Per eseguire il southern blotting, inizia tagliando una membrana di nylon in un segmento di dimensioni 10 per 12 centimetri. Fai una tacca nella stessa posizione del gel. Attivare la membrana immergendola in acqua distillata, seguita da tampone citrato salino di sodio 20X.
Posizionare uno stoppino di carta da filtro su un doppio vassoio rovesciato, impostato in modo tale che le estremità tocchino la base del vassoio esterno. Posizionare il gel sulla carta da filtro. Quindi posizionare la membrana di nylon attivata sopra il gel, assicurandosi che le tacche si sovrappongano.
Rimuovere eventuali bolle d'aria con una bacchetta di vetro. Posizionare un mucchio di due centimetri di carta da filtro di cellulosa di dimensioni 9,5 per 11,5 centimetri e un altro mucchio di sei centimetri di carta da filtro normale. Posiziona un peso sopra la configurazione per un'equa distribuzione del peso.
Riempire il vassoio esterno con tampone citrato salino di sodio 20X e lasciarlo durante la notte per un trasferimento efficiente. Dopo il trasferimento verso sud, fissare il DNA trasferito sulla membrana mediante reticolazione UV su un transilluminatore UV. Lavare la membrana due volte con 25 millilitri di tampone citrato salino di sodio 2X.
Per eseguire l'ibridazione, incubare la membrana in 10 millilitri del tampone pre-ibridazione preriscaldato. Agitare delicatamente la membrana manualmente a intervalli frequenti. Quindi incubare la macchia in 10 millilitri di tampone di ibridazione a 42 gradi Celsius per tre ore con delicata agitazione.
Lavare l'asciugamano due volte in 25 millilitri di tampone rigoroso per 10 minuti a temperatura ambiente con delicata agitazione. Ora lavare la macchia due volte in 25 millilitri di tampone rigoroso preriscaldato a 50 gradi Celsius per 15 minuti con delicata agitazione. Risciacquare con 15 millilitri di tampone di lavaggio per cinque minuti agitando delicatamente a temperatura ambiente.
Incubare la membrana in 10 millilitri di soluzione bloccante appena preparata per 30 minuti a temperatura ambiente con delicata agitazione. Quindi metterlo in 10 millilitri di anti-digossigenina coniugato con una soluzione di lavoro di fosfatasi alcalina. Lavare l'asciugamano due volte nel tampone di lavaggio a temperatura ambiente per 15 minuti.
Ora incubare in 10 millilitri di tampone di rilevamento per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il tampone in eccesso, posizionare la membrana su un foglio di acetato con il lato del DNA rivolto verso l'alto. Aggiungere circa uno a 1,5 millilitri di soluzione di substrato a goccia sulla membrana.
Posizionare immediatamente un altro foglio di acetato su di esso e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Spremere la soluzione di substrato in eccesso prima dell'imaging. Utilizzando un sistema di imaging della documentazione su gel, raccogliere più immagini insature in diversi punti temporali per l'analisi.
Dopo la macchia meridionale e l'ibridazione, i frammenti di restrizione dei telomeri erano chiaramente visibili, indicati da uno striscio.
