le LD crescono in diverse dimensioni. Di conseguenza, la dimensione e il numero di LD differiscono considerevolmente tra i diversi tipi di cellule. Piccole goccioline (300-800 nm di diametro), note come LD iniziali (iLD), possono essere formate da quasi tutte le cellule4. Più tardi nella formazione delle LD, la maggior parte delle cellule è in grado di convertire alcune iLD in LD più grandi che espandono (eLD >1 μm di diametro). Tuttavia, solo specifici tipi di cellule, come adipociti ed epatociti, hanno la capacità di formare LD giganti o sovradimensionati (fino a decine di micron di diametro)4,10.
Le LD svolgono un ruolo molto importante nella regolazione del metabolismo lipidico cellulare, sopprimendo la lipotossicità e prevenendo lo stress ER, la disfunzione mitocondriale e, infine, la morte cellulare causata dagli acidi grassi liberi (FA)11,12,13,14. Inoltre, le LD sono state anche implicate nella regolazione dell'espressione genica, nel sequestro delle proteine di replicazione virale e nel traffico e nella segnalazione di membrana15,16,17. Pertanto, l'errata regolazione della biogenesi della LD è un segno distintivo delle malattie croniche associate alla sindrome metabolica, all'obesità, al diabete mellito di tipo 2 (T2DM) e / o all'arteriosclerosi, per citarne solo alcuni18,19,20.
Il fegato, come hub metabolico, è principalmente responsabile del metabolismo lipidico immagazzinando ed elaborando i lipidi e, quindi, è costantemente minacciato dalla lipotossicità21. La steatosi epatica (HS) è una caratteristica comune di una serie di malattie epatiche progressive ed è caratterizzata da un eccessivo accumulo di lipidi intracellulari sotto forma di LD citosoliche che, in definitiva, possono portare a disfunzione metabolica epatica, infiammazione e forme avanzate di steatosi epatica non alcolica22,23,24,25. L'HS si verifica quando il tasso di ossidazione ed esportazione degli acidi grassi come trigliceridi all'interno delle lipoproteine a bassissima densità (VLDL) è inferiore al tasso di assorbimento degli acidi grassi epatici dal plasma e dalla sintesi de novo degli acidi grassi26. L'accumulo epatico di lipidi si presenta spesso in due forme - steatosi microvescicolare e macrovescicolare - e queste mostrano caratteristiche citoarchitettoniche distinte27. Tipicamente, la steatosi microvescicolare è caratterizzata dalla presenza di piccole LD disperse in tutto l'epatocita con il nucleo posto centralmente, mentre la steatosi macrovescicolare è caratterizzata dalla presenza di un unico grande LD che occupa la maggior parte dell'epatocita, spingendo il nucleo verso la periferia28,29. In particolare, questi due tipi di steatosi si trovano spesso insieme, e non è chiaro come questi due modelli LD influenzino la patogenesi della malattia, poiché le prove sono ancora incoerenti31,32,33,34. Tuttavia, tale tipo di analisi è spesso impiegato come "standard di riferimento" negli studi preclinici e clinici per comprendere il comportamento dinamico delle LD e caratterizzare la steatosi epatica 29,34,35,36.
Le biopsie epatiche, il gold standard per la diagnosi e la classificazione dell'HS, sono valutate di routine mediante analisi istologica dell'ematossilina e dell'eosina (H & E), dove le goccioline lipidiche sono valutate come vacuoli non colorati nelle sezioni epatiche colorate con H & E37. Sebbene accettabile per la valutazione della steatosi macrovescicolare, questo tipo di colorazione generalmente restringe la valutazione della steatosi microvescicolare38. I coloranti diazo liposolubili, come Oil Red O (ORO), sono classicamente combinati con la microscopia a campo chiaro per analizzare le riserve lipidiche intracellulari, ma questi hanno ancora una serie di svantaggi: (i) l'uso di etanolo o isopropanolo nel processo di colorazione, che spesso causa l'interruzione delle LD native e la fusione occasionale nonostante le cellule siano fissate39; ii) la natura dispendiosa in termini di tempo, in quanto la soluzione ORO richiede la dissoluzione e il filtraggio della polvere fresca a causa della limitata durata di conservazione, contribuendo così a risultati meno coerenti; (iii) e il fatto che ORO colora più di semplici goccioline lipidiche e spesso sovrastima la steatosi epatica38.
Di conseguenza, i fluorofori lipofili permeabili alle cellule, come il rosso del Nilo, sono stati utilizzati in campioni vivi o fissi per superare alcune delle limitazioni di cui sopra. Tuttavia, la natura non specifica della marcatura degli organelli lipidici cellulari restringe ripetutamente le valutazioni LD40. Inoltre, le proprietà spettrali del rosso Nilo variano a seconda della polarità dell'ambiente, che spesso può portare a spostamenti spettrali41.
La sonda fluorescente lipofila 1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (lunghezza d'onda di eccitazione: 480 nm; emissione massima: 515 nm; BODIPY 493/503) presenta caratteristiche di idrofobicità che ne consentono il rapido assorbimento da parte delle LD intracellulari, si accumula nel nucleo delle goccioline lipidiche e, successivamente, emette fluorescenza verde brillante12. A differenza del Nilo Red, BODIPY 493/503 è insensibile alla polarità ambientale e ha dimostrato di essere più selettivo, in quanto mostra un'elevata luminosità per l'imaging LD. Al fine di colorare LD neutri, questo colorante può essere utilizzato in cellule vive o fisse e accoppiato con successo con altri metodi di colorazione e / o etichettatura42. Un altro vantaggio del colorante è che richiede poco sforzo per essere inserito in una soluzione ed è stabile, eliminando così la necessità di prepararlo fresco per ogni esperimento42. Anche se la sonda BODIPY 493/503 è stata impiegata con successo per visualizzare la localizzazione e la dinamica delle LD nelle colture cellulari, alcuni rapporti hanno anche dimostrato l'uso affidabile di questo colorante come strumento di imaging LD in tessuti tra cui il muscolo del vasto laterale umano43, il muscolo soleo del ratto 42 e l'intestino del topo44.
Qui, proponiamo un protocollo ottimizzato basato su BODIPY 493/503 come approccio analitico alternativo per la valutazione del numero, dell'area e del diametro LD in campioni di fegato da un modello animale di steatosi epatica. Questa procedura copre la preparazione del campione di fegato, il sezionamento dei tessuti, le condizioni di colorazione, l'acquisizione di immagini e l'analisi dei dati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>D3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10191455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator CC</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>Used to design the figures</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic analyzer Hitachi 717</td>
			<td>Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany</td>
			<td>8177-30-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)</td>
			<td>Daido Sangyo Co., Ltd, Japon</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade</td>
			<td>Leica</td>
			<td>221052145</td>
			<td>Used in the cryostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Profiler version 4.2.5</td>
			<td>https://cellprofiler.org/releases/</td>
			<td>Used to analyse the acquired images</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Menzel-Glaser, Germany</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>D-8418</td>
			<td>Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic 
			and flammable. Vapors may cause 
			irritation. Manipulate in a fume 
			hood. Avoid direct contact with skin. 
			Wear rubber gloves, protective eye 
			goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice container (styrofoam cooler)</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A26742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish (H 25 mm, &#248; 
			150 mm)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>Used to weigh the liver after dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycergel</td>
			<td>DAKO Omnis</td>
			<td>S303023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software, version 9.3.1</td>
			<td>GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat diet</td>
			<td>Envigo, Barcelona, Spain</td>
			<td>MD.08811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Nimatek&#160; 100 mg/mL)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>791/01/14DFVPT</td>
			<td>Used at a final concentration of 75 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope&#160; (QUASAR detection unit; )</td>
			<td>Carl Zeiss, germany</td>
			<td>LSM 710 Axio Observer Z1 microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>1838 ESP / 020/01/07RFVPT</td>
			<td>Used at a final concentration of 1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 15 Sterile carbon steel scalpel 
			Blade</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)</td>
			<td>&#160;Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brushes</td>
			<td>Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X</td>
			<td>&#160;Used to handle cryosections</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (Minipuls 3)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>1004170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle, 125 mm (5&#34;), No. 3</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide staining system StainTray</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>M920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard diet</td>
			<td>&#160;Mucedola</td>
			<td>4RF21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Menzel-Glaser, Germany</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT mounting media</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglycerides colorimetric assay kit</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10010303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Bandelin Sonorex</td>
			<td>&#160;TK 52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors - 3 mm 
			cutting edge</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Black software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fluorescent-stained lipid droplets with 3d reconstruction for hepatic steatosis assessment

Le goccioline lipidiche (LD) sono organelli specializzati che mediano l'accumulo lipidico e svolgono un ruolo molto importante nel sopprimere la lipotossicità e prevenire le disfunzioni causate dagli acidi grassi liberi (FA). Il fegato, dato il suo ruolo critico nel metabolismo dei grassi del corpo, è costantemente minacciato dall'accumulo intracellulare di LD sotto forma di steatosi epatica sia microvescicolare che macrovescicolare. La caratterizzazione istologica delle LD si basa tipicamente su coloranti diazo liposolubili, come la colorazione Oil Red O (ORO), ma una serie di svantaggi ostacola costantemente l'uso di questa analisi con campioni di fegato. Più recentemente, i fluorofori lipofili 493/503 sono diventati popolari per visualizzare e localizzare le LD a causa del loro rapido assorbimento e accumulo nel nucleo delle goccioline lipidiche neutre. Anche se la maggior parte delle applicazioni sono ben descritte in colture cellulari, ci sono meno prove che dimostrano l'uso affidabile di sonde fluorofore lipofile come strumento di imaging LD in campioni di tessuto. Qui, proponiamo un protocollo ottimizzato basato su dipirrometene di boro (BODIPY) 493/503 per la valutazione delle LD in campioni di fegato da un modello animale di steatosi epatica indotta da dieta ricca di grassi (HFD). Questo protocollo copre la preparazione del campione di fegato, il sezionamento dei tessuti, la colorazione BODIPY 493/503, l'acquisizione delle immagini e l'analisi dei dati. Dimostriamo un aumento del numero, dell'intensità, del rapporto di area e del diametro delle LD epatiche durante l'alimentazione HFD. Utilizzando proiezioni ortogonali e ricostruzioni 3D, è stato possibile osservare l'intero contenuto di lipidi neutri nel nucleo LD, che apparivano come goccioline quasi sferiche. Inoltre, con il fluoroforo BODIPY 493/503, siamo stati in grado di distinguere microvescicole (1 μm < d ≤ 3 μm), vescicole intermedie (3 μm < d ≤ 9 μm) e macrovescicole (d > 9 μm), consentendo la corretta discriminazione della steatosi microvescicolare e macrovescicolare. Nel complesso, questo protocollo basato sulla fluorescenza BODIPY 493/503 è uno strumento affidabile e semplice per la caratterizzazione epatica della LD e può rappresentare un approccio complementare ai protocolli istologici classici.

Lipid droplets (LDs), classically viewed as energy depots, are specialized cellular organelles that mediate lipid storage, and they comprise a hydrophobic neutral lipid core, which mainly contains cholesterol esters and triglycerides (TGs), encapsulated by a phospholipid monolayer1,2,3.
LD biogenesis occurs in the endoplasmic reticulum (ER), starting with the synthesis of triacylglycerol (TAG) and sterol esters. Neutral lipids are diffused between the leaflets of the ER bilayer at low concentrations but coalesce into oil lenses that grow and bud into nearly spherical droplets from ER membrane when their intracellular concentration increases4. Subsequently, proteins from the ER bilayer and cytosol, particularly the perilipin (PLIN) protein family, translocate to the surfaces of the LDs to facilitate budding5,6,7,8,9.
Through new fatty acid synthesis and LD fusion or coalescence, LDs grow into different sizes. Accordingly, the size and number of LDs differ considerably across different cell types. Small droplets (300-800 nm diameter), which are known as initial LDs (iLDs), can be formed by nearly all cells4. Later in LD formation, most cells are able to convert some iLDs into larger ones-expanding LDs (eLDs &#62;1 &#181;m in diameter). Yet, just specific cell types, such as adipocytes and hepatocytes, have the capacity to form giant or supersized LDs (up to tens of microns in diameter)4,10.
LDs play a very important role in the regulation of cellular lipid metabolism, suppressing lipotoxicity, and preventing ER stress, mitochondrial dysfunction, and, ultimately, cell death caused by free fatty acids (FAs)11,12,13,14. Furthermore, LDs have also been implicated in the regulation of gene expression, viral replication protein sequestration, and membrane trafficking and signaling15,16,17. Therefore, the misregulation of LD biogenesis is a hallmark of chronic diseases associated with metabolic syndrome, obesity, type 2 diabetes mellitus (T2DM), and/or arteriosclerosis, to name just a few18,19,20.
The liver, as a metabolic hub, is mostly responsible for lipid metabolism by storing and processing lipids, and, therefore, it is constantly threatened by lipotoxicity21. Hepatic steatosis (HS) is a common feature of a series of progressive liver diseases and is characterized by excessive intracellular lipid accumulation in the form of cytosolic LDs that, ultimately, may lead to liver metabolic dysfunction, inflammation, and advanced forms of nonalcoholic fatty liver disease22,23,24,25. HS occurs when the rate of fatty acid oxidation and export as triglycerides within very low-density lipoproteins (VLDLs) is lower than the rate of hepatic fatty acid uptake from the plasma and de novo fatty acid synthesis26. The hepatic accumulation of lipids often occurs in two forms-microvesicular and macrovesicular steatosis-and these display distinct cytoarchitectonic characteristics27. Typically, microvesicular steatosis is characterized by the presence of small LDs dispersed throughout the hepatocyte with the nucleus placed centrally, whereas macrovesicular steatosis is characterized by the presence of a single large LD that occupies the greater part of the hepatocyte, pushing the nucleus to the periphery28,29. Notably, these two types of steatosis are often found together, and it remains unclear how these two LD patterns influence disease pathogenesis, as evidence is still inconsistent31,32,33,34. Yet, such type of analysis is often employed as a &#34;reference standard&#34; in preclinical and clinical studies to understand the dynamic behavior of LDs and characterize hepatic steatosis29,34,35,36.
Liver biopsies, the gold standard for diagnosing and grading HS, are routinely assessed by histological hematoxylin and eosin (H&#38;E) analysis, where lipid droplets are evaluated as unstained vacuoles in H&#38;E-stained liver sections37. While acceptable for macrovesicular steatosis evaluation, this type of staining generally narrows the assessment of microvesicular steatosis38. Lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO), are classically combined with brightfield microscopy to analyze intracellular lipid stores, but these still have a number of disadvantages: (i) the usage of ethanol or isopropanol in the staining process, which often causes the disruption of the native LDs and occasional fusion despite the cells being fixed39; (ii) the time-consuming nature, as ORO solution requires fresh powder dissolving and filtering due to the limited shelf life, thus contributing to less consistent results; (iii) and the fact that ORO stains more than just lipid droplets and often overestimates hepatic steatosis38.
Consequently, cell-permeable lipophilic fluorophores, such as Nile Red, have been used in either live or fixed samples to overcome some of the aforementioned limitations. However, the non-specific nature of cellular lipid organelle labeling repeatedly narrows LD assessments40. Moreover, the spectral properties of Nile Red vary according to the polarity of the environment, which can often lead to spectral shifts41.
The lipophilic fluorescent probe 1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (excitation wavelength: 480 nm; emission maximum: 515 nm; BODIPY 493/503) exhibits hydrophobicity characteristics that allow its rapid uptake by intracellular LDs, accumulates in the lipid droplet core, and, subsequently, emits bright green fluorescence12. Unlike Nile Red, BODIPY 493/503 is insensitive to the environment polarity and has been shown to be more selective, as it displays high brightness for LD imaging. In order to stain neutral LDs, this dye can be used in live or fixed cells and successfully coupled with other staining and/or labeling methods42. Another advantage of the dye is that it requires little effort to place into a solution and is stable, thus eliminating the need to freshly prepare it for each experiment42. Even though the BODIPY 493/503 probe has been successfully employed to visualize the localization and dynamics of LDs in cell cultures, some reports have also demonstrated the reliable use of this dye as an LD imaging tool in tissues including the human vastus lateralis muscle43, the rat soleus muscle42, and the mouse intestine44.
Herein, we propose an optimized BODIPY 493/503-based protocol as an alternative analytical approach for the evaluation of the LD number, area, and diameter in liver specimens from an animal model of hepatic steatosis. This procedure covers liver sample preparation, tissue sectioning, staining conditions, image acquisition, and data analysis.

Autore in primo piano: Analisi di goccioline lipidiche colorate con fluorescenza con ricostruzione 3D per la valutazione della steatosi epatica  

Analisi di goccioline lipidiche colorate con fluorescenza con ricostruzione 3D per la valutazione della steatosi epatica

This imaging approach allows the three-dimensional reconstruction of hepatic lipid droplet deposition and overcomes the main disadvantages of classic histological staining that narrowed the successful discrimination between micro and macrovesicular steatosis. The assessment of microvesicular steatosis is when gold-standard histological stainings are used, both and Oil Red, due to disruption and occasional fusion of native lipid droplets. The pro-BODIPY offers an alternative to the routine protocols for microvesicular hepatic steatosis assessment due to its right hydrophobicity for a fast uptake and effective tagging of lipid droplets, being not only insensitive to the environment polarity, but also extremely selective.This imaging approach encloses broader applications in combination with immunochemistry techniques, allowing the simultaneous detection of other subcellular antigens that may advance the study of lipid droplets'biogenesis and dynamics, underpinning micro and macrovesicular hepatic steatosis.

L'esecuzione di successo di questa tecnica dovrebbe comportare una chiara colorazione delle goccioline lipidiche per la caratterizzazione simultanea della morfologia LD (forma e densità del nucleo lipidico basata sulla ricostruzione 3D) insieme alla loro distribuzione spaziale, numero per area totale e dimensione media (valutata con la pipeline sopra descritta, Figura 1).
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Qui, dimostriamo un protocollo ottimizzato basato sulla fluorescenza BODIPY 493/503 per la caratterizzazione delle goccioline lipidiche nel tessuto epatico. Attraverso l'uso di proiezioni ortogonali e ricostruzioni 3D, il fluoroforo consente una discriminazione di successo tra steatosi microvescicolare e macrovescicolare e può rappresentare un approccio complementare ai protocolli istologici classici per la valutazione della steatosi epatica.

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

Questo approccio di imaging consente la ricostruzione tridimensionale della deposizione di goccioline lipidiche epatiche e supera i principali svantaggi della colorazione istologica classica che ha ridotto la discriminazione di successo tra steatosi micro e macrovescicolare. La valutazione della steatosi microvescicolare è quando vengono utilizzate colorazioni istologiche gold standard, sia che rosso olio, a causa della rottura e della fusione occasionale di goccioline lipidiche native. Il pro-BODIPY offre un'alternativa ai protocolli di routine per la valutazione della steatosi epatica microvescicolare grazie alla sua giusta idrofobicità per un rapido assorbimento e un'efficace marcatura delle goccioline lipidiche, essendo non solo insensibile alla polarità ambientale, ma anche estremamente selettivo.Questo approccio di imaging racchiude applicazioni più ampie in combinazione con tecniche di immunochimica, consentendo la rilevazione simultanea di altri antigeni subcellulari che possono far progredire lo studio della biogenesi e della dinamica delle goccioline lipidiche, alla base della steatosi epatica micro e macrovescicolare.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

3.0K Views.  University of Coimbra. Questo approccio di imaging consente la ricostruzione tridimensionale della deposizione di goccioline lipidiche epatiche e supera i principali svantaggi della colorazione istologica classica che ha ridotto la discriminazione di successo tra steatosi micro e macrovescicolare. La valutazione della steatosi microvescicolare è quando vengono utilizzate colorazioni istologiche gold standard, sia che rosso olio, a causa della rottura e della fusione occasionale di goccioline lipidiche native. Il p...

Video: Autore in primo piano: Analisi di goccioline lipidiche colorate con fluorescenza con ricostruzione 3D per la valutazione della steatosi epatica  

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing dysfunction caused by free fatty acids (FAs). The liver, given its critical role in the body's fat metabolism, is persistently threatened by the intracellular accumulation of LDs in the form of both microvesicular and macrovesicular hepatic steatosis. The histologic characterization of LDs is typically based on lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO) staining, but a number of disadvantages consistently hamper the use of this analysis with liver specimens. More recently, lipophilic fluorophores 493/503 have become popular for visualizing and locating LDs due to their rapid uptake and accumulation into the neutral lipid droplet core. Even though most applications are well-described in cell cultures, there is less evidence demonstrating the reliable use of lipophilic fluorophore probes as an LD imaging tool in tissue samples. Herein, we propose an optimized boron dipyrromethene (BODIPY) 493/503-based protocol for the evaluation of LDs in liver specimens from an animal model of high-fat diet (HFD)-induced hepatic steatosis. This protocol covers liver sample preparation, tissue sectioning, BODIPY 493/503 staining, image acquisition, and data analysis. We demonstrate an increased number, intensity, area ratio, and diameter of hepatic LDs upon HFD feeding. Using orthogonal projections and 3D reconstructions, it was possible to observe the full content of neutral lipids in the LD core, which appeared as nearly spherical droplets. Moreover, with the fluorophore BODIPY 493/503, we were able to distinguish microvesicles (1 &#181;m &lt; d &#8804; 3 &#181;m), intermediate vesicles (3 &#181;m &lt; d &#8804; 9 &#181;m), and macrovesicles (d &gt; 9 &#181;m), allowing the successful discrimination of microvesicular and macrovesicular steatosis. Overall, this BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol is a reliable and simple tool for hepatic LD characterization and may represent a complementary approach to the classical histological protocols.

Herein, we demonstrate an optimized BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol for lipid droplet characterization in liver tissue. Through the use of orthogonal projections and 3D reconstructions, the fluorophore allows for successful discrimination between microvesicular and macrovesicular steatosis and may represent a complementary approach to the classical histological protocols for hepatic steatosis assessment.

Ricerca

Biochimica

Frozen Liver Tissue Sectioning and BODIPY Staining of Lipid Droplets

Turn on the cryostat and cut 12-micron-thick sections of the frozen liver tissue collected from a rat. Place the sections onto the labeled microscope slides at room temperature. For BODIPY staining, wash the tissue sections thrice with PBS for five minutes each.After the last wash, circle the sections on the slide with a hydrophobic layer using a barrier pen. Prepare a staining solution containing BODIPY 493/503 and DAPI. Then, pipette 75 microliters of the solution onto each slide.Incubate the slides at room temperature for 40 minutes in the dark. Following incubation, wash the slides thrice with PBS for five minutes each. Then, using a fluorescence mounting medium, carefully mount cover slips on each slide.Allow the slides to dry for 30 minutes before sealing the edges with nail polish.

Sezionamento del tessuto epatico congelato e colorazione BODIPY delle goccioline lipidiche

Image Acquisition of Lipid Droplets and Analysis

Turn on the laser scanning confocal microscope and place the slide on the slide holder. For image visualization and acquisition, select the 20X objective lens. From the confocal software, select sequential scan mode to avoid crosstalk between the BODIPY 493/503 and DAPI.Then excite the BODIPY 493/503 die using the 488 nanometer argon laser line and the DAPI stain using the 405 nanometer laser line. Set the emission ranges at 493 to 589 nanometers for BODIPY and 410 to 464 nanometers for DAPI. Next, configure the microscope settings by adjusting frame sizes, scan speed, and averaging which includes number two times bit depth as 12 bits, direction as bidirectional, scan area digital zoom minus one, and pinhole minus one area unit.Adjust the gain and digital gain settings. Ensure there are no saturated pixels as indicated by the range indicator. After accurately identifying the lipid droplets, acquire the image with the BODIPY and DAPI channels.To create wide area images, switch to a 10X subjective lens. Then activate tile scan mode and configure it to generate five by five mosaic images. To generate 3D and orthogonal views, apply a drop of immersion oil on the top of the cover glass and change the objective lens to a 40X lens.Select the Z-stack mode. Adjust the Z-plane to define the first and last positions for image capture, ensuring an optical slice thickness of approximately 0.5 microns to capture all droplets in focus. Select the ortho module and create orthogonal views.Acquire 3D images by selecting the 3D module following transparency rendering mode. After image acquisition, begin processing and analyzing single plane images using CellProfiler. Upload the images in TIF format by clicking on the images mode in the top left corner of the CellProfiler interface.Use the names and types module to sort between BODIPY droplet and DAPI nuclei stained images based on the filenames. For lipid droplet analysis, use only BODIPY stained images. Initiate pipeline construction by clicking on adjust modules and select the color to gray module to convert the images into gray scale.Then using identify primary objects module, define lipid droplets between 6 to 300 pixels and a threshold correction factor of one to detect lipid droplets within the gray scale images. To measure the pixel intensity of the identified lipid droplets, add a measure object intensity module. Incorporate an additional filter objects module to ensure that only the strongest signals are quantified while less intense signals are excluded from the final lipid droplet analysis.Next, to measure the lipid droplets related to the output data, add the measure object size shape module. Then add an overlay outlines module to overlay the identified droplet on the original image and thus ensure that the segmentation looks accurate on the unprocessed image as well. Once done, add an export to spreadsheet module and click on the analyze images button from the bottom left corner.Compared to the control, HFD-fed animals presented a pronounced dyslipidemic profile and subtle increase in circulating triglycerides levels. Wide area images revealed increased lipid droplets across the livers of HFD-fed animals. Analysis with CellProfiler revealed an increased number of hepatic lipid droplets, augmented BODIPY fluorescence intensity, 360%area ratio, and larger diameters.Size distribution in HFD-fed animals revealed an increase in macro vesicular hepatic lipid droplets of more than nine microns and a reduction in microvesicles of less than three microns.